Technische Unterstützung durch Jaipreet Bharj vorgesehen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus EU-FP7 (SYSCILIA -241.955) und der niederländischen Kidney Foundation (CP11.18) unterstützt.

Ethikerklärung: Tier Wartung, Tierhaltung, sowie Prozesse definiert und durch die Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 Alle Tierversuche wurden unter der Innenminister (PIL Nr 70/7892) in Übereinstimmung mit den biologischen erteilten Lizenzen durchgeführt gesteuert Services Management Group und die Biologische Dienstleistungen Ethikkommission, SGUL, London, UK. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Zahl der Versuchstiere zu reduzieren und beide Verfahren und Haltung, um das Leiden zu minimieren und zur Verbesserung der Wohlfahrt zu verfeinern. 1. Herstellung des Instruments, Narkosemittel, und Fluoreszenzfarbstoff <ol><li> Mit einer Mikropipette Abzieher und Borosilikat-Standard-Wand Kapillaren (ohne Fasern) ziehen Nadeln geeigneter Länge für die Mikroinjektion (1A). </li><li> Machen Sie ein Agarose-Form für die Orientierung von Embryonen für die einfache Injektion in den Herzbeutel (1B). Kleber etwa zehn Glasobjekt slIden zusammen, um eine &quot;Treppe&quot; des Offset-Folien zu bilden. Die besten Ergebnisse erzielen, verwenden Sie einen Tropfen schnellen Satz Epoxidharz Kleber in der Mitte jeder Folie. </li><li> Schneiden Sie einen Abschnitt von etwa 78 mm in der Länge auf halbem Weg durch zwei 10 ml Kunststoffpipetten mit einem Bunsenbrenner erhitzten Skalpell entfernen Pipettenenden als angemessen. Befestigen und Leim (Epoxidharz) Pipettenabschnitte der gestapelten Glasträger um Stabilität zu gewährleisten, damit das Werkzeug in eine 90 mm Petrischale eintauchen. Alle Anstrengungen unternehmen, um sicherzustellen, dass die Schiebe Ecken ausrichten senkrecht zur Petrischale Stock. Lassen Kleber Mal zu setzen. </li><li> Guss die Form in einem 2% igen Lösung in Fisch Wasser (aus dem Aquarium erhalten). Gießen Sie Agarose in ein 90 mm Petrischale und legen Sie die Form auf der Oberseite des offenen Petrischale und erlaubt die Stapelschiebekanten in einem Winkel unter dem Agarose-Oberfläche tauchen. Lassen Sie auf dem Labortisch für 30 Minuten eingestellt. </li><li> Entfernen Sie die Folie Besetzung und decken die Einschubprägt Agarose mit frischem Fisch Wasserenthält Tricaine Narkose (siehe Schritt 1.9) zu einem Verhältnis von 1:25. </li><li> Make Lösungen von Rhodamin-Dextran (RD) Farbstoff. Resuspendieren Rhodamin B 10.000 MW markiertem Dextran in autoklaviertem Reinstwasser, um eine Stammkonzentration von 50 mg / ml zu machen. Für die Mikroinjektion, weiter verdünnt das Lager bis zu einer Endkonzentration von 5 mg / ml in autoklaviert Reinstwasser. HINWEIS: pigmentierten Zellen beginnen, in Zebrafisch von 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) zu differenzieren; diese können fluoreszierende Marker bei der Bildaufnahme zu verdunkeln. </li><li> Hemmen Melanozyten Bildung unter Verwendung N -Phenylthiourea (PTU), die Blöcke Melanogenese durch Hemmung der Tyrosinase. Machen Sie eine 0,003% Stammlösung von PTU PTU durch Auflösen von Pulver im Aquarienwasser, Hitze-Lösung bei 60 ° C vollständig löslich zu machen. </li><li> Inkubieren Zebrafischembryonen in Methylenblau-Lösung, einer milden Fungizid, um Pilzblüte verhindern und die Überlebenszeit. 2 ml Methylenblau-Stammlösung, die 0,1% Methylenblau in ultrapure Wasser auf 1 l Aquarienwasser und Verwendung als Standard Embryo Medium. </li><li> Überlegen Sie sich einen 15 mM Stammkonzentration von Tricaine / Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonatsalz wie in &quot;Der Zebrafisch-Buch&quot; 23 angewiesen. Anesthetize die Embryonen und damit immobilisiert sie, um die Mikroinjektionsverfahren durchzuführen. </li><li> Nach Anästhesierung der Embryonen, orientieren sie zur Bildgebung mit Hilfe der nicht-toxisch und viskosen Eigenschaften Methylcellulose. Um einen 200 ml Herstellung von 3% Methylcellulose, chill 130 ml Wasser bei -20 ° C für 30 min auf Eis stellen. Erhitzen Sie 70 ml Wasser auf 80 ° C in einem Becherglas, fügen Sie 6 g Methylcellulose, und rühren mit einem Glasstab, bis alle Partikel benetzt und gleichmäßig verteilt. Fügen Sie das eiskalte Wasser, mischen, und lassen Sie das Präparat bei 4 ° C für 30 Minuten vor dem Aliquotieren in 50-ml-Röhrchen abkühlen. HINWEIS: Das Absenken der Temperatur kann der Methylcellulose löslich zu werden. Die Lösung wird dickerals pulverförmigen Hydraten. 3% Methylcellulose ohne Bakterienwachstum für eine kurze Zeit von einer Woche bei 4 ° C oder mehr bei -20 ° C gelagert werden. Achten Sie darauf, die Methylcellulose hat RT vor dem Gebrauch erreicht. </li><li> Um Injektionen von Fluoreszenzfarbstoff in den Zebrafisch durchführen mit einem Standard-Mikroinjektion Set-up (1C). Diese besteht aus einem Luftkompressor mit einem Druckregler-System, das in eine gerade Pipettenhalter für die Verwendung mit 1,0 Außendurchmesser Kapillaren zuführt. Der Pipettenhalter sollte innerhalb einer MM33 kompakte 3-Achsen-Steuerung Mikromanipulator mit einer Stahlgrundplatte durch eine magnetische Halterung gesichert untergebracht werden. Embryonen können visualisiert werden, manipuliert und durch ein Stereo Binokular injiziert. </li></ol> 2. Zebrafisch Haltung und Pre-Injektionsbehandlung <ol><li> Pflegen Zebrafisch wie zuvor beschrieben 23. Verwenden Sie ein Aquarium Set-up, das bei einer konstanten Temperatur von 28,5 ° C geliefert Umlaufwasser bietetAuf pH 6,8 konditioniert - 7,2 und die Leitfähigkeit von 450-550 uS mit Natriumbicarbonat und Instant Ocean Meersalz auf. Verwenden Wildtyp oder transgenen Zebrafisch Linien entsprechend dem Experiment, die Aufrechterhaltung einer Besatzdichte von 15 Männern und 15 Frauen pro 8 L Tank. Legen Sie die Fischanlage Photozyklus bis 14 Stunden des Tageslichts zwischen 09.00 Uhr bis 11.00 Uhr. </li><li> Zebrafisch Laich beginnt am Anfang des Photozyklus, wenn das Licht eingeschaltet in den Morgen. Um sicherzustellen, maximalen Eier ohne die Fische zu stören gesammelt werden, tauchen Zuchtbecken (mit Mesh-Einsätzen, von Zebrafisch-Spezialisten) in Wildtyp-Lagertanks am Abend vor der Sammlung. </li><li> Am Tag der Erhebung, ermöglichen 30 bis 40 min für die Fische zum Laichen, danach sammeln und spülen Eier mit einem Teesieb und frische Aquarienwasser. Zahlen Sie die gereinigten Eier in einer 90 mm Petrischale mit Embryo Medium und Inkubation bei 28,5 ° C. </li><li> Behandeln Sie die Embryonen mit PTU zu melano hemmenGenese. Um 8 HPF, überlebensfähige Embryonen in minimal Flüssigkeit auf frische Petrischalen mit 1: 100 PTU zu Embryo-Medium und bei 28,5 ° C weiter inkubiert bis 72 HPF. HINWEIS: PTU können Entwicklungsstörungen verursachen, wenn in früheren Stadien so sollte eingeschränkt bis 8 HPF Stufen veröffentlichen werden verwendet, kann aber so spät wie 24 HPF behandelt werden. Am späten Zugabe von PTU nicht vollständig Augenpigmentierung blockieren, aber ist in der Regel erfolgreich und Hemmung Stamm Melanozyten Bildung. </li></ol> 3. Mikroinjektion HINWEIS: Der Herzbeutel umhüllt den Kern jedoch ist für den Schutz und die einfache Herzbewegung von Fluid innerhalb der Perikardhöhle getrennt. Das Ziel dieses Verfahrens ist es, RD in den Herzhohlraum einzuspritzen, dies ermöglicht eine schnelle Aufnahme des Farbstoffs auf das Gefäßsystem. <ol><li> Last Nadeln mit 6 ul - verwässert RD, mit Microloader Tipps und sichern in den Nadelhalter des Mikromanipulator. Brechen Sie das Ende der Nadel mit Fein tipped Zange (Figur 1A). Bewegen Sie den RD-Lösung auf die Spitze der Nadel durch die Maximierung der Pulsdauer auf die Minuteneinstellung, wechseln Sie wieder in msec einmal abgeschlossen. </li><li> Verwenden Sie eine Objektmikrometer, den Druckregler, und Verbesserungen an der Nadelspitze Länge (mit einer Pinzette), um die Größe des ausgestoßenen Tröpfchen auf 100 um im Durchmesser einstellen, entspricht dies einer 0,5 nl Volumen (Abbildung 2A). HINWEIS: Beim Brechen der Nadel darauf achten, zu viel ab, nicht zu brechen sonst wird es machen Kalibrierung des Einspritzvolumens schwierig. Ggf. weiteren brechen die Nadelspitze, um die Tropfengröße jedoch zu steigern sowie eine Nadeldicke, die den Eintritt in den Herzbeutel, ohne übermäßiges Biegen oder Schädigung des Gewebes ermöglicht. </li><li> Vor der Injektion anästhesiert die Embryonen in Embryomedium enthaltenden Tricaine. Bis 2 x 35 mm Petrischalen mit 5 ml Embryo Medium, Etikett einer &#39;Tricaine &quot;und die andere&quot; Verwertung &quot;ein. </li><li> Geben Sie 200ul Lager Tricaine an den entsprechend gekennzeichneten Gericht. Sobald die Injektion bereit, wählen Sie einen individuellen Embryos bei 72 HPF und übertragen in minimal Flüssigkeit auf die Tricaine Gericht. Überwachen Sie die Aktivität des Embryos, testen der Embryo betäubt und durch vorsichtiges Schütteln immobilisiert mit einem abgeschnittenen Microloader Spitze. </li><li> Übertragen Sie die narkotisierten Embryo auf die Spritzgussform und Orientierung des Embryos in einem Agarose-Trog so die linke Seite nach oben zeigt, die Positionierung des Herzens auf der linken Seite des Gesichtsfeldes. </li><li> Um die RD in das Herz injiziert, durchbohren die Herzbeutel mit der Nadel und Injektion 1 nl der RD in die Perikardhöhle des narkotisierten Embryo (2B, rechts). Ziehen Sie die Nadel nach der Injektion. Übertragen Sie die injizierten Embryos in minimal Flüssigkeit auf das &quot;Recovery-Gericht&quot; und Monitor für 1 min. Übertragen Sie die einzelnen Embryo zu einem 24-Well-Platte mit 1 ml frischem Embryo-Medium (das PTU) und kennzeichnen Sie entsprechend. HINWEIS: Der Herzbeutel ist hart, aber es gibt eine bemerkenswerte Schwachpunkt an der Kreuzung, wo die Herzbeutel entspricht den ventro-kaudal Schlundbögen und dorso-rostral Dottersack (2B Pfeilspitze). Die Nadel sollte auf diese Nut gerichtet werden. Wenn die Nadel an Ort und Stelle, wird ein bestimmtes Klopfen eines Finger auf der Oberseite des Mikromanipulators Eintritt in die Perikardhöhle erleichtern. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,6 für mindestens 10 Embryonen pro Versuchsgruppe, legen Sie jeden Fisch in einem eigenen gut und einzigartig labelto Genehmigung einzelnen Versuchs Follow-ups. Inkubation bei 28,5 ° C für 3 Stunden. </li></ol> 4. Imaging Acquisition <ol><li> Nach 3 h nach der Injektion (hpi) anästhesiert Embryonen wie oben beschrieben und übertragen, um eine 35 mm Petrischale, enthaltend 3% Methylcellulose. Drücken Sie vorsichtig Embryonen in die Methylcellulose und zu orientieren, so dass die laterale Seite abgebildet werden kann. </li><li> Erwerben eines Bildes des Embryos unter UV, mit einem Filter zur Visualisierung of emittiert Licht bei 570 nm (Abbildung 2C). Nach der Bildaufnahme, damit der Embryo vor dem Austausch in der gut bezeichnet erholen. Erwerben Sie Bilder für alle injizierten Embryonen und bei 28,5 ° C weiter inkubiert. HINWEIS: In diesem Protokoll verwendeten wir eine Fluoreszenzstereomikroskop mit TXR Filtersatz, einem DFC300FX Kamera und entsprechenden Anwendungssoftware. Notieren Sie sich die exakte Erfassung Einstellungen für nachfolgende Bildaufnahme. </li><li> Bei 24 hpi, erwerben eine zweite Runde von Bildern, wie oben beschrieben. Sobald alle Bilder erworben wurden, an beiden 3 hpi und 24 hpi, menschenwürdig zu verfügen der Embryonen oder Nutzung für andere experimentelle Mittel zB Immunhistochemie. </li></ol> 5. Bildverarbeitung <ol><li> Quantifizierung der Fluoreszenzintensität der einzelnen injizierten Embryos, bei 3 hpi und 24 hpi, durch die Analyse von Bildern mit NIH ImageJ Software. Um Fluoreszenzintensität zu messen, öffnen Sie ein Bild in ImageJ und geben Sie eine Region of Interest (ROI) bei 100 Pixel 2 (Bearbeiten → Auswahl → angeben). </li><li> Positionieren Sie das Herz in der Mitte des roi (2C), stellen Messungen mittleren Graustufen und Umgebung sind (Analyse → Set-Messungen), Messung durchführen (Analysieren → Maßnahme). Füllen Sie für jeden Satz von Bildern, bei 3 hpi und 24 hpi, pro Embryo und übertragen durchschnittliche Grauwerte in eine Tabellenkalkulation zur weiteren Verarbeitung. HINWEIS: Wir haben uns für eine feste roi Größe von 100 Pixel 2, da dies umfasst individuelle Herzen von Embryonen. Das Herz wurde ausgewählt, um Messungen durchzuführen aufgrund seiner Größe, die eine günstige Lage ermöglicht, Fluoreszenzgehalt des Blutes vor dem Eintritt in die Niere zu messen. </li><li> Führen Sie eine statistische Analyse unter Verwendung geeigneter statistischer Software. Gruppen auf statistische Signifikanz mit ein Student t-Test vergleichen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zebrafische bieten ein wertvolles Werkzeug für die menschliche genetische Krankheitsmodell, ihre Verwendung als ein wissenschaftliches Instrument zur in vivo Erforschung detaillierte Studien der genetischen Abbau von vielen biologischen Systemen, einschließlich der Niere aktiviert. Viel ist nun, wie die Zebrafisch-Niere entwickelt und Funktionen zu verstehen. Die auffallende Parallelen zum menschlichen Nephrogenese und Homologie mit krankheitsverursachenden Gene 21 hat sich das Verständnis veransc...

Die menschliche Niere spielt eine entscheidende Rolle bei der Filterung von metabolischen Abfällen aus dem Blut und Gewinnung erforderlich Solute zellulären Homöostase aufrechtzuerhalten. Es gibt eine Reihe von menschlichen genetischen Krankheiten, Funktionsstörungen der Nieren verursachen. Die häufigste vererbte Nierenerkrankung wird autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD), gekennzeichnet durch die Entwicklung von mit Flüssigkeit gefüllten Säckchen im Nieren Tubuli; der Schaden, den cystogenesis verursacht beeinträchtigt die Nierenfunktion 10. ADPKD hat ein Auftreten von 1: 800 bis 1: 1000 und ist für 8 - 10% der Patienten im Endstadium der Niereninsuffizienz (ESRF) 11. Mehrere Gene wurden in Verbindung gebracht zu ADPKD verursachen einschließlich Polycystin-1 (PKD1) und 2 (PKD2), einem Anteil von ca. 85% und 15% der Fälle bzw. 12,13. Ferner können die Genprodukte für PKD1 und -2 zu lokalisieren Ciliums und sind von grundlegender Bedeutung ciliogenesis 14,15. Es gibt nun eine anerkannte Gruppe von menschlichen genetischen Erkrankungen, bekannt alsdie Ziliopathien, die Zilien Funktion beeinträchtigen und zu CKD 16. Die wachsende Zahl von menschlichen genetischen Erkrankungen ciliary Entwicklung und Funktion zeichnet globale Interesse an dieser einst als verkümmerte Organelle. Die Zilien, eine haarähnliche Zellüberstand wird mit Rezeptoren und Ionenkanäle für die Weiterleitung von wichtigen Zellsignalwege erforderlich bereichert. Die Zilien aus einem Mikrotubuli-basierte Axonem, typischerweise in neun radial angeordnet Mikrotubulus Dubletts mit oder ohne zentralen Paar von Singulett Mikrotubuli strukturiert. Die axonemal Struktur definiert die Art und Weise der ciliary Aktion. Die 9 + 2 Mikrotubuli Anordnung verleiht Motilität Ciliums wo sie bei der Bewegung von Fluiden über epitheliale Oberflächen ausgenutzt. Die 9 + 0-Konfiguration ist nicht beweglich, sondern wird angenommen, dass in erster Linie Funktion in der zellulären Signalwege 17. Abgesehen von CKD, sind die Folgen der ciliary Dysfunktion ein Satz charakteristischerZiliopathie Funktionen, die umfassen, Übergewicht, Netzhautdegeneration, Polydaktylie und kognitive Beeinträchtigung 16. Allerdings ist CKD zu den am meisten nachteilig auf die Lebensqualität des Patienten und damit eine treibende Kraft hinter der Entwicklung geeigneter In-vivo-Modelle für ciliary bezogenen CKD. Der Zebrafisch ist ein ausgezeichnetes Modell, um die Ätiologie der menschlichen genetischen Krankheit zu verstehen. Ihre schnelle Entwicklung, ermöglicht die Herstellung einer großen Anzahl von Eiern, transparenten Gewebe und ex utero Wachstumszebrafischentwicklungsvorgänge visualisiert werden und biologische Ereignisse mit großer Leichtigkeit manipuliert. Gene können gentechnisch verändert werden, mit dem jüngsten Erfolg der Genom-Editing-Tools (CRISPR 18 und TALENS 19), niedergeschlagen mit Antisense-Morpholino-Technologie 20 oder pharmakologisch durch die Zugabe von Verbindungen, um ihre Gewässer geregelt. In der Tat, Zebrafisch eine Plattform bieten zu unternehmen eXperimente die nicht permissive in anderen Tiermodellen sind. Während Zebrabärbling sind relativ einfach Vertebraten (gegenüber Menschen) sie viele funktionell konservierten Organen, Gene und Signalprozesse gemeinsam mit dem Menschen. Beispielsweise ist die Zebrafisch Niere in Struktur und Funktion bemerkenswert ähnlich im Vergleich zum Menschen 21,22. Im Gegensatz zu der Säugetierniere, die durch eine Folge von Phasen entwickelt, die jeweils durch einen weiter entwickelten Niere (pronephros, mesonephros und Metanephros) gekennzeichnet, entwickelt der embryonalen Zebrabärbling nur pronephros, die meisten unreifen Form einer Niere. Während Millionen von Nephronen zu finden sind, welche die Bausteine ​​der Säugetierniere, nur der Zebrafischembryo besitzt zwei. Die Glomeruli, die für die anfängliche Blutfiltrat zu ermöglichen, sind an der Mittellinie gerade ventral zur Aorta fusioniert. Blutfilter durch die Glomeruli in die pronephric Tubuli, die kaudal laufen entlang der Achse, Absicherung vor über die Kloake zu verlassen. Die pronephric tuBules stark mit motilen Zilien, die permissive zur Strömung des Filtrats nach caudal und Austritts 3,4 sind Flimmerepithel. Diese einfache pronephric Struktur beibehält Zebrafisch-Homöostase durch mehrere Wochen das Larvenwachstum wo sie schließlich in eine komplexere Struktur Mesonephros 21 zu entwickeln. Allerdings entwickelt sich der Zebrafisch nie eine Metanephros 21. Trotz der Zebrafisch-Eigenheiten, ist der Zebrafisch Nephron mit Genexpressionsprofile gleich bei Säugetieren beobachtet segmentiert und bietet so einen unvergleichlichen In-vivo-Modell für Nephrogenese 3,22. Routine Patienten für die Nierenfunktion durch eine Reihe von Blut- und Urintests geprüft. In der Regel wird das Blut für gelöste Salze, Harnstoff und Kreatinin analysiert. Hohe Konzentrationen von Harnstoff, Kreatinin und abnormalen Salzkonzentrationen weisen auf Probleme mit der Nierenfunktion. Urinanalyse unter Verwendung eines kolorimetrischen Messstab erkennt abnormale Niveaus des Proteins, blood, Eiter, Bakterien und in Urinproben vorhanden Zucker. Solche Tests erfordern normalerweise ca. 30 ml Urin oder 5 - 10 ml der Blut. Es ist schwierig gewesen, diese Art von Assays, um kleine in vivo Modellorganismen wie Zebrafisch zu übersetzen, hauptsächlich aufgrund der Beschaffenheit unmöglich, eine ausreichende Blut oder Urin, um den Assay durchzuführen. Hier wenden wir uns den Mangel an geeigneten Zebrafisch Nierenfunktionstests und beschreibt eine innovative Technik für die Studie. Durch Injizieren eines fluoreszierenden Farbstoffes in dem Blutstrom sind wir in der Lage, über die Nieren zu überwachen und zu quantifizieren, einzeln über die Zeit der Filtration und die Ausscheidung von Fluoreszenzaktivität aus dem Blut. Diese Methode kann verwendet werden, um Nierenschäden aufgrund von Krankheiten, die wir erbringen, ein Beispiel zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td>
			<td style="width:136px;">Intracel</td>
			<td style="width:136px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">borosilicate standard wall capillaries</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:136px;">VWR International</td>
			<td>631-0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Epoxy Resin Glue</td>
			<td style="width:136px;">Evo-Stik</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>D-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">air compressor&#160;</td>
			<td>Jun-Air</td>
			<td>OF302-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer III&#160;</td>
			<td>Parker Instruments&#160;</td>
			<td>051-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">compact 3-axis control micromanipulator&#160;</td>
			<td>Marzhauser</td>
			<td>MM33&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dissecting stereo microscope</td>
			<td style="width:136px;">Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stage micrometer&#160;</td>
			<td>Pyser- SGI</td>
			<td>02A00404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

Die Zebrafischembryo bietet eine praktische Zwecke geeigneten Modells zur Organogenese studieren und modellieren menschliche genetische Erkrankung. Trotz ihrer relativen Einfachheit der Zebrafisch Niere entwickelt und Funktionen in fast der gleichen Weise wie Menschen. Ein Hauptunterschied in der Konstruktion der menschlichen Niere ist die Anwesenheit von Millionen von Nephronen gegenüber dem Zebrafisch, der nur zwei hat. Jedoch vereinfacht eine solche komplexe System in die Grundfunktionseinheiten ist unser Verständnis, wie die Niere entwickelt und betreibt unterstützt. Im Zebrafisch ist der Mittellinie befindet Glomerulus für die erste Blutfiltration in zwei pronephric Tubuli, die beidseitig entlang der embryonalen Achse laufen vor dem Verschmelzen miteinander an der Kloake abweichen verantwortlich. Die pronephric Tubuli sind stark von bewegliche Zilien, die die Bewegung Filtrat entlang der segmentierten Röhrchen zu erleichtern bevölkert, die den Austausch von verschiedenen gelösten Stoffe, bevor sie schließlich Verlassen durch die Kloake 2-4. Viele Gene, die für CKD, inc verantwortlichLuding diejenigen zu ciliogenesis Zusammenhang wurden im Zebrafisch 5 untersucht. Allerdings ist eine große Nachteil ist die Schwierigkeit bei der Beurteilung Zebrabärbling Nierenfunktion nach der Genmanipulation. Traditionelle Assays zu Funktionsstörungen der Nieren messen beim Menschen nicht translationale zu Zebrafisch erwiesen, vor allem wegen ihrer aquatischen Umwelt und der geringen Größe. Beispielsweise ist es physikalisch nicht möglich ist, Blut zu extrahieren aus embryonalen statt Fische zur Analyse von Harnstoff und Kreatinin-Gehalt, da sie zu klein sind. Hinzu kommt, dass Zebrafisch nicht genug Urin produzieren, für die Prüfung auf einem einfachen Proteinurie &quot;Messstab&quot;, die oft bei der ersten Untersuchung von Patienten durchgeführt wird. Wir beschreiben einen Assay, der die fluoreszierende optische Transparenz der Zebrafisch verwendet, um den Abstand von einem fluoreszierenden Farbstoff quantitativ zu überwachen, mit der Zeit aus dem Gefäßsystem und durch die Niere, um eine Ausgabe der Nierenfunktion 1,6-9 ergeben.

Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) ist eine seltene, heterogene Ziliopathie, die ca. 1 betrifft: 160.000 Menschen weltweit 16. Patienten mit einer Reihe von damit verbundenen Problemen wie polyzystischen Nieren vorhanden, anschließend Patienten benötigen häufig Dialyse oder Transplantation 24. ESRF ist die häufigste Todesursache in den BBS, mit rund 30% der Patienten entwickeln CKD 16. Derzeit haben 20 nicht verwandten Genen in BBS ohne veröffentlicht Genotyp-Phänotyp-Verein in Verbindung ...

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Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Der Zebrafisch ist ein beliebtes Tool zur chronischen Nierenerkrankung (CKD) zu modellieren. Allerdings macht ihre geringe Größe es unmöglich, die Nierenfunktion zu bewerten mit traditionellen Methoden. Wir beschreiben einen Fluoreszenzfarbstoff Nieren-Clearance-Test 1, die quantitative Analyse von Zebrafisch Nierenfunktion bei CKD ermöglicht.

Bewertung der Zebrafisch Nierenfunktion unter Verwendung einer fluoreszierenden Räumungs Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Aufrufe.  University College London.  Der Zebrafisch ist ein beliebtes Tool zur chronischen Nierenerkrankung (CKD) zu modellieren. Allerdings macht ihre geringe Größe es unmöglich, die Nierenfunktion zu bewerten mit traditionellen Methoden. Wir beschreiben einen Fluoreszenzfarbstoff Nieren-Clearance-Test 1, die quantitative Analyse von Zebrafisch Nierenfunktion bei CKD ermöglicht. 

Serie: Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Forschung

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Aufrechterhaltung eines<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bevölkerung Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...