Autoren erkennen stark Hilfe von Bogdan Osadchiy und Evgenii Protasov (staatliche Universität Irkutsk, Russland) in Vorbereitung des video-Protokolls. Diese Forschung wurde von der russischen Science Foundation (#15-14-10008) und der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung (#15-29-01003) unterstützt.

Alle experimentelle Verfahren wurden im Einklang mit der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche und die Tier Themen Forschung Ausschusses des Instituts für Biologie an Irkutsk Landesuniversität genehmigt worden.
1. Herstellung von Mikrokapseln
Hinweis: Mikrokapseln mit einem Fluoreszenzfarbstoff werden mit einer Schicht für Schicht Versammlung entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten7,8zubereitet. Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
<ol><li>Um poröse CaCO3 Microcores umschließt den Fluoreszenzfarbstoff zu synthetisieren, mischen Sie 2 mL der SNARF-1-Dextran-Lösung (die meisten Polymer gebundener Fluoreszenzfarbstoff wie FITC-BSA kann verwendet werden) in einer Konzentration von etwa 2 mg/mL mit 0,6 mL jeweils 1 Mol/L-Lösungen von CaCl2 und Na2CO3 unter schnell rühren. Hinweis: Achten Sie auf die unterschiedlichen Empfindlichkeiten von Fluoreszenzfarbstoffen, Immunofluoreszenz; Wenn eine lichtempfindliche fluoreszierende Sonde (wie SNARF-1) verwendet wird, müssen die Manipulation und Lagerung der Mikropartikel mit so wenig Licht wie möglich durchgeführt werden.</li>
	<li>Nach ca. 5-10 s Agitation, übertragen die Aussetzung auf 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 15 s bei 10.000-12.000 g zu CaCO3 Microcores Pellets.</li>
	<li>Den überstand verwerfen, die Kerne mit ~ 2 mL entionisiertem Wasser waschen und Aufschwemmen der Pellets durch Schütteln.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Zentrifugation Waschvorgang in insgesamt drei Mal. Nach der letzten Zentrifugation verwerfen des Überstands.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Microcores für 1 min in ein Ultraschallbad, deren Aggregation zu reduzieren. Achtung: Vergessen Sie nicht, Ohren mit Kopfhörern zu schützen.</li>
	<li>Um die erste Polymerschicht auf die Vorlagen einzuzahlen, Aufschwemmen der Kerne in ~ 2 mL einer 4 mg/mL Lösung von Poly(allylamine hydrochloride) (PAK) in 1 Mol/L NaCl.<ol>
<li>Halten Sie die Microcores in der Lösung für ~ 5 min mit konstanter schütteln.</li>
		<li>Nach 15 s der Zentrifugation, verwerfen den Überstand mit dem ungebundenen PAH. Waschen Sie die überdachte Microcores mit entionisiertem Wasser mindestens 3 Mal durch mehrere Zentrifugation und Waschschritte. Nach der letzten Zentrifugation verwerfen des Überstands.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Microcores für 1 min in ein Ultraschallbad, deren Aggregation zu reduzieren. Hinweis: Wenn die angewandte Fluoreszenzfarbstoff kationischen ist, starten von Poly (Natrium-4-Styrenesulfonate) (PSS) in 1 Mol/L NaCl (siehe Schritt 1,7).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 1.6 mit ~ 2 mL einer 4 mg/mL Lösung von PSS (auch mit 1 Mol/L NaCl) die zweite Polymerschicht auf die Vorlagen zu hinterlegen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 sechs mal 12 Polymere Schichten zu hinterlegen. Hinweis: Es empfiehlt sich nicht für eine lange Pause (~ 12 h oder mehr) in der Prozedur bis ~ 3-5 Schichten weil CaCO3 Microcores ohne Abdeckung kann tendenziell recrystallize hinterlegt worden. Beachten Sie, dass PSS Abdeckung eine höhere Ansammlung von den Microcores bewirkt und die lange Pause empfiehlt sich nur dann, wenn PAH oder Poly-L-Lysin mit Polyethylenglykol veredelt (PLL-g-PEG) ist die äußerste Schicht.</li>
	<li>Inkubieren Sie die überdachte Microcores in 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL pro reaktionscup) für mindestens 2 h.<ol>
<li>Waschen Sie die Microcores mit Wasser über sequentielle Zentrifugation und Wiederfreisetzung Schritte. Nach der letzten Zentrifugation verwerfen des Überstands.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um hohle Mikrokapseln zu erhalten, Auflösen der CaCO3 Vorlagen durch Zugabe von 2 mL 0,1 Mol/L Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Säurelösung (eingestellt auf 7,1 pH mit NaOH) auf die überdachten Microcores.<ol>
<li>Nach ca. 5 min Inkubation, Zentrifugieren die Mikrokapseln für 45 s und entsorgen des Überstands mit EDTA.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.10-1.10.1 zweimal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Mikrokapseln mit 0,9 % NaCl dreimal durch mehrere Zentrifugation innerhalb 45 Schritte s gefolgt von Waschschritten. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt verwerfen des Überstands. Hinweis: Die endgültige Mikrokapsel Injektionslösung muss gehalten werden steril (z. B. durch Hinzufügen von Ampicillin, 0,1 mg/mL), und die Medien sollen biokompatible mit dem Ziel, Untersuchung (isotonische Medien mit neutralem pH-Wert).</li>
	<li>Schätzen Sie die Konzentration der vorbereiteten Mikrokapseln in einer Hemocytometer unter dem Fluoreszenzmikroskop. Nehmen Sie eine Reihe von Bildern der Mikrokapseln, Messen Sie den Durchmesser von über hundert Mikrokapseln mit ImageJ9 oder gleichwertige Software und untersuchen Sie die Größenverteilung mit ein Histogramm.</li>
	<li>Shop der erhaltenen gekapselt Sonde im Dunkeln. Hinweis: nach mehrmaligem Waschen in steriler 0,9 % NaCl, die Mikrokapseln können Monate bei 4 ° c gelagert Vollständige Trocknung der Mikrokapseln während der Lagerung wird nicht empfohlen.</li>
</ol>2. Vorbereitung des optischen Aufbau und Kalibrierung von mikroverkapselte SNARF-1
Hinweis: Grobe pH-Messung mit mikroverkapselte SNARF-1 kann mit Bildern in zwei Kanälen eines fluoreszierenden Mikroskop7erfolgen, aber in diesem Protokoll eine einkanalige fluoreszierende Mikroskop mit einem Glasfaser-Spektrometer verbunden angewendet wurde.
<ol><li>Die erforderlichen Satz von Fluoreszenz-Filter an das fluoreszierende Mikroskop nach den Merkmalen der angewandten Fluoreszenzfarbstoff und schalten Sie der Leuchtstofflampe ein.<ol>
<li>Ziehen Sie den Hebel in die Okulare. Achtung: Überschüssige Licht kann die Spektrometer-Matrix Schäden. So stellen Sie sicher, dass der Hebel in der "Okular" Modus ist, wenn das Spektrometer nicht verwendet wird.</li>
		<li>Schließen Sie ein Ende des Lichtleiters das Spektrometer und das andere Ende an einen Kollimator. Verwendung von Adaptern, legen Sie den Kollimator in den Fokus der Kamera Röhre oder anderen verfügbaren Port des fluoreszierenden Mikroskops.</li>
		<li>Schalten Sie das Spektrometer. Führen Sie das Spektrometer-Steuerprogramm und bereiten Sie das Spektrometer für Messungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platzieren Sie für die Kalibrierung der Mikrokapsel-Charge ~ 5 µL der Mikrokapsel Suspension (~ 10 000 Mikrokapseln pro Mikroliter in entionisiertem Wasser) auf einen Objektträger zu und trocknen Sie den Tropfen an einem dunklen Ort (z.B. in einem Thermostat bei 35 ° C).<ol>
<li>Um die spektralen Eigenschaften der mikroverkapselte SNARF-1 zu kalibrieren, verwenden Sie eine Reihe von Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten im Bereich von ~ 6-9. Drop ~ 10 µL eines Puffers auf die getrockneten Mikrokapseln mit SNARF 1 Dextran und mit einem Deckglas abgedeckt.</li>
		<li>Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch. Suchen Sie die Mikrokapseln mit einem × 40 Ziel.</li>
		<li>Durch Drehen des Hebels Mikroskop an den Kamera-Anschluss. Registrieren Sie ihre Fluoreszenz mit dem Spektrometer. Drehen Sie den Verschluss wieder in die Okulare. Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die spektrale Signal weit jenseits der Hintergrund-Ebene ist, und sicherstellen Sie, dass die Mikrokapseln in das Sichtfeld nicht in einer Blase (durch die Umstellung auf eine geringere Vergrößerung bei Bedarf). Vermeiden Sie längere Beleuchtung der gleichen Mikrokapseln. SNARF-1 reagiert empfindlich auf Immunofluoreszenz.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.2.3 für unterschiedliche Mikrokapseln 10 - 15 Mal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berechnen Sie die Fluoreszenz-Peak-Verhältnisse (z. B. Verwendung von R oder Scilab) für alle registrierten Spektren und bestimmen Sie die Regressionsgerade zwischen dem Median Verhältnis (für jeden Puffer) und mittlerer pH-Wert mit Hilfe der folgenden Formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg"> Hinweis: SNARF-1 hat ein Spektrum mit zwei Spitzen, die Emission des protonierten und deprotonierten Farbstoffs entspricht und das Verhältnis zwischen den Gipfeln reagiert auf den pH-Wert des Mediums. In dieser Studie wird das Verhältnis zwischen der Fluoreszenzintensität für 605 und 660 nm verwendet. Diese Wellenlängen sind je nach eingestellter Filter verwendet gewählt. a und b sind Koeffizienten durch nicht-lineare Regression (z. B. Verwendung von R) bestimmt werden. Werte 0,15 bis 1.1 sind, bzw. die minimalen und maximalen Werte der ich605/i660 beobachtet während der Kalibrierung.</li>
	<li>Sammeln Sie etwa 10 µL Blut Fisch von ca. 5 Erwachsene Tiere. Statt Fisch in eine Petrischale mit 1 µL/mL Wasser-Suspension von Nelkenöl für Anästhesie und warten, bis das Tier dreht sich auf der Seite und nicht mehr reagiert, drückt der Flosse (in der Regel ~ 2-3 min). Übertragen Sie die Fische auf einen Objektträger. Die Schwanzflosse mit einer Lanzette abgeschnitten und ca. 2 µL Blut der Fische von der Rute Vene zu sammeln. Hinweis: Um zu verhindern, Blutgerinnung, behandeln Sie den Schnitt mit Heparin (5000 U/mL) zu und verwenden Sie heparinisierten Glaskapillaren und Mikrozentrifugenröhrchen, um das Blut zu sammeln.<ol>
<li>Drip ca. 10 µL Blut mit einer Pipette auf die Spitze der Mikroelektrode und bestimmen den pH-Wert mit einem pH-Meter.</li>
		<li>Tropfen Sie Blut auf eine Folie mit getrockneten Mikrokapseln und registrieren Sie das Verhältnis von der Fluoreszenzintensität wie für die Kalibrierung Puffer (Schritte 2.2-2.3) beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anpassen der lineare Koeffizient der Eichkurve die Kurve die Messungen in der Fisch-Blut (für weitere Details siehe Borvinskaya Et Al. 20175) entsprechen.</li>
</ol>3. Vorbereitung für die Injektion
<ol><li>Lassen Sie die Stahl-Nadel von der Spitze des Insulin-Pen (oder Spritze) durch Entfernen des Kunststoffs mit einer scharfen Lanzette. Hinweis: Eine dünne Nadel (Ø0.33 mm oder weniger) oder Glas-Kapillare (in der Regel Ø1 mm) für die Mikroinjektion10,11zubereitet werden.</li>
	<li>Stechen Sie die Nadel auf halbem Weg in die Glas-Microcapillary; Verlöten Sie schnell und schonend mit einem Gasbrenner.</li>
	<li>Schließen Sie die Glas-Microcapillary an die Microinjector an und spülen Sie es mit sterilem Wasser dreimal. Stellen Sie sicher, dass die Nadel die Flüssigkeit durchströmt.</li>
	<li>Füllen Sie das System mit destilliertem Wasser. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass es gibt keine Luftblasen im System.</li>
</ol>4. Injektion
<ol><li>Die vorbereitete Aussetzung der Mikrokapseln Aufschwemmen (in steriler 0,9 % NaCl oder ein anderes Medium die Injektionen verwendet, mit einer Konzentration von 0,5 bis 6 Millionen Mikrokapseln pro Mikroliter) mit Ultraschallbad für 1 min. Hinweis: Da die Mikrokapseln Niederschlag tendenziell, während der folgenden Injektion, schütteln Sie das Fläschchen mit der Mikrokapseln mechanisch (mit einem Rotor) oder manuell alle paar Minuten sie aufschwemmen und verhindern deren Aggregation.</li>
	<li>Legen Sie den Fisch in eine Petrischale mit Betäubung (0,1 mL/L von Nelkenöl in Wasser suspendiert) für ~ 2 – 3 min. warten, bis der Fisch stellt sich auf seiner Seite und reagiert auf eine leichte Prise die Flosse.</li>
	<li>Mit einem Löffel, übertragen Sie den Fisch aus der Narkose zu und legen Sie sie vorsichtig mit einem feuchten Schwamm in einer seitlichen Position mit dem Kopf nach links (für Rechtshänder) oder nach rechts (für Linkshänder).</li>
	<li>Kurz vor der Injektion saugen Sie 1-2 mm Luft in das Glas-Kapillare mit Microinjector verbunden. Laden Sie es anschließend mit ca. 2 µL der dispergierten Mikrokapseln. Hinweis: Vor der Injektion muss die Mikrokapsel-Lösung auf die Temperatur eingestellt werden an dem die Fische gehalten werden.</li>
	<li>Stabilisieren Sie sanft den Körper des Fisches auf den Schwamm mit der nichtdominanten Hand.<ol>
<li>Die Seitenlinie des Fisches zu finden. Geistig markieren Sie ein Segment, das erstreckt sich von der Kiemendeckel bis zum Ende der Bauchhöhle. Die Mitte dieses Segments zu finden. Legen Sie die Nadel 1 mm niedriger ventralen.</li>
		<li>Bewegen Sie mit einer Schaben Bewegung sanft die Fische Skalen beiseite und machen einen Reifenschaden. Stechen Sie die Nadel in den Körper in einem Winkel von 45° auf der Tischoberfläche.</li>
		<li>Schieben Sie die Nadel in Richtung der Wirbelsäule, bis es sorgfältig anliegt.</li>
		<li>Lassen Sie etwa 1 µL der Mikrokapseln Suspension in der Niere und langsam zurückziehen der Nadelöhrs. Hinweis: Um die richtige Einstichstelle zu finden ist leichter, es sinnvoll zu üben, die Suche nach der Stamm Niere durch transilluminating die Fische mit einem unteren Licht, wie in Abbildung 2A und 2 bdargestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spülen Sie den Fisch von Kopf zu Endstück mit einem Strom des Wassers, eine verschütteten Mikrokapseln an der Injektionsstelle zu entfernen.</li>
</ol>5. in Vivo Visualisierung
<ol><li>Verwenden Sie die Dissektion Schere die Kiemendeckel aus den Fischkopf entfernen und entblößen die Kiemen. Spülen Sie die Kiemen mit Wasser.</li>
	<li>Mit einem Löffel, übertragen Sie den Fisch auf einen Objektträger, und legen Sie es auf der Bühne des fluoreszierenden Mikroskops. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Kiemen der Fische während der nachfolgenden Verfahren nicht austrocknen. Um dies zu vermeiden, Befeuchten Sie sie regelmäßig mit Wasser und einer Pasteurpipette (etwa alle 1-2 min).</li>
	<li>Verdunkeln den Raum und mit geringer Vergrößerung (x 10 Ziel) untersuchen die Kiemen, die fluoreszierenden Mikrokapseln zu finden. Hinweis: Wenn das Verfahren für die Einführung von einigen fluoreszierenden Partikeln in Fisch-Kreislauf-System verwendet wird, empfiehlt es Kiemen mehrerer Personen für unerwartete fluoreszierenden Partikeln vor Injektionen zu inspizieren. Kiemen von Wildtyp Zebrafisch haben keine Autofluoreszenz, aber in einigen Fällen können sporadische fluoreszierende Partikeln (z. B. Lebensmittel Stücke oder einzelligen Symbionten) auf Kiemen vorhanden sein. Wenn nötig, solche Partikel können basierend auf ihre spezifische Form erkannt werden (z. B. Lebensmittel Stücke haben unregelmäßigen Form, im Gegensatz zu kugelförmig Mikrokapseln) oder Fluoreszenz-Spektrum (z.B. Farbe).<ol>
<li>Wechseln Sie das Objektiv in eine höhere Größenordnung (× 40 Ziel) und positionieren Sie eine Mikrokapsel oder eine Gruppe von Mikrokapseln in der Mitte des Sichtfeldes.</li>
		<li>Durch Drehen des Hebels zum Hafen mit einem angeschlossenen Spektrometer. Die spektrale Signal aufzeichnen.</li>
		<li>Drehen Sie den Verschluss wieder in das Okular.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Messungen für unterschiedliche Mikrokapseln mehrmals.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die Fische in das Aquarium mit der richtigen Belüftung für die Wiederherstellung. Hinweis: Mit minimalen Praxis ist es möglich zur Durchführung der Injektion und Signal Aufnahme mit einer ungefähren Geschwindigkeit von 2 bis 3 min pro Fisch. Für eine individuelle mehrmals mit dem Einsatz von wiederholten niedrig, harmlosen Dosen der Narkose oder eine andere Methode der Fixierung kann die Messung wiederholt werden. Verwenden Sie für Langzeit-Beobachtung ein System mit kontinuierlicher Narkose12.</li>
</ol>

<ol><li>Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+microparticles+of+polymers+and+polysaccharides+to+administer+fish+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines.</a> Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).</li>
<li>Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+polyelectrolyte+microcapsules+as+a+contrast+agent+for+photoacoustic+imaging+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood.</a> J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).</li>
<li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).</li>
<li>Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+in+vivo+stress+assessment+of+aquatic+animals+with+microencapsulated+biomarkers+for+environmental+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring.</a> Sci. Rep. 6, e36427(2016).</li>
<li>Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+in+vivo+monitoring+of+pH+in+gill+capillaries+and+muscles+of+fishes+using+microencapsulated+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers.</a> Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).</li>
<li>Diep, C. Q., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+cells+directly+into+the+kidney+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (51), e2725(2011).</li>
<li>Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2007/jm/b705419j#!divAbstract">Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors.</a> J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).</li>
<li>Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.7452/lapl.201210020">Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo.</a> Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+-+Version+1.44%22">ImageJ User Guide - Version 1.44</a>. , 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ ">imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ </a> (2012).</li>
<li>Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+brain+microinjection+to+study+molecular+substrates+of+motivated+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior.</a> J. Vis. Exp. (103), e53018(2015).</li>
<li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+serial+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), e960(2008).</li>
<li>Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+in+the+brain+of+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (81), e51065(2013).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J. Vis. Exp. (54), e2839(2011).</li>
<li>McKee, R. A., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+renal+pathology%3A+Emerging+models+of+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury.</a> Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+hollow+polymer+shells+by+colloid-templated+assembly+of+polyelectrolytes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).</li>
<li>Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S092777570300195X">Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication.</a> Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).</li>
<li>Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nl0259333">Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals.</a> Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).</li>
<li>Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+encapsulation+via+porous+CaCO3+microparticles+templating%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).</li>
<li>Tzaneva, V., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Time+differential+staining+technique+coupled+with+full+bilateral+gill+denervation+to+study+ionocytes+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish.</a> J. Vis. Exp. (97), e52548(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Um die Injektion von Mikropartikeln in der Zebrafisch-Niere zu demonstrieren, haben wir semipermeable Mikrokapseln mit einem indikatorfarbstoff geladen. Das Protokoll enthält Anweisungen für die Herstellung der Mikrokapseln mit der Schicht für Schicht Versammlung von entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten7,8,15,16,17 ,18</s...

Die Verwaltung der Mikro-Größe Partikel in den tierischen Organismus ist eine wichtige Aufgabe in Bereichen wie Drogen und Impfstoff Lieferung1, Gefäßsystem Visualisierung2, transgenen Zelle Implantation3und winzigen optischen Sensor implantation 4 , 5. der Implantation für Microscale Partikel in das Gefäßsystem von kleinen Labortieren ist jedoch schwierig, vor allem für empfindliche Wasserorganismen. Für populäre Forschung Exemplare wie Zebrafisch, ist es ratsam, die diese Verfahren mit Videoprotokolle geklärt werden.
Intrakardialen und Kapillare Mikroinjektionen erfordert geschultes Personal und einzigartige Mikrochirurgie Einrichtungen für die Lieferung von Microobjects in Zebrafisch Blut. Zuvor wurde ein Retro-Orbital manuelle Injektion3 als eine einfache und effektive Methode für die Verwaltung ganzer Zellen vorgeschlagen. Aber nach unserer Erfahrung dauert wegen der kleinen Fläche des Auges Kapillaren Netzes, es viel Übung, um das gewünschte Ergebnis von dieser Technik zu erreichen.
Hier beschreiben wir eine Methode für die robuste und effiziente Mikropartikel Implantation in das Herz-Kreislauf-System durch manuelle Injektion direkt in das nierengewebe Erwachsenen Zebrafisch, die ist reich an Kapillaren und renaler Gefäße. Diese Technik basiert auf dem video-Protokoll für Stammzelltransplantation in der Zebrafisch Niere6, aber die traumatischen und zeitraubende mikrochirurgische Schritte wurden beseitigt. Die vorgeschlagene Methode zeichnet sich durch geringe Mortalität (0-20 %) und hohe Effizienz (70-90 % Erfolg), und es ist leicht, Institut, mit handelsüblichen Geräten.
Ein wichtiger Teil des vorgeschlagenen Protokolls ist die Visualisierung der implantierten Mikropartikel (wenn sie fluoreszierende oder eingefärbte) in den Kapillaren der Kieme, ermöglicht eine Überprüfung der Injektion Qualität, eine grobe relative Bewertung der Anzahl der injizierten Partikel und die Erkennung des spektralen Signals für physiologische Messungen direkt aus dem zirkulierenden Blut. Als ein Beispiel für die Einsatzmöglichkeiten von der beschriebenen Technik demonstrieren wir das Protokoll für in Vivo Messungen von Zebrafisch-Blut-pH mittels mikroverkapselte fluoreszierende Sonde, SNARF-1, ursprünglich vorgeschlagenen in Borvinskaya Et Al. 2017-5.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-dextran, 70000 MW</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler</td></tr><tr><td>Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA)</td><td>SIGMA</td><td>A9771</td><td>Fluorescent probe</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)</td><td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>Fluorescent probe</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Sodium carbonate</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH)</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>Cationic polymer</td></tr><tr><td>Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS)</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>Anionic polymer</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>To dissolve applied polymers</td></tr><tr><td>Water Purification System</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>To prepare deionized water</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Stegler</td><td></td><td>For CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research&amp;nbsp;plus pipette, 1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research&amp;nbsp;plus pipette, 10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips, volume range 200 to 1000 &amp;micro;L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips, volume range 0.1-10&amp;nbsp;&amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed</td><td>BioSan</td><td></td><td>For microcapsule centrifugation-washing procedure</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>Microcapsule synthesis and storage</td></tr><tr><td>Shaker Intelli-mixer RM-1L</td><td>ELMY Ltd.</td><td></td><td>To reduce microcapsule aggregation</td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td></td><td></td><td>To reduce microcapsule aggregation</td></tr><tr><td>Head phones&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>To protect ears from ultrasound</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>To dissolve the CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates</td></tr><tr><td>Monosodium phosphate</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>Preparation of pH buffers</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>Preparation of pH buffers</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>To adjust the pH of the EDTA solution and buffers</td></tr><tr><td>Thermostat chamber</td><td></td><td></td><td>To dry microcapsules on glass slide</td></tr><tr><td>Hemocytometer blood cell count chamber</td><td></td><td></td><td>To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope Mikmed 2</td><td>LOMO</td><td></td><td>In vivo visualization of microcapsules in fish blood</td></tr><tr><td>Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided)</td><td>Chroma</td><td>79010</td><td>Visualization of microcapsules with fluorescent probes</td></tr><tr><td>Fiber spectrometer QE Pro</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 &amp;mu;m, 2 m</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>To connect spectrometer with microscope port</td></tr><tr><td>Collimator F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>To connect spectrometer with microscope port</td></tr><tr><td>Glass microscope slide</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Coverslips, 22 x 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Glass microcapillaries Intra MARK, 10 &amp;micro;L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>To collect fish blood</td></tr><tr><td>Clove oil</td><td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>Fish anesthesia</td></tr><tr><td>Lancet No 11</td><td>Apexmed international B.V.</td><td>P00588</td><td>To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector</td></tr><tr><td>Heparin, 5000 U/mL</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection</td></tr><tr><td>Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>To determine fish blood pH</td></tr><tr><td>Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>For injection procedure. Any thin needle (&amp;Oslash; 0.33 mm or less) is appropriate</td></tr><tr><td>Glass capillaries, 1 x 75 mm</td><td>Hirschmann Laborger&amp;auml;te GmbH &amp;amp; Co</td><td>9201075</td><td>For injection procedure</td></tr><tr><td>Gas torch</td><td></td><td></td><td>To solder steel needle to glass capillary</td></tr><tr><td>Microinjector IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>For precise dosing of microcapsules suspension</td></tr><tr><td>Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Plastic spoon</td><td></td><td></td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Damp sponge</td><td></td><td></td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>To remove the gill cover from the fish head</td></tr><tr><td>Pasteur pipette, 3.5 mL</td><td>BRAND</td><td>Z331767</td><td>To moisten fish gills</td></tr></tbody></table>

simple and effective administration and visualization of microparticles in the circulatory system of small fishes using kidney injection

Die systemische Gabe von Mikro-Größe Partikel in einem lebenden Organismus kann zur Gefäßsystem Visualisierung, Drogen und Impfung, Implantation von transgenen Zellen und kleine optische Sensoren eingesetzt werden. Jedoch intravenöse Mikroinjektionen in kleine Tiere, die meist in biologischen und veterinärmedizinischen Laboratorien verwendet werden, sind sehr schwer und erfordert geschultes Personal. Hier zeigen wir eine robuste und effiziente Methode für die Einführung von Mikropartikeln in das Kreislaufsystem der Erwachsenen Zebrafisch (Danio Rerio) durch Injektion in die Fisch-Niere. Um die eingeführten Mikropartikel in das Gefäßsystem zu visualisieren, schlagen wir eine einfache intravitalen bildgebende Verfahren in Kiemen. Überwachung von Zebrafisch-Blut-pH in Vivo wurde erreicht mit einem injizierten mikroverkapselte Leuchtstofflampen Sonde, SNARF-1, eine der möglichen Anwendungen von der beschriebenen Technik demonstrieren. Dieser Artikel enthält eine ausführliche Beschreibung der Kapselung des pH-sensitiven Farbstoffs und zeigt die Grundsätze der schnelle Injektion und Visualisierung der erhaltenen Mikrokapseln für in Vivo Aufnahme das Fluoreszenzsignal. Die vorgeschlagene Methode der Injektion zeichnet sich durch eine niedrige Sterblichkeitsrate (0-20 %) und hohe Effizienz (70-90 % Erfolg), und es ist leicht, Institut, mit handelsüblichen Geräten. Alle beschriebene Verfahren können auf anderen kleinen Fischarten wie Guppys und Medaka durchgeführt werden.

Die erzielten Ergebnisse stammen aus einer der drei Hauptkategorien des Protokolls präsentiert: die Bildung von fluoreszierenden Mikropartikel durch Verkapselung von einem Fluoreszenzfarbstoff (Abbildung 1), die Niere Injektion von Mikrokapseln mit weiteren Visualisierung in Gill Kapillaren (Abbildung 2 und 3) und schließlich die in Vivo spektrale Aufnahme SNARF-1 Fluoreszenz zu über...

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Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

Dieser Artikel beschreibt die Grundsätze der eine schnelle, minimal-invasive Injektion von fluoreszierenden Mikropartikel in der Circulatory system von kleinen Fischen und in Vivo Visualisierung von Mikropartikeln Fisch im Blut.

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

simple-effective-administration-visualization-microparticles

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Aufrufe.  Institute of Biology at Irkutsk State University. Dieser Artikel beschreibt die Grundsätze der eine schnelle, minimal-invasive Injektion von fluoreszierenden Mikropartikel in der Circulatory system von kleinen Fischen und in Vivo Visualisierung von Mikropartikeln Fisch im Blut.

Serie: Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Forschung

Biologie

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Optimized Intravenous Injection in Adult Zebrafish

Intravenous (IV) injection is widely recognized as the most effective and commonly utilized method for achieving systemic delivery of substances in mammalian research models. However, its application in adult zebrafish for drug delivery, stem cell transplantation, and regenerative and cancer studies has been limited due to the challenges posed by their small body size and intricate blood vessels. To overcome these limitations, alternative injection techniques such as intracardiac and retro-orbital (RO) injection have been explored in the past for stem cell transplantation in adult zebrafish. However, these techniques have their drawbacks, including the need for meticulous injection techniques or increased risk of mortality.
In this study, we have developed a refined and optimized IV injection procedure specifically tailored to adult zebrafish, addressing the challenges associated with their unique anatomy. To demonstrate the effectiveness of this technique, we performed successful IV injections of whole kidney marrow cells from Tg(mpo: EGFP) fish and FITC-dextran dye into adult Casper fish. The subsequent visualization of injected cells and dyes using a fluorescence microscope confirmed their successful delivery and engraftment within the zebrafish. Furthermore, we demonstrated that compared with the intracardiac and RO injections, the IV injection resulted in improved survival rates and engraftment efficiency in treated zebrafish. This approach enables precise delivery and localization of substances and holds great potential for large-scale drug and chemical screening using adult zebrafish. Additionally, the ability to visually track the injected cells and dyes provides invaluable insights into their engraftment, migration, and interactions with host tissues, enabling a more comprehensive evaluation of therapeutic effects and biological processes in zebrafish models.

Here, we present an optimized and effective protocol for the intravenous injection of cells or pharmacological agents into adult zebrafish, resulting in enhanced cell engraftment and increased survival rates of the treated zebrafish.

Optimierte intravenöse Injektion bei adulten Zebrafischen

Intravenous (IV) injection is widely recognized as the most effective and commonly utilized method for achieving systemic delivery of substances in ...

Krebsforschung

Intramyocardial Injection for the Study of Cardiac Lymphatic Function in Zebrafish

Zebrafish have proved to be an important model for studying cardiovascular formation and function during postembryonic development and regeneration. The present protocol describes a method for injecting fluorescent tracers into the zebrafish myocardium to study interstitial fluid and debris uptake into cardiac lymphatic vessels. To do so, microspheres (200 nm diameter) and quantum dots (&#60;10 nm diameter) are introduced into the myocardium of live zebrafish, which can be tracked using ex vivo confocal microscopy. These tracers are then tracked intermittently over several hours to follow clearance from the myocardium into cardiac lymphatic vessels. Quantum dots&#160;are transported through cardiac lymphatic vessels away from the heart, while larger microspheres&#160;remain at the injection site for over three weeks. This method of intramyocardial injection can be extended to other uses, including the injection of encapsulated MS or hydrogels to locally release cells, proteins, or compounds of interest to a targeted region of the heart.

<meta charset="utf8"></head><body>Intramyokardiale Injektion zur Untersuchung der kardialen Lymphfunktion beim Zebrafisch

The present protocol allows efficient and stable delivery of fluorescent microspheres (MS) and quantum dots (QD) into the myocardium of live fish that can be tracked (traced) over time.

Intramyokardiale Injektion zur Untersuchung der kardialen Lymphfunktion beim Zebrafisch

Zebrafish have proved to be an important model for studying cardiovascular formation and function during postembryonic development and regeneration. The ...

Entwicklungsbiologie

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Bewertung der Zebrafisch Nierenfunktion unter Verwendung einer fluoreszierenden Räumungs Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

Mikropunktion Bowmans Platz bei Mäusen durch die 2-Photonen-Mikroskopie

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

Zusammenfassung

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Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

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Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Bewertung der Zebrafisch Nierenfunktion unter Verwendung einer fluoreszierenden Räumungs Assay

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

Mikropunktion Bowmans Platz bei Mäusen durch die 2-Photonen-Mikroskopie