Diese Arbeit wurde unterstützt von der Universität Aix-Marseille und CNRS und finanziert durch einen Zuschuss von Pfizer Laboratorien.

Alle Verfahren wurden unter strikter Einhaltung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft für die Pflege und Verwendung von Labortieren (86/609/EWG und 2010/63/UE) und unter einer Lizenz gewährt, D. Becquet (Préfecture des Bouches-du-Rhône, Genehmigung Nr. 13-002) durchgeführt.
1. Probe Design
<ol><li>
Mit der primären Sequenz des LncRNA von Interesse, generieren Sie die Sekundärstruktur auf der "RNAstructure Webserver"5. Hinweis: Auf dieser Seite können verschiedene Algorithmen verwendet werden. Die drei Vorhersage-Tools, die die besten Ergebnisse zu geben, denn die Sonde Designs sind: "Fold" (niedrigste freie Energiestruktur), "MaxExpect" (sehr wahrscheinlich Basenpaare) und "Probnot" (wahrscheinlich Basenpaare, einschließlich der Pseudoknots). Diese drei Analysen können durchgeführt und verglichen werden. Anderen Webservern, wie die Wiener RNA Websuite7, können auch verwendet werden.<ol>
<li>Wählen Sie die Regionen, die eine geringe Wahrscheinlichkeit der internen Basenpaarung anzeigen und Gegenstrang Oligonukleotid Sonden von 25 Basen mit einer starken Affinität für diese Regionen zu entwerfen. Hinweis: Der GC Inhalt diese Sonden sollte zwischen 40 und 60 % bestehen. Mit einer Ausrichtung Suchwerkzeug (Blast), stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Gegenstrang Oligonukleotid Sonden Nukleotidsequenzen in anderen RNA ausgedrückt in der ausgewählten zellensystem nicht kennen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Design auch eine unspezifische DNA-Oligonukleotid Sonde, von 25 Basen die weder Affinität für die LncRNA von Interesse, noch für andere RNA-Sequenzen im Genom der Interesse zeigt.</li>
	<li>Bestellen Sie die Sonden mit Biotin am 3'-Ende. Hinweis: Um die sterische Behinderung zu reduzieren, muss der Abstand zwischen Oligonukleotid und Biotin mit einem Triethyleneglycerol-Abstandhalter erhöht werden. Für ein optimales Ergebnis und die Spezifität der Ergebnisse des Pull-Down beurteilen zu können, es wird empfohlen, 3 verschiedene Design Gegenstrang Oligonukleotid Sonden und dann experimentell ihre Effizienz zu vergleichen.</li>
</ol>2. Vernetzung
<ol><li>
Kultivierten Zellen Vernetzung
	<ol>
<li>Kultur der GH4C1 Sommatolactotroph Hypophysen Zellen in Hams F10 Medium mit 15 % Pferd Serum und 2 % fetalen Kälberserum ergänzt. Wachsen Sie die Zellen bis zum Zusammenfluss in 78,5 cm2 Kultur Platten. Dies entspricht ca. 1 x 107 Zellen.</li>
		<li>Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus einem konfluierende GH4C1 78,5 cm2 Kultur Teller, dann Spülen mit 1 x die mittlere Lautstärke von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</li>
		<li>Befestigen Sie die Zellen mit einer 1 % igen Paraformaldehyd Lösung mit PBS-Puffer (10 mL für eine 78,5 cm2 Gerichte); Diese Lösung muss von einer 4 % Paraformaldehyd Vorratslösung frisch zubereitet werden. Vernetzen Sie unter Agitation für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Achtung: Paraformaldehyd (PFA) ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden.</li>
		<li>Paraformaldehyd-Aktion zu stillen, durch Hinzufügen von 1/10 Volumen von Glycin 1,25 M (1 mL pro 10 mL der Lösung Paraformaldehyd); 5 min bei RT agitieren</li>
		<li>Verwerfen Sie die Medien durch streben und spülen zwei Zeiten (5 min) mit 1 X das mittlere Volumen der PBS.</li>
		<li>Fügen Sie ein Volumen von PBS entspricht 1/10 des Volumens der Medien, sammeln Zellen mit einer Zelle Schaber und übertragen Sie dann zu einem Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Mit 510 g bei 4 ° C für 5 min drehen.</li>
		<li>Entfernen Sie so viel überstand wie möglich.</li>
		<li>Speichern von Pellets auf unbestimmte Zeit bei Bedarf bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vernetzung von Gewebe
	<ol>
<li>Setzen Sie 5 mg des frisch gewonnenen Maus Hypophyse Gewebe in einer Lösung von 1 % Paraformaldehyd in PBS (ca. 10 x das Volumen des Gewebes) verdünnt, agitieren für 10 min bei RT</li>
		<li>Stillen Sie die Paraformaldehyd Aktion durch Hinzufügen einer 1,25 M Glycin-Lösung (1 mL pro 10 mL der Lösung Paraformaldehyd) zu und rühren Sie 5 min bei RT</li>
		<li>Verwerfen Sie die Medien durch Absaugen und spülen Sie zweimal mit PBS (ca. 10 x das Volumen des Gewebes). Entfernen Sie so viel überstand wie möglich.</li>
		<li>Speichern der vernetzten Gewebes auf unbestimmte Zeit bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Zellen oder Gewebe Lyse
<ol><li>Bereiten Sie die Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 10 mM EDTA, 1 % SDS ergänzt mit 200 U/mL einer RNAse-Inhibitor-Lösung und einem Cocktail von Proteasen Inhibitor 5 µL/mL).</li>
	<li>Um lysierten Proben ohne vorherige Auftauen zu erhalten, wieder aussetzen der Zelle Pellets oder vernetzten Gewebe mit dieser Puffer (ca. 1 mL pro 100 mg Pellet Zelle oder eines Gewebes). Ein Zelle Pellet 1 x 10-7 -Zellen gewonnenen ergeben sich eine lysierten Probe enthält etwa 20 mg Protein. Hinweis: Je nach Gewebe verwendet, sollte ein Schritt von mechanischen Störungen hinzugefügt werden. In diesem Fall ist es wichtig, die Erwärmung der Proben während diesen zusätzlichen Schritt zu vermeiden.</li>
</ol>(4) Beschallung
<ol><li>
Optimierung der Beschallung Bedingungen
	<ol>
<li>Programm der sonikator mit 2 bis 5 Reihe von 30 s ein und 30 s aus.</li>
		<li>Durchführen Sie Tests, um Beschallung Bedingungen auf verdünnten lysierten Proben (Verdünnungsfaktor ½ oder ¼ entspricht ungefähr 10 oder 5 mg Protein) zu optimieren. Ort verdünnt lysierten Proben im Wasserbad 4 ° C und starten Sie die Anwendung von Ultraschall-Serie.</li>
		<li>RNAs zu reinigen, mit einem RNA-Reinigung-Kit oder mit einer RNA-Isolierung-Reagenz (z.B.Trizol).</li>
		<li>Laden Sie die Gesamtheit der gereinigten RNA auf einem 1 % Agarose-Gelelektrophorese in TBE-Puffer, überprüfen Sie die Länge der RNA-Fragmente. Diese Länge sollte zwischen 200 und 800 bp liegen. Hinweis: Abhängig von der RNA-Fragment-Größe kann die Gegenstrang Oligonukleotid Sonden Effizienz variieren. Es wird dann empfohlen, um die Effizienz der Sonden unter verschiedenen Bedingungen der Zellulite überprüfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beschallung der lysierten Proben
	<ol>
<li>Ort lysiert Proben entsprechend 20 mg von Proteinen (nach Schritt 3.2 erhalten) in die 4 ° C Wasserbad und die Beschallung-Serie zu starten, wie in Schritt 4.1 optimiert.</li>
		<li>Unmittelbar nach der Beschallung, Zentrifuge für 5 min bei 12.000 g bei 4 ° C. Übertragen Sie Überstände in neue Zentrifuge Rohre. Hinweis: Um Homogenität zu gewährleisten, replizieren Überstände gebündelt und werden bei diesem Schritt umverteilt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) RNA-Pulldown
<ol><li>
Tag 1 – Hybridisierung Schritt
	<ol>
<li>2 Bände der Hybridisierung Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 750 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % SDS, 15 % Formamid, aus dem Stegreif hinzugefügt) hinzufügen, Überstände nach der Beschallung Schritt gesammelt wurden. Vortex.</li>
		<li>20 µL jeder Probe in ein Zentrifugenröhrchen (eingabesamples) übertragen und speichern bei-20 ° C.</li>
		<li>Jede Probe fügen Sie 100 Pmol biotinylierte Oligonukleotid Sonden (spezifische oder unspezifische; siehe Tabelle 1 hinzu). Inkubieren Sie 4 bis 6 h unter mäßiger Erregung auf ein Rohr Rotator bei RT</li>
		<li>Fügen Sie 50 µL der magnetischen Streptavidin Perlen mit 200 U/mL einer RNAse-Inhibitor-Lösung und einem Cocktail von Proteasen Inhibitor 5 µL/mL ergänzt.</li>
		<li>Über Nacht unter mäßiger Erregung auf den Rohr-Rotator bei RT inkubieren</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tag 2 – RNA Isolierung Schritt
	<ol>
<li>Nutzen Sie magnetische Support um Perlen aus Zelle lysate zu trennen, den überstand zu verwerfen und die Perlen mit 900 µL Waschpuffer waschen (SDS 0,5 %, SSC 2 X). Wiederholen Sie, dazwischen 5 mal 5 min Unruhe auf den Rotator bei RT</li>
		<li>Nach dem letzten Waschen, Dekantieren ein letztes Mal und 95 µL Proteinease K-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % SDS) hinzufügen und 5 µL Proteinase K (20 mg/mL) zu Proben.</li>
		<li>Tauen Sie auf dem Eis eingabesamples (20 μl auf) und fügen Sie 75 µL Proteinease K-Puffer und 5 µL Proteinase-K (20 mg/mL).</li>
		<li>Inkubieren Sie alle Proben mit Proteinase K 45 min bei 50 ° C dann 10 min bei 95 ° c</li>
		<li>Kühlen Sie die Probe für 3 min auf Eis, bevor die Perlen von RNAs mit magnetischen Unterstützung trennt. Halten Sie den überstand und entsorgen Sie die Perlen.</li>
		<li>Reinigen Sie RNAs mit einem RNS Reinigung Kit, die einen DNA-Verdauung Schritt umfassen sollte. Shop-RNAs bei-80 ° C.</li>
		<li>Durchführen Sie reversen Transkription qPCR (RT-qPCR) mit einem RT-qPCR spezifische Primer (Tabelle 1) mit anschließender Kit.</li>
		<li>Erstellen Sie zwei DNA-Bibliotheken entspricht den zwei RNA-Pools mit jeweils spezifischen Neat1 Sonden (Tabelle 1) erhalten. Durchführen Sie Sequenzierung auf einem Next Generation Sequencing-System.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+maps+of+long+noncoding+RNA+occupancy+reveal+principles+of+RNA-chromatin+interactions.">Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions.</a> Mol Cell. , 667-678 (2011).</li><li>Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+isolation+by+RNA+purification+(ChIRP).">Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP).</a> J Vis Exp. , e3912 (2012).</li><li>Simon, M. D., Wang, C. I., Kharchenko, P. V., West, J. A., Chapman, B. A., Alekseyenko, A. A., Borowsky, M. L., Kuroda, M. I., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+binding+sites+of+a+noncoding+RNA.">The genomic binding sites of a noncoding RNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 20497-20502 (2011).</li><li>Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+hybridization+analysis+of+RNA+targets+(CHART).">Capture hybridization analysis of RNA targets (CHART).</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2013).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Sun, X., Haider Ali, M. S. S., Moran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+interactions+of+long+non-coding+RNAs+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoproteins+in+regulating+cellular+functions.">The role of interactions of long non-coding RNAs and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in regulating cellular functions.</a> Biochem J. , 2925-2935 (2017).</li><li>Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neub&#246;ck, R., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vienna+RNA+websuite.">The Vienna RNA websuite.</a> Nucleic Acids Res. , W70-W74 (2008).</li><li>Tollervey, J. R., Curk, T., Rogelj, B., Briese, M., Cereda, M., Kayikci, M., K&#246;nig, J., Hortob&#225;gyi, T., Nishimura, A. L., Zupunski, V., Patani, R., Chandran, S., Rot, G., Zupan, B., Shaw, C. E., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43.">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nat Neurosci. , 452-458 (2011).</li><li>Riva, P., Ratti, A., Venturin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+non-coding+RNAs+in+neurodegenerative+diseases:+novel+mechanisms+of+pathogenesis.">The long non-coding RNAs in neurodegenerative diseases: novel mechanisms of pathogenesis.</a> Curr Alzheimer Res. (27338628), (2016).</li><li>Barry, G., Briggs, J. A., Hwang, D. W., Nayler, S. P., Fortuna, P. R., Jonkhout, N., Dachet, F., Maag, J. L., Mestdagh, P., Singh, E. M., Avesson, L., Kaczorowski, D. C., Ozturk, E., Jones, N. C., Vetter, I., Arriola-Martinez, L., Hu, J., Franco, G. R., Warn, V. M., Gong, A., Dinger, M. E., Rigo, F., Lipovich, L., Morris, M. J., O'Brien, T. J., Lee, D. S., Loeb, J. A., Blackshaw, S., Mattick, J. S., Wolvetang, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+non-coding+RNA+NEAT1+is+responsive+to+neuronal+activity+and+is+associated+with+hyperexcitability+states.">The long non-coding RNA NEAT1 is responsive to neuronal activity and is associated with hyperexcitability states.</a> Sci Rep. , 40127 (2017).</li><li>Adriaens, C., Standaert, L., Barra, J., Latil, M., Verfaillie, A., Kalev, P., Boeckx, B., Wijnhoven, P. W., Radaelli, E., Vermi, W., Leucci, E., Lapouge, G., Beck, B., van den Oord, J., Nakagawa, S., Hirose, T., Sablina, A. A., Lambrechts, D., Aerts, S., Blanpain, C., Marine, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+induces+formation+of+NEAT1+lncRNA-containing+paraspeckles+that+modulate+replication+stress+response+and+chemosensitivity.">p53 induces formation of NEAT1 lncRNA-containing paraspeckles that modulate replication stress response and chemosensitivity.</a> Nat Med. , (2016).</li><li>Fang, J., Qiao, F., Tu, J., Xu, J., Ding, F., Liu, Y., Akuo, B. A., Hu, J., Shao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+long+non-coding+RNA+NEAT1+indicates+poor+prognosis+of+human+cancer.">High expression of long non-coding RNA NEAT1 indicates poor prognosis of human cancer.</a> Oncotarget. , (2017).</li><li>Torres, M., Becquet, D., Blanchard, M. P., Guillen, S., Boyer, B., Moreno, M., Franc, J. L., Fran&#231;ois-Bellan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+RNA+expression+elicited+by+3'-UTR+IRAlu-paraspeckle+associated+elements.">Circadian RNA expression elicited by 3'-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements.</a> Elife. , (2016).</li><li>Chen, L. L., DeCerbo, J. N., Carmichael, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+element-mediated+gene+silencing.">Alu element-mediated gene silencing.</a> EMBO J. , 1694-1705 (2008).</li><li>Tripathi, V., Ellis, J. D., Shen, Z., Song, D. Y., Pan, Q., Watt, A. T., Freier, S. M., Bennett, C. F., Sharma, A., Bubulya, P. A., Blencowe, B. J., Prasanth, S. G., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear-retained+noncoding+RNA+MALAT1+regulates+alternative+splicing+by+modulating+SR+splicing+factor+phosphorylation.">The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation.</a> Mol Cell. , 925-938 (2010).</li><li>Engreitz, J. M., Sirokman, K., McDonel, P., Shishkin, A. A., Surka, C., Russell, P., Grossman, S. R., Chow, A. Y., Guttman, M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-RNA+Interactions+Enable+Specific+Targeting+of+Noncoding+RNAs+to+Nascent+Pre-mRNAs+and+Chromatin+Sites.">RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites.</a> Cell. , 188-199 (2014).</li><li>Nakagawa, S., Ip, J. Y., Shioi, G., Tripathi, V., Zong, X., Hirose, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malat1+is+not+an+essential+component+of+nuclear+speckles+in+mice.">Malat1 is not an essential component of nuclear speckles in mice.</a> RNA. , (2012).</li><li>Zhang, B., Arun, G., Mao, Y. S., Lazar, Z., Hung, G., Bhattacharjee, G., Xiao, X., Booth, C. J., Wu, J., Zhang, C., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lncRNA+Malat1+is+dispensable+for+mouse+development+but+its+transcription+plays+a+cis-regulatory+role+in+the+adult.">The lncRNA Malat1 is dispensable for mouse development but its transcription plays a cis-regulatory role in the adult.</a> Cell Rep. , 111-123 (2012).</li><li>Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley, D. R., Pimentel, H., Salzberg, S. L., Rinn, J. L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. , 562-578 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Lange Forensisches RNAs (LncRNAs) durch ihre Anzahl und Vielfalt ein großes Forschungsfeld dar, die meisten ihrer Rollen sind noch zu entdecken. Viele von diesen LncRNAs haben eine nukleare Lokalisierung und unter ihnen sind einige an rechtlichen Wege der Genexpression durch transkriptionelle oder posttranskritionelle Mechanismen beteiligt. Eines der aktuellen Herausforderungen in diesem Bereich ist die Relevanz dieser LncRNAs in Posttranskriptionale Verarbeitung von RNAs zu verstehen. Zu diesem Zweck müssen RNAs gezielt durch LncRNAs identifiziert werden. Inspiriert von früheren Studien konzentrierte sich auf die Vereinigung von LncRNAs mit Chromatin, entwickelten wir ein Verfahren, das von RNAs, die einem LncRNA zugeordnet werden können. Der Erfolg dieses Protokolls, namens RNA Pulldown-richtet sich vor allem auf zwei entscheidende Schritte, nämlich die Gestaltung der Gegenstrang DNA-Oligonukleotid Sonden, die speziell und ausschließlich mit der LncRNA von Interesse, und die Bedingungen des Gewebes zu hybridisieren oder Zelle-Fixierung, die die Integrität des Netzwerks zwischen allen molekularen Partnern zu erhalten.
Zuvor veröffentlichten Protokollen vorgesehenen Verfahren um eine LncRNA zusammen mit seinen zugehörigen Chromatin-Sequenzen (ChIRP1,2, Tabelle3,4) zu isolieren. In diesen Protokollen wurden verschiedene Strategien Design beschäftigt, die dem Gegenstrang DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden. In der ChIRP-Prozedur verwendet die Autoren einen Pool von DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden umfasst die gesamte Länge des LncRNA von Interesse nach Ausschluss aller überflüssig und nicht-spezifischen Sonden1,2. Protokoll der CHART die Autoren identifiziert die Bereiche der LncRNA, die zugänglicher für die Hybridisierung sind und Capture-Oligonukleotide, die auf diesen Gebieten entwickelt. Diese Regionen wurden aufgrund ihrer Empfindlichkeit RNase-H ausgewählt. In der Tat, mit der Eigenschaft der RNAse-H, hydrolyseneigung RNAs an Standorten der RNA-DNA-Bindung, der Oligonukleotide, die an zugänglichen Seiten in den LncRNA hybridisieren RNA-DNA-Hybriden zu produzieren und zu enzymatische Spaltung von der LncRNA führen. Die Autoren drei von diesen Kandidaten Erfassung Oligonukleotide ausgewählt und in ein cocktail3,4verwendet.
Das Verfahren zum Design der Gegenstrang DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden war nah an, die in das Diagramm-Protokoll verwendet, aber die Hybridisierung verfügbaren Regionen von der gewünschten LncRNA auf der Grundlage ihrer RNAse-H-Empfindlichkeit nicht ausgewählt wurden, sondern nach deren geringe Wahrscheinlichkeit der internen Basenpaarung wie von Bioinformatik Modellierung von LncRNA Sekundärstruktur bestimmt. Es muss festgestellt werden, dass verschiedene Sekundärstrukturen werden mit verschiedenen Algorithmen vorausgesagt werden, Sonden ausgewählt werden sollten diejenigen, die verfügbaren Sequenzen der LncRNA in der größten Zahl der Sekundärstrukturen vorhergesagt hybridisieren sein. Die gleichen Ergebnisse wurden erzielt mit entweder ein Cocktail aus drei entworfen, spezifische Sonden oder einer einzigen Sonde einzeln. Dies veranlasste die Verwendung von zwei separaten, spezifischen Sonden und die Berücksichtigung der positiven Ergebnisse als jene, die für diese zwei Sonden sind. Endlich, es wird daher empfohlen, am Anfang der Entwicklung der Methode, für ein optimales Ergebnis und Sonden, die Spezifität der Ergebnisse das Pulldown-Menü, 3 verschiedene Anti-Sense-Oligonukleotid entwerfen bewerten zu können und dann zu vergleichen experimentell ihre Effizienz, zumal Sonde Effizienz durch Zelle lysate Vorbereitung verändert werden kann. Dennoch, das Verfahren der Sonde Design basierend auf Bioinformatik Modellierung von LncRNA sekundäre Struktur verwendeten wir preiswerter als die basierend auf Pools von Fliesen Oligonukleotid Sonden2blieb, und das war weniger zeitaufwändig als die Methode basiert RNAse-H Empfindlichkeit4.
Eine negative Kontrolle sollte auch mit negativen erfassen Oligonukleotid entweder die Sinne DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden durchgeführt werden oder Rührei Oligonukleotid Sonden oder gegen eine unabhängige RNA-Oligonukleotide. Wegen der Existenz der natürlichen antisense Transkripte LncRNAs möglicherweise Verwendung von Sinn Oligonukleotid Sonden manchmal unzureichend. Unabhängig von der Oligonukleotid-Sonde für die negativ-Kontrolle ausgewählt ist es notwendig, durch Explosion zu überprüfen, die es nicht mit einem bekannten RNA hybridisieren und im Auge zu behalten, die diese Oligonukleotid, noch un-kommentierte LncRNA hybridisieren kann.
Die Zelle Lysates verwendet diese RNA Pulldown-Experimente stammen aus 106 bis 107 Zellen bei der Arbeit mit kultivierten Zellen und von 1 bis 10 mg, bei der Arbeit mit Gewebe. Die Vorbereitung der Zelle Lysates muss angepasst werden, je nach Gewebe oder Zellen verwendet mit zwei Hauptschritte, die optimiert werden müssen: nämlich die Vernetzung Schritt, die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den LncRNA und ihren molekularen Partnern ermöglicht und die Beschallung-Schritt, der die Viskosität verringert durch Schreddern Chromatin.
Das Ziel der Vernetzung Schritt soll sicherstellen, dass alle RNA-Ziele für den LncRNA geschlossen bleiben, durch Induktion der Bildung eines Netzwerkes zwischen allen Partnern der molekularen. Ein Paraformaldehyd Behandlungsschritt, die bilden kovalente Bindungen zwischen den LncRNA und ihren Partnern kann das Netzwerk sein netzartige. Im Diagramm Protokoll, es wurde vorgeschlagen, wenn arbeiten mit nuklearen LncRNA, um eine erste Behandlung mit Paraformaldehyd durchzuführen, im großen und ganzen lysate Zelle und eine zweite Behandlung am isoliert Nukleinsäuren Bruchteil3,4. Wir beobachteten, dass dieser zusätzliche Schritt die Effizienz der Sonden, wahrscheinlich verringert durch die Reduzierung der LncRNA Zugänglichkeit in den Zellen. Daher der Grad der Vernetzung von Paraformaldehyd muss unter Berücksichtigung der Zelle angepasst oder Gewebetyp verwendet, die Lokalisierung von LncRNA von Interesse, und die Effizienz der entworfenen Sonden.
Während der Lyse der Zellen, das Chromatin ist in der lysate freigegeben und erhöht seine Viskosität; Es ist dann notwendig, um das Chromatin durch Ultraschallbehandlung zu erhöhen die Fließfähigkeit der Proben und erleichtern damit die Zugänglichkeit des Oligonukleotids Zerkleinern, die LncRNA von Interesse-Sonden. Jedoch wird Beschallung auch Schreddern der RNAs extrahiert mit der LncRNA von Interesse. Es ist dann wichtig, die beschallungsdauer so minimieren, dass es effizient reduziert die Viskosität von der lysate, erlaubt es auch, dass die Einholung der RNA Fragmente mit einer Länge zwischen 200-800 BP. Hinweis enthalten, die die beschallungsdauer hoch werden abhängig von der Menge und der Art des Gewebes oder kultivierten Zellen verwendet.
Abschließend ermöglicht die hier beschriebene Vorgehensweise in 2-3 Tagen die Erfassung der RNA Ziele der gewünschten LncRNA. Gepaart mit RT-qPCR, werden diese Methoden ermöglichen eine Verordnung für eine mRNA und bestimmte Zuordnung durch die gewünschte LncRNA als Kandidat Ansatz suchen. Für eine genomweite Ansatz können RNA Pulldown-Experimente von Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung ermöglicht den Abruf von allen RNAs, verbunden mit der gewünschten LncRNA analysiert werden. Was die analytische Strategie gewählt, sollte das RNA-Pulldown-Verfahren neuen wichtigen Erkenntnisse über RNA-Verordnung von LncRNAs vermitteln.

Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist RNA Molekulare Partner eine lange nichtcodierender RNA (LncRNA) zu identifizieren. LncRNA Sequenzen von mehr als 200 Nukleotide ohne einen definierten Leseraster entsprechen. Einige von ihnen haben gezeigt, dass Ausdruck Genregulation, nicht nur auf transkriptioneller Ebene, sondern auch auf verschiedenen Stufen der RNA mit- und Posttranskriptionale Reifung beteiligt sein. In den letztgenannten Fällen sind Molekulare Partner von der LncRNA RNAs, die identifiziert werden. Entscheidend für die Entwicklung wäre eine Methode ermöglicht die Identifizierung der RNAs verbunden direkt oder indirekt mit einer LncRNA von Interesse.
Zuvor veröffentlichten Methoden, wie Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (ChIRP)1,2 und erfassen Hybridisierung Analyse der RNA Ziele (Diagramm)3,4, erlauben Hochdurchsatz-Entdeckung RNA-gebundene Proteine und genomische Bindungsstellen für einen bestimmten LncRNA. In diesen zwei Methoden, die LncRNA von Interesse war zuerst zu biotinylierte komplementären Oligonukleotiden hybridisiert, und die Anlage war dann isoliert mit Streptavidin-Perlen. Der Hauptunterschied zwischen diesen beiden Techniken bezieht sich auf das Design der Sonden, die auf LncRNAs. Zwitschern, die Strategie von RNA-Fisch, bestand aus einen Pool von kurzen komplementären DNA-Oligonukleotid Sonden decken die gesamte Länge der LncRNA Gestaltung inspiriert. Im Gegensatz dazu im Diagramm angepasst die Autoren einen RNase H Zuordnung Assay auf LncRNAs Websites zur Hybridisierung zu untersuchen.
Das Verfahren hier vorgeschlagene Design Gegenstrang DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden verwendet, die Bioinformatik Modellierung von LncRNA Sekundärstruktur5 markieren Sie mit einer starken Affinität für Regionen-Sonden, die eine geringe Wahrscheinlichkeit der internen anzeigen Base pairing. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass weniger teuer als solche auf Basis von Pools von Fliesen Oligonukleotid Sonden2 und weniger zeitaufwändig als solche auf Basis von RNAse-H Empfindlichkeit4.
Da gibt es eine wachsende Zahl von Beweisen für posttranskriptionelle Genregulation durch LncRNAs6, ist es sehr nützlich, um einen Ansatz ermöglicht die Erfassung von RNAs, die Ziele von einem LncRNA zu entwickeln. Darüber hinaus wurde der Ansatz für die meisten Anwendungen verwendbar, in kultivierten Zellen und Gewebe-Extrakte optimiert.

<table><tbody><tr><td>Bioruptor Plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Dynabeads My One</td><td>Thermo-Fisher</td><td>65001</td><td>Magnetic streptavidin beads</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15515-026</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>Advance</td><td>Mupid-One</td><td>Gel electrophoresis apparatus</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>RNA XS purification kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740902</td><td>RNA purificationkit</td></tr><tr><td>RNAseOUT</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10777-019</td><td>RNAse inhibitor</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15596018</td><td>RNA purification</td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>Stuart</td><td>SB2</td><td>Eppendorf tube rotator</td></tr><tr><td>RNA to DNA</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4387405</td><td>Reverse transcription kit</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1725124</td><td>qPCR reagent</td></tr><tr><td>Applied 7500 Fast</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4351107</td><td>qPCR apparatus</td></tr><tr><td>Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit</td><td>Illumina</td><td>20020594</td><td>DNA library construction kit</td></tr><tr><td>Illumina NextSeq 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>NGS system</td></tr></tbody></table>

rna pull-down procedure to identify rna targets of a long non-coding rna

Lange nicht-kodierende RNA (LncRNA), die Sequenzen von mehr als 200 Nukleotiden ohne einen definierten Leseraster sind, gehören zu den regulatorischen nicht-kodierender RNA Familie. Obwohl ihre biologischen Funktionen weitgehend unbekannt bleiben, die Zahl dieser LncRNAs stetig gestiegen und es wird jetzt geschätzt, dass der Mensch mehr als 10.000 solcher Protokolle können. Einige davon sind bekanntermaßen wichtige regulatorische Signalwege der Genexpression beteiligt sein, die auf transkriptioneller Ebene, sondern auch auf verschiedenen Stufen der RNA co- und Posttranskriptionale Reifung stattfinden. In den letztgenannten Fällen haben RNAs, die durch das LncRNA ausgerichtet sind, identifiziert werden. Das ist der Grund, warum ist es sinnvoll, eine Methode, die es ermöglicht die Identifizierung der RNAs verbunden direkt oder indirekt mit einer LncRNA von Interesse zu entwickeln.
Dieses Protokoll, das von zuvor veröffentlichten Protokolle, so dass die Isolierung des LncRNA zusammen mit den zugehörigen Chromatin-Sequenzen inspiriert wurde, wurde angepasst um die Isolierung der zugehörigen RNAs zu ermöglichen. Wir festgestellt, dass zwei Schritte entscheidend für die Effizienz dieses Protokolls sind. Das erste ist das Design von spezifischen Anti-Sense DNA-Oligonukleotid Sonden zu hybridisieren, die LncRNA von Interesse. Zu diesem Zweck die LncRNA Sekundärstruktur wurde von Bioinformatik vorausgesagt und Gegenstrang Oligonukleotid Sonden wurden entwickelt, mit einer starken Affinität für Regionen, in denen eine geringe Wahrscheinlichkeit der internen Basenpaarung angezeigt. Der zweite entscheidende Schritt des Verfahrens stützt sich auf das Fixativ Bedingungen des Gewebes oder kultivierten Zellen, die das Netzwerk zwischen allen molekularen Partnern zu erhalten. Gepaart mit hohem Durchsatz RNA Sequenzierung, bieten diese RNA Pulldown-Protokoll der gesamten RNA Interaktom des LncRNA von Interesse.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass LncRNAs in fast allen wichtigen biologischen Verfahren eine wesentliche Rolle spielen und dass diese Rolle durch die Kontrolle der Genexpression auftreten, sowohl auf die transkriptionelle und posttranskriptionelle Ebene erreicht wird zeigen in diesem Fall, dass RNAs das Ziel von LncRNAs6sein können.
Die LncRNA nuklearen angereicherten reichlich Transkript 1 (Neat1) ist in verschiedenen Neuropathologies als Frontotemporale Demenz, Amyotrophe Lateralsklerose oder Epilepsie8,9,10verwickelt, und ist auch misreguliert in verschiedenen Krebsarten11,12.
Diese LncRNA ist auch bekannt, der strukturellen Komponente des bestimmten nuklearen Einrichtungen, die Paraspeckles und posttranskriptionelle Circadiane Regulierung der Gen-Expression-13beteiligt sein. Paraspeckles, die findet man in jedem Zellkern und werden gebildet, um nicht nur Neat1, die notwendig ist für ihre Ausbildung, sondern auch um mehrere RNA-bindende Proteine (RBP)14, sind in der Tat bekannt, RNA Ziele innerhalb des Zellkerns15 behalten zu können . Die Bildung des Paraspeckles erfolgt durch die Vereinigung der verschiedenen Komponenten. Diese Formation zeigte sich ein circadiane rhythmisches Muster eine rhythmische nuklearen Aufbewahrung von RNA Ziele13fahren angezeigt. Die nukleare Beibehaltung der RNA Ziele von Paraspeckles kann auftreten durch Bindung an RBP oder direkt durch RNA/RNA Verein, aber das Ausmaß der RNAs, die gezielt durch Paraspeckles ermittelt werden musste. Um die RNA zu identifizieren gezielt direkt oder indirekt durch Neat1, eine RNA Pulldown-Protokoll wurde entwickelt, die erlaubt, die Isolierung und Identifizierung aller Neat1 RNA-Ziele in kultivierten Zellen als auch in Gewebeproben (siehe Abbildung 1 für eine grafische Präsentation der Technik).
Das Protokoll wurde auch erfolgreich zur Identifizierung der RNA Ziele von einem anderen LncRNA Metastasierung assoziiert Lunge Adenokarzinom Transkript 1 (Malat1) eingesetzt. Malat1 ist ein hoch konservierte und ausdrücklichen LncRNA in nuklearen Flecken zusammen mit mehreren RNA splicing-Faktoren gefunden. Malat1 ist bekannt, in der Verordnung das Spleißen von mehreren im Entstehen begriffenen Pre-mRNA16,17einbezogen.
(SO) spezifische und unspezifische Oligonukleotid (NSO) Sonden wurden mit der Sonde Designstrategie beschrieben hier erzeugt. Diese Strategie basiert auf die Auswahl der Regionen, in denen eine geringe Wahrscheinlichkeit der internen Basis Paarung wie vorhergesagt durch die Sekundärstruktur der LncRNA angezeigt und das Design von spezifischen Sonden mit einer starken Affinität für diese Regionen. Als ein repräsentatives Ergebnis dieser Bioinformatik Vorhersagen, ein Bild von den vorhergesagten Sekundärstruktur aus einer Folge von Neat1 (Nukleotide 1.480 bis 2.000) zusammen mit der Position von zwei entwickelt, so dass Sonden in Abbildung 2gegeben sind.
Die entworfenen Sonden wurden angewiesen, Neat1 oder Malat1 für GH4C1, die kultivierten Zellen und Maus Neat1 für Hypophyse Gewebe-Extrakte (Tabelle 1) Ratte. Die relative Anreicherung in Neat1 oder Malat1 wurde für die unspezifischen und spezifischen Sonden im Verhältnis zu der eingabesamples berechnet. Abbildung 3 zeigt die Effizienz der spezifischen Sonden zu Pulldown-Neat1 bei der Ratte GH4C1 Hypophyse Zelllinie (Abbildung 3A) und in der Maus Hypophyse Gewebe extrahiert (Abb. 3 b). Wenn die Sonde Design-Protokoll verwenden, um spezifische Oligonukleotid generieren (damit) Sonden an Malat1 weitergeleitet, verworfen eine effiziente Sonde erhalten wurde, während ein anderer nicht effizient genug war und wurde (Abb. 4A).
Nach einer RNA Pulldown-Verfahren, gefolgt von RT-qPCR Experimente, einige RNAs bewertet mit spezifischen Primern (Tabelle 1) erwiesen sich als Neat1 oder Malat1 GH4C1 auszugsweise zugeordnet werden. Der RNAs, die im Zusammenhang mit Neat1 in GH4C1 zellextrakte zeigten auch auszugsweise Hypophyse Gewebe mit Neat1 in Verbindung gebracht werden. In der Tat wurde nach Neat1 RNA Pulldown-Malat1 gefunden, von Neat1 in der GH4C1-Zell-Linie und auszugsweise Hypophyse Maus Gewebe (Abb. 5A) ausgerichtet werden. Umgekehrt war Neat1 wesentlich bereichert, nachdem Malat1 RNA Pulldown-Menü mit einer speziellen Sonde in den GH4C1 Zellen (Abbildung 4 b) durchgeführt. Durch die enge Beziehung zwischen den beiden LncRNAs hervorheben, diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der möglichen ko-Rolle der Neat1 und Malat1, vorgeschlagen von Malat1-Knockout-Mäusen, die Variationen an Neat1 RNA Ausdruck18, 19. die Transkripte der beiden wichtigsten Hypophyse Hormone, Wachstumshormon (Gh) (Abb. 5 b) und Prolaktin (Prl) (Abbildung 5) wurden wesentlich bereichert nach Neat1 RNA Pulldown-Menü mit speziellen Sonden in GH4C1 Zellen und Hypophyse extrahiert, was auf eine mögliche Regulierung der beiden Hormone durch Neat1. Vergleicht man die zwei spezifischen Sonden verwendet, schien es, dass ihre Effizienz, je nach RNA Ziel betrachtet (Abbildung 5 b und Abbildung 5 variieren kann). Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit der Gestaltung mehrere spezifische Sonden, um die Anzeige nicht nur den besten Wirkungsgrad bei der Anreicherung von Pulldown-LncRNA, sondern auch die beste Effizienz bei der Anreicherung der RNA Ziele auswählen.
Die RNA-Pull-Down-Methode kann auch RNA Hochdurchsatz-Sequenzierung erhalten die umfassende Liste der RNA Ziele von LncRNA Interesse13folgen. Eine RNA-Seq-Analyse auf GH4C1 Hypophysen Zellen nach Neat1 RNA Pulldown-Menü mit zwei spezifischen Sonden, die oben beschriebenen durchgeführt wurde. Es sei darauf hingewiesen, dass eine Negativkontrolle mit einem NSO auch RNA-Seq-Analyse unterzogen werden könnte wenn das Niveau der RNA wiederhergestellt, nachdem das RNA-Pulldown-Menü mit NSO ausreicht, um den Bau von Bibliotheken ermöglichen. Dies war nicht der Fall in früheren Erfahrung13. Bibliotheken, die erzeugt wurden, nach der Verwendung von spezifischen Sonden wurden analysiert mit Tophat/Manschettenknöpfe pipeline-20 und nur Abschriften mit Werten des Fragments pro Kilobase pro Million des zugeordneten lautet (FPKM) höher als 1 berücksichtigt wurden. Die Listen mit den zwei spezifischen Sonden an Neat1 gerichtet erhalten (Tabelle 1) wurden gekreuzt, um die Spezifität der Ergebnisse zu bewerten. 4.268 Gene fanden sich verbunden mit Paraspeckles, die 28 % der zum Ausdruck gebrachten Abschriften in GH4C1 Zellen13vertreten. In Übereinstimmung mit erzielten Ergebnisse mit qPCR Analyse (Abbildung 5A-C), die Transkripte der Gh, Prl und Malat1 fanden sich Neat1 zugeordnet werden. Die RNA-Pull-Down-Methode wurde daher erwies sich ein effizientes Werkzeug, um die Interaktion zwischen LncRNAs und ihre RNA Ziele erkunden werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig1v2.jpg"> Abbildung 1: grafische Darstellung der RNA pull-down Verfahren. Am ersten Tag wurden Zellen oder Geweben vernetzt mit Paraformaldehyd, lysiert und vor dem Schritt der Hybridisierung, der durchgeführt wurde, indem man spezifische Sonden biotinylierte beschallt. Magnetische Streptavidin Perlen wurden dann hinzugefügt, um bestimmtes Material vom Rest der Zelle lysate zu trennen. Am zweiten Tag waren Perlen isoliert durch einen Magneten und mehrmals gewaschen. Ein de-Vernetzung Schritt ermöglichte Wiederherstellung von RNAs, die gereinigt und für RT-qPCR oder RNA-Seq-Analyse verwendet wurden. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig2.jpg"> Abbildung 2: sekundäre Struktur aus mehreren Neat1 (Nukleotid 1.480 bis 2.000) wie vorhergesagt von Bioinformatik-Ressource (RNAstructure-Webserver; niedrigste freie Energie-Struktur). Die Struktur ist je nach Grad der Wahrscheinlichkeit der Basenpaarung gefärbt. Die zwei Oligonukleotide Sonden (SO1 und SO2) in rot sind entlang der Neat1 RNA-Struktur aufgestellt. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig3.jpg"> Abbildung 3: qPCR Validierung der Neat1 Bereicherung gegenüber Eingang. qPCR Validierung der Neat1 Bereicherung gegen Eingabe nach Neat1 RNA herunterziehen von zwei verschiedenen spezifischen Sonden (SO1-Rn und SO2-Rn für GH4C1 Zellen und 1 mm und SO2-mm für Hypophyse Gewebe) im Vergleich zu einer unspezifischen (NSO-Rn für GH4C1 Zellen und NSO-mm für Hypophyse Gewebe) in GH4C1 rattenzellen (A) und Maus Hypophyse Gewebe extrahiert (B). Ergebnisse sind Mittelwert ± SEM in 3 bis 10 Experimenten gewonnen. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig5.jpg">
Abbildung 4: qPCR Validierung von Malat1 und Neat1 Bereicherung gegen Eingabe nach Malat1 RNA herunterziehen. qPCR Validierung des Malat1 (A) und Neat1 (B) Anreicherung versus Eingabe nach Malat1 RNA durch zwei verschiedene spezifische Sonden (SO3-Rn und SO4-Rn) im Vergleich zu einer unspezifischen herunterziehen einer (NSO-Rn) in GH4C1 rattenzellen. Ergebnisse sind Mittelwert ± SEM in 3 Experimente erhalten. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig4.jpg"> Abbildung 5: qPCR Validierung von Malat1, Gh, Prl Bereicherung gegen Eingabe nach Neat1 RNA herunterziehen. qPCR Validierung des Malat1 (A), Gh (B), Prl (C) Anreicherung versus Eingabe nach Neat1 RNA pull-down mit verschiedenen spezifischen Sonden im Vergleich zu einer unspezifischen GH4C1 Ratte Zellen und Maus Hypophyse Gewebe extrahiert. Ergebnisse sind Mittelwert ± SEM in 3 bis 8 Experimente erhalten. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>SONDE NAMEN</td>
			<td colspan="2">Sequenzen</td>
		</tr>
<tr>
<td>NSO-Rn</td>
			<td colspan="2">TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO1-Rn</td>
			<td colspan="2">CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO2-Rn</td>
			<td colspan="2">GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO3-Rn</td>
			<td colspan="2">AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO4-Rn</td>
			<td colspan="2">AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>NSO-mm</td>
			<td colspan="2">GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO1-mm</td>
			<td colspan="2">GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO2-mm</td>
			<td colspan="2">CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>qPCR Primer:</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>Rattus norvegicus</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Neat1</td>
			<td colspan="2">AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Malat1</td>
			<td colspan="2">GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">GH1</td>
			<td colspan="2">CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">PRL</td>
			<td colspan="2">TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mus musculus</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Neat1</td>
			<td colspan="2">TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">GH1</td>
			<td colspan="2">CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">PRL</td>
			<td colspan="2">TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Sequenzen von DNA-Oligonukleotid Sonden und qPCR Primer

Watch this Scientific Journal Video about RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA at JoVE.com

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Diese RNA Pulldown-Methode ermöglicht es, die RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA (LncRNA) zu identifizieren. Basierend auf der Hybridisierung von hausgemachten, gestaltete Gegenstrang DNA-Oligonukleotid Sonden spezifisch für diese LncRNA in einem entsprechend festen Gewebe oder Zell-Linie, ermöglicht es effizient die Erfassung aller RNA-Ziele von der LncRNA.

RNA-Pulldown-Verfahren, RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA zu identifizieren

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

rna-pull-down-procedure-to-identify-rna-targets-long-non-coding

Research

JoVE Journal

Genetics

25.1K Aufrufe.  Aix-Marseille Université. Diese RNA Pulldown-Methode ermöglicht es, die RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA (LncRNA) zu identifizieren. Basierend auf der Hybridisierung von hausgemachten, gestaltete Gegenstrang DNA-Oligonukleotid Sonden spezifisch für diese LncRNA in einem entsprechend festen Gewebe oder Zell-Linie, ermöglicht es effizient die Erfassung aller RNA-Ziele von der LncRNA.

Serie: RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Forschung

Biochemie

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetik

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biologie

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

RNA-Pulldown-Verfahren, RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA zu identifizieren

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3'LIFE Assay

RNA-Pulldown-Verfahren, RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA zu identifizieren

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3'LIFE Assay

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA