Diese Arbeit wurde von der US National Institutes of Health (NIH) gewährt R01DK069403 und P30DK079307 finanziert.

Ein Teil der folgenden Protokoll basiert auf den veröffentlichten Methoden (Hentschel et al. 2005) und (Weinstein et al. 1995) mit leichten Modifikationen berichtet wurden. Teil 1: Mikroinjektionen Richten Sie im Voraus für die Mikroinjektion <ul><li> Die Fische werden an 2 Tagen nach der Befruchtung (dpf) injiziert. Daher sind erwachsene Zebrafisch 3 Nächte vor einer geplanten Experiment gezüchtet. Sammeln Embryonen und legen Sie sie in einer Petrischale mit Wasser E3 (5mm NaCl, 0,17 mm KCL, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4) bei 28,5 ° C. Am Ende des ersten Tages entfernen abgestorbene Embryonen aus der Petrischale und getrennte Embryonen, so dass es 8-10 Embryonen pro Petrischale sind. </li><li> Bereiten Sie die Glasnadeln Ziehen von Kapillaren (4 cm in der Länge, 0,63 / 0,20 OD / ID Millimeter (mm) R-6 Benutzerdefinierte Rohrglas Drummond Scientific Company, Broomall, PA 9-000-3000) mit einer Elektrode Abzieher. Die Spitze Durchmesser sollte von 10-20 mu m liegen. Unter einem Binokular (Leica S6E), mit einem Permanent-Marker ziehen etwa 10 1mm Linien entlang der Nadel, mit der Hilfe eines Herrschers, und speichern Sie die Nadeln in einer großen Petrischale auf Ton Rampen. </li><li> Bereiten Sie die Haltepipette: Fire-polish der Spitze eines dünnwandigen Borosilikatglas Kapillarrohr (152 mm, 1 / 0,75 OD / ID mm TW100-6, World Precision Instruments, Inc.) in einer Bunsenbrennerflamme, bis der innere Durchmesser die Spitze ist 0,4-0,5 mm. Solche Dimension ermöglicht eine gute Griffigkeit der Dottersack eines 2 dpf Zebrafisch-Larven. Halten Sie das eine Ende eines Stückes Glaskapillare mit langen Zangen und Wärme das Gegenteil Spitze mit der Kapillare mit dem Bunsenbrenner, indem sie senkrecht über dem hellblauen Innenkonus der Flamme, die heißesten, für 1-2 Sekunden, Rollen sie zur Erlangung einer sogar schmelzen. Wiederholen Sie dies einige Male untersuchen Sie anschließend die Kapillare unter dem Mikroskop, auf einer Bühne Mikrometer (Ward 94 W 9910). Dies ist ein kritischer Schritt, könnte es notwendig sein, Feuer-polish ein paar Holding Pipetten und wählen Sie die entsprechende Größe später, während Sie die Manipulation der Larven. Wenn Sie vorsichtig sind, dauert eine Haltepipette für mehrere Mikroinjektion Sitzungen. </li><li> Füllen Sie das Handbuch Mikroliterspritze Pump (MMP, World Precision Instruments, Inc.,) mit Mineralöl, nach den Anweisungen des Herstellers. Der Pipettenhalter ist in einem Joystick Manipulator (Narishige, MN-151), mit einem magnetischen Standfuß (Narishige, MN 151) auf einer Eisenplatte (Narishige, IP) verbunden eingefügt. </li></ul> Mikroinjektion <ul><li> Bereiten 20 &amp;mgr; l der Injektion Mischung:. 2.4μl Gentamicin (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml in Kochsalzlösung) und 17.6μl 10-kDa Lucifer Yellow Dextran (Invitrogen D1825, (1mg/ml in Kochsalzlösung) In der Kontrollgruppe Fisch die Gentamicin ist mit Kochsalzlösung ersetzt. Die fluoreszierenden Dextran (viele verschiedene Farben verwendet werden kann) ist ausreichend, um die Genauigkeit der Injektion zu überprüfen und wählen Larven, die mit dem nephrotoxicant injiziert wurden. </li><li> Werden 2 30mm Petrischalen mit 2 ml Mineralöl für die Platzierung der Injektion Mischung und Kontrolle Mischung unter, um ein Verdampfen der Lösungen zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie die Narkose: 400 mg Tricaine Pulver (Ethyl-m-Aminobenzoesäure Methansulfonat SIGMA A-5040) 97,7 ml DD-Wasser, 2,1 ml 1M Tris (pH 9). Passen Sie auf pH 7. Bewahren Sie diese Stammlösung in die Tiefkühltruhe, in Aliquots von 4,2 ml. Zur Nutzung Tricaine als Anästhetikum verdünnen 4,2 ml Tricaine Stammlösung in 100 ml Wasser E3 (Westerfield 1993) und lassen bei Raumtemperatur. </li></ul> Die folgenden Schritte sind unter einem Binokular durchgeführt <ul><li> Entfernen Sie alle verbleibenden Chorion mit feinen Pinzetten und betäuben das Zebrafisch-Übertragung sie in einer Petrischale mit Tricaine erwärmt bei Raumtemperatur. Zebrafische sollten Tricaine mindestens 15 Minuten vor Beginn der microinjections ausgesetzt werden. </li><li> Öffnen Sie die Spitze der Injektionsnadel mit einer Rasierklinge (VWR Scientific 55411-050). Halten Sie die Klinge in einem leichten Winkel zu einer Fase erstellen und schneiden Sie die Spitze wie ein Trinkgeld Öffnung von ca. 10-20 um Durchmesser zu erhalten. </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung, Vakuum-und Luftversorgung der Mikroinjektion Geräten (World Precision Instruments Inc., PV820 pneumatische picopump). Legen Sie die Nadel in den Nadelhalter am Mikromanipulator und Kippen Basis (Word Precision Instruments, Inc., Model M3301R, TB-1) montiert. </li><li> Zum Füllen der Kanüle einen Tropfen (10 &amp;mgr; l) der Lösung in der 30mm-Petrischale mit Mineralöl (Fisher Chemicals, 0121-1) gefüllt injiziert werden. Drehen Sie den manuellen Mikromanipulator so tauchen die Spitze der Nadel in den Tropfen Lösung, stellen Sie die picopump &quot;hold / vent&quot;-Schalter auf &quot;vent&quot; (&quot;vent&quot; entspricht auf der PV820 Vakuum), und füllen Sie die Nadel durch Ziehen Lösung in der Nadelspitze. Das dauert ein paar Minuten, wenn die Lösung wird in die Nadel zu schnell,das bedeutet, dass der Durchmesser der Spitze zu groß ist, und die Injektionen nicht genau. Nachdem die Nadel gefüllt ist, stellen Sie die picopump auf &quot;hold&quot; (&quot;hold&quot; entspricht auf der PV820 injizieren). </li><li> Zur Kalibrierung der Nadel, setzen Sie die picopump &quot;gated / timed&quot;-Schalter auf &quot;gated&quot;, drücken Sie das Fußpedal, um die Nadel Entlastung, und notieren Sie die Zeit, die (in Sekunden) für den Meniskus, um von einer Markierung zur nächsten (1 Reise mm Gesamtlänge). Wiederholen Sie die 3-fache, nehmen Sie die durchschnittliche Zeit (in Sekunden), und teilen Sie den Wert von 30 (Volumen in Nanoliter (nl) entsprechend 1 mm Luftlinie), um die Anzahl der Millisekunden benötigt, um 1 nl Lösung liefern zu bestimmen. Stellen Sie den Bereich Zeit-Knopf, um diese Zahl, und verschieben Sie die &quot;gated / timed&quot;-Schalter auf &quot;getimte&quot;. Nun ist die picopump ist auf einen 1NL Puls der Lösung zu liefern. </li><li> Entfernen Sie die Mineralöl-Schüssel und die Position der Petrischale mit den Larven unter dem Mikroskop. Gruppe der Fisch in der Mitte der Petrischale und Fokus. </li><li> Legen Sie die Haltepipette im Handbuch Mikrospritze Pumpe (MMP, World Precision Instruments) auf der gegenüberliegenden Seite des Mikroinjektor verschaffen, ihre Spitze auf die Petrischale, und in die Fokusebene des Mikroskops. Bend it mit einem ziemlich flachen Winkel, so dass die Spitze der Haltepipette berührt den Boden der Petrischale und liegt in der Nähe horizontal. Stellen Sie sicher, keiner Luftblase im System haben, was die Reaktionszeit verlangsamen und verringern die Genauigkeit der MMP. </li><li> Wechseln Sie zu einem höheren Vergrößerung unter dem Mikroskop und mit einem superfeinen Wimpern mit Griff (Ted Pella 113) auf die Fischlarven Dorsalseite Position nach unten mit dem Eigelb sehr auf die Haltepipette schließen. Halten Sie die Fischlarven durch Saugen das Eigelb in die Haltepipette durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn die Mikrometerschraube Steuerung des manuellen Mikrospritze Pumpe. Achten Sie darauf, nicht auf den Mikrometer zu weit drehen, wie das Eigelb kann platzen, wenn gezogen zu tief in die Haltepipette. Konzentrieren Sie sich auf die Bildung von gemeinsamen Cardinalvene, die über den Dotter, direkt unterhalb des Periderm liegt und die Website von sehr hoher Durchblutung. Mit dem Mikromanipulator des Injektionsgeräts, führen Sie die Nadel in die Entwicklung gemeinsamer Cardinalvene. Es ist in der Regel notwendig, um die Nadel zurück ziehen ein wenig nach dem Einsetzen, wie die gemeinsame Cardinalvene ist sehr oberflächlich. Inject 1NL der Lösung, indem Sie das Fußpedal, dann die Larven aus den Haltepipette und senden es an Embryos Wasser. Dies ist ein kritischer Schritt, vor allem das erste Mal, weil es eine gewisse Übung in der Positionierung der Fische und die Steuerung der Saug-und Druckseite des Rigs benötigt. Wenn das Eigelb des Embryos ist richtig mit dem Haltepipette gehalten wird, wird er nicht wälzen, wenn die Nadel eindringt. </li><li> Um zu überprüfen, den Erfolg der Mikroinjektion, überwachen die Anwesenheit des Lucifer Yellow Dextran im Herzen der Zebrafische können unter einem Fluoreszenzmikroskop. Der Luzifer-Gelb bleibt sichtbar in das Herz für ca. 20 Minuten vor dem Ableiten in das Kreislaufsystem Wenn die nephrotoxischen Lösung ist richtig, innerhalb von 2 Stunden nach der Injektion injiziert werden Sie sehen sehr wenig Lucifer Yellow Dextran übrigen an der Injektionsstelle. Wenn die Lösung in den Dottersack, ein Ort von Lucifer Yellow Dextran injiziert wird, wird an der Injektionsstelle zu bleiben. (Abb. 1). Bringen Sie den Fisch auf E3 Medium. </li><li> Zwei Tage nach der Injektion, entwickeln sich die Larven pericardial Ödemen als Folge einer verminderten Nierenfunktion (Abb. 2). </li></ul> Teil 2: Fixierung und Immunfluoreszenz mit Na + / K +-ATPase-Antikörper (α-6F) <ul><li> Bei 4 dpf, zwischen 10 und 15 Larven Zebrafisch in 4ml Glasfläschchen (Weathon, 225012) setzen und befestigen Sie sie in 1ml Dent (80% MeOH 20% DMSO) für 4 Stunden bei RT. </li><li> Rehydrieren die Embryonen in einer abgestuften MeOH / PBT (PBS mit 0,5% Tween20) Serie, 75:25 50:50, 25:75, 100% PBT, Pipettieren der Lösung aus und fügen neue Lösung für das gleiche Fläschchen (1 ml Lösung pro Durchstechflasche), 20 Minuten in jeder Lösung. Larven sollten nie der Luft ausgesetzt sein, lassen Sie ein wenig Lösung für die Larven beim Wechsel Lösungen. </li><li> Entfernen PBT und ersetzen 1ml mit Blocking-Lösung (PBS mit 1% DMSO, 0,5% Tween20, 10% normalem Ziegenserum) für 3 Stunden bei 4 ° C auf einem Kolbenpendel. </li><li> Übertragen Sie die Larven in einem 2ml Mikrozentrifuge. Entfernen Blockierserum und ersetzen mit 300μl Primärantikörper in Inkubationslösung (PBS mit 1% DMSO, 0,5% Tween20, 2% normalem Ziegenserum) über Nacht bei 4 ° C auf einem Kolbenpendel. Wir verwenden einen monoklonalen Na + / K +-ATPase-Antikörper (α-6F, Überstand, Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa) am 01.25 Verdünnung </li><li> Entfernen Sie den primären Antikörper und Waschen 3 x 30 Minuten mit Inkubationslösung bei RT. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper (Ziege anti-Maus-Cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003) 1:500 verdünnt in Inkubationslösung für 2 Stunden beiRT. </li><li> Wash 3 x 30 Minuten mit PBT. </li></ul> Teil 3: Kunststoff-Einbettung mit JB-4 <ul><li> Entwässern Gewebe durch ein abgestuftes Ethanol-Reihe (50%, 75%, 95%, 100% x 2), 10 Minuten pro Schritt. </li><li> Bereiten Sie die Infiltration Lösung: 25 ml JB-4 Embedding Lösung A (Polysciences 0226A) und 0.24g des Katalysators (Polysciences 02618). Es dauert eine Weile für den Katalysator zu lösen, etwa 20-30 Minuten. Die Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu 1 Monat. </li><li> Dekantieren von der 100% Ethanol und ersetzen mit Kunststoff-Infiltration Lösung. Legen Sie die Fläschchen ein 4 ° C auf einem Rotator und ermöglichen Infiltration bis die Larven sinken auf den Boden der Glasflasche vor. Dieser Prozess dauert etwa 30 Minuten. </li><li> Embedding-Protokoll: Legen Sie die Kunststoffspritzerei Tassenrost (Polysciences, Inc. 16643A) unter einem Binokular. Übertragen Sie die Larven, zusammen mit Infiltration Lösung zu decken, in die Tassen. Die Kunststoff-Einbettung von Medien in einem kleinen Plastikschlauch vorbereitet. Wir normalerweise einbetten 4-5 Fische auf einmal, einen Fisch für jede Tasse. Bereiten Sie 5-6 ml der Einbettung Kunststoff (1,2 ml der Einbettung Lösung für jede Tasse) Zugabe von 35 ul von JB-4 Embedding-Lösung &quot;B&quot; (Polysciences Inc. 0226B) für jeden ml der Infiltration Lösung. Add 35 ul JB-4 Embedding-Lösung &quot;B&quot; (Polysciences Inc. 0226B) für jeden ml der Infiltration Lösung. Gut mischen, und Abpipettieren mit einer Kunststoff-Pasteurpipette mehrmals. Dies ist wichtig, denn wenn nicht gut gemischt die JB-4 wird nicht richtig polymerisieren. Nach 5ml der Einbettung Kunststoff hergestellt worden ist, zu entfernen Infiltration Kunststoff aus aller Proben mit einer Pasteurpipette. Füllen Sie den Becher mit Einbettung Kunststoff. Der Kunststoff muss Schlamm aus der Tasse, um eine gute Befestigung der Blockhalter auf die Probe zu gewährleisten. Um festzustellen, Zebrafisch Nierentubuli sind Querschnitte der beste. Zu diesem Zweck den Fisch vertikal eingebettet sind, mit gesenktem Kopf. Mit Hilfe der Wimper mit Griff oder feinen Pinzette, in regelmäßigen Abständen Position der Fische vertikal, bis der Kunststoff ist hart genug, dass sie nicht von ihrer Position zu bewegen. Es dauert etwa 20-30 Minuten. Legen Sie dann die EBH-2 Block Halter (Polysciences Inc. 15899) über die Tassen und lassen Sie das Fach bei 4 ° C über Nacht. Wenn die Polymerisation in abgeschlossen haben, können Sie Pop aus den Blöcken wie Eiswürfel. </li><li> Alternative Einbettung Protokoll für mehrere Larven: Fill Formen zur Hälfte mit kompletten JB-4 und lassen Sie es zu polymerisieren. Für die 15 mm im Quadrat Formen verwenden wir die JB-4 Volumen bei 700μl an der Form halber Strecke zu füllen. Anschließend fügen Sie den JB-4 getränkt Larven mit Härter zur vorpolymerisierte halb gefüllten Formen. Orient die Larven mit dem Kopf in Richtung des langen Seite der Form und Ausrichtung der Larven so die Augäpfel Line-Up (Sie können 10 Fische in einem Guss in eine Linie gestellt). Nach dem Block polymerisiert können Sie schneiden den Block Kanten, so drehen die Seite nach dem Messer und Sekundenkleber es zu einer plastischen &quot;Chuck&quot;, die in das Mikrotom passt. Mit dieser Methode können Sie Position eine große Anzahl von Larven im gleichen Block, in der Kunststoff-zentriert, und bereit für Querschnitte. Ist darauf zu achten Ausrichtung der Block mit dem Messer, so dass entsprechende Abschnitte der einzelnen Fisch in einem einzigen Abschnitt getroffen werden. Dies kann beim Schneiden durch die Augen werden: dh Ausrichtung der Block, so dass entsprechende Abschnitte der Augen für jeden Fisch getroffen werden. Das Endergebnis ist, dass man viele Fische gleichzeitig zu analysieren auf einem einzigen Objektträger. </li></ul> Teil 4: Schnitte <ul><li> Stellen Sie die Probe in das Futter Inhaber des Mikrotoms (wir verwenden eine Shandon Finesse Thermo Electro Inc. Mikrotom) </li><li> Stellen Sie den Schiebeschalter wärmer bis 45 ° C. </li><li> Gießen DI-Wasser in ein Becherglas und stellen Sie es auf das Mikrotom in der Nähe </li><li> Vor Schneiden darauf, dass der Block wie orientiert sich an perfekten Querschnitt des Fisches zu erhalten. Die Orientierung Kopf Verstellhebel kann gedreht ermöglicht, die Probe Kopfhaltung genau auf das Messer sein. Fang an zu schneiden dicke Schnitte durch den Kopf des Fisches. Während Schnitte durch die Augen, orientieren den Block, so dass entsprechende Abschnitte der Augen sind für jeden Fisch entnommen. Wenn die Brustflossen in die Abschnitte angezeigt werden, ist, dass, wenn die pronephric Tubuli beginnen. Ab diesem Zeitpunkt etwa 32 4 um Abschnitte aus dem Block geschnitten. </li><li> Sammeln Sie die Abschnitte mit einer Pinzette und lassen Sie sie in das Becherglas mit Wasser löschen, ohne sie zu berühren das Wasser mit der Zange. Der Abschnitt wird so schnell expandieren, da sie die Oberfläche des Wassers trifft, jetzt können Sie es auf einer Folie zu sammeln. Legen Sie die Folie in das Wasser in einem 45 ° Winkel und nähern sich der Abschnitt mit Hilfe der Wimper mit Griff, berühren nur die Grenzen des Abschnitts. </li><li> Inkubieren Sie die Dias auf einer Folie wärmer, bis sie vollständig trocken sein. </li><li> Bildausschnitte mit epifluoreszenten oder konfokalen Mikroskopie. </li></ul> Teil 5: Repräsentative Resultate Wenn richtig ausgeführt, erscheinen injiziert Fische wie in Abbildung 1, mit wenig fluoreszierenden Dextran (in diesem Fall Lucifer Yellow) sichtbar in das Herz und in den Blutkreislauf. Wenn die Injektion zu tief ist, kann injizierten Materials gesehen konzentriert in den Dottersack, oder das Herz durchstochen verursacht starke Blutungen werden. Wenn die Haltepipette richtig gemacht wird, wird der Fisch nicht rollen oder zu verschieben, wenn sie injiziert, und dies wird eine genauere Injektion zu ermöglichen. Auch ist es wichtig, sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der MMP haben, was die Reaktionszeit verlangsamen und verringern die Genauigkeit des Systems. Im Allgemeinen als Folge der Gentamicin Nephrotoxizität, entwickeln 80% der injizierten Fische pericardial Ödem (Abb. 2). Wir verwenden einen Phänotyp Klassifikationssystem, in dem die Fische mit Ödeme evident pericardial Ödeme zeigen, aber keine anderen beobachtbaren Phänotyp, während stark ödematösen Fisch Perikarderguss und Rumpf Ödeme zeigen, mit leichten bis moderaten Achse Krümmung. Mit einem Nierenkanälchen Antikörper gegen Na + / K +-ATPase (α-6F) können wir die beschädigten Röhren in Querschnitten sichtbar zu machen, mit einem offensichtlichen Verlust von Zellpolarität und tubuläre Störung beschädigt Tubuli als die Kontrollen (Abb. 3) verglichen. Dieses Muster stimmt über mehrere Querschnitte. Um eine einwandfreie Querschnitte der Nierentubuli zu erhalten ist wichtig, um die Fische richtig zu positionieren während der Einbettung. Beim Vergleich Abschnitten werden Brustflossen und proximalen gewundenen Kanälchen als anatomische Marker verwendet. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Nephrotoxin Mikroinjektion. (A) Erfolgreiche Injektion eines 10kDa Dextran konjugiert lucifer gelb, mit schwachen Ausdruck in der gemeinsamen Cardinalvene, weißen Pfeil. (B) Falsche Injektion, was zu einer Anzahlung in Höhe von 10kDa Dextran konjugiert Lucifer Yellow, die nicht in das Kreislaufsystem, roter Pfeil verfliegt. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Gentamicin-vermittelte Ödem. (A) Control Larven Zebrafisch injiziert. Gentamicin injiziert Larven Zebrafisch mit (B) moderate oder (C) schwere Ödeme. Alle Larven sind bei 4 dpf mit anteriorer nach links und dorsal wird. Schwarze Pfeile zeigen auf pericardial Ödeme in B und C. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. AKI Immunhistochemie. α-6F Antikörper-Färbung für Na + / K +-ATPase 48 Stunden-post Gentamicin Injektion (4 dpf Larven) in Kontrolle (A, B) und Gentamicin injiziert (C, D) Larven. A, C bei 20-facher Vergrößerung und der B-und D sind 3X digitale Vergrößerungen des rechten Kanälchen in A und C. Hinweis Verlust der basolateralen Polarität und Tubulus Störung, weißen Pfeil in D im Vergleich zu B.

<ol>
	<li>Hentschel, D. M., Park, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li><li>Majumdar, A., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+no+isthmus+reveals+a+role+for+pax2.1+in+tubule+differentiation+and+patterning+events+in+the+pronephric+primordia.">Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia.</a> Development. 127 (10), 2089-2098 (2000).</li><li>Weinstein, B. M., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gridlock,+a+localized+heritable+vascular+patterning+defect+in+the+zebrafish.">Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish.</a> Nat Med. 1 (11), 1143-1147 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1993).</li></ol>

In diesem Video-Beitrag haben wir gezeigt, eine intravenöse Mikroinjektionstechnik für eine AKI-Modell, durch die Schaffung von Gentamicin vermittelten proximal tubuläre Schädigung in Zebrafisch-Larven. Dieser Schaden führt zur Bildung von Herzbeutel und / oder grober Ödeme, was die Unfähigkeit, Wasser zu regulieren. Wir beschrieben eine immunhistochemische Experiment mit einem Antikörper, differenziert Nierentubuli (Majumdar et al. 2000) markiert, zeigt Verlust der Zellpolarität und eine Störung des proximalen Tubulus in geschädigten Nieren. Intravenöse microinjections stellen eine effiziente Methode für die Bereitstellung einer löslichen Substanz in den Blutkreislauf des Zebrafisch-Larven. Diese Technik ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Einführung einer Vielzahl von Stoffen und mit Hilfe eines fluoreszierenden Marker einheitliche Injektionen können ein Vielfaches so für konsistente Ergebnisse wiederholt werden.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>&alpha;6F mouse monoclonal </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental study Hbridoma Bank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Block Holder EBH-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15899</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, INC</td>
<td>TW100-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company, Broomall PA</td>
<td>9-000-3000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalyst Powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>02618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.</td>
<td>155-165-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular probes</td>
<td>D1825</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eyelash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>113</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>G8648</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass vials 4ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Weathon</td>
<td>225012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iron plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nariscige</td>
<td>IP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>JB-4 Embedding Solution A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences Inc.</td>
<td>0226A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>JB-4 Embedding Solution B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>0226B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Joystick micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic stand</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manual microsyringe pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>M3301R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electro Corporation</td>
<td>Shandon Finesse</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil, light</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Chemicals</td>
<td>0121-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kopf</td>
<td>720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic molding cup tray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>16643A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WVR Scientific</td>
<td>55411-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide warmer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stage micrometer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wards </td>
<td>94 W 9910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tilting base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>TB 1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-5040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>P7949</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>S6F</td>
<td>Dissecting microscope</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>M205FA</td>
<td>Fluorescent microscope</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury

In diesem Video-Artikel beschreiben wir ein Zebrafisch-Modell der AKI mit Gentamicin als nephrotoxicant. Die Technik besteht aus intravenösen microinjections auf 2 dpf Zebrafisch. Diese Technik stellt eine effiziente und schnelle Methode, um lösliche Stoffe in die Blutbahn des Zebrafisch-Larven liefern, so dass für die Injektion von 15-20 Fische pro Stunde. Neben AKI Studien kann diese Mikroinjektionstechnik auch für andere Arten von experimentellen Studien, wie der Angiographie verwendet werden. Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll der Technik von Geräten benötigt, um visuelle Maßnahmen verringerte Nierenfunktion. Darüber hinaus haben wir auch zeigen, den Prozess der Fixierung, whole mount Immunhistochemie mit einem Nierenkanälchen Marker-, Kunststoff-Einbettung und Schneiden der Larven Zebrafisch. Wir zeigen, dass Zebrafischlarven mit Gentamicin injiziert zeigen morphologischen Merkmalen im Einklang mit AKI: Ödeme, Verlust von Zellpolarität in proximalen tubulären Epithelzellen und morphologischen Störungen des Röhrchens.

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Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Wir beschreiben eine Technik der Mikroinjektion der Aminoglykosid, Gentamicin, in 2 Tagen nach fetilization (dpf) Zebrafischlarven zu akutem Nierenversagen (AKI) zu induzieren. Wir beschreiben ein Verfahren zur whole mount Immunhistochemie, Kunststoff eingebettet und Schnitte mit Zebrabärblingembryonen der AKI-vermittelten Schaden zu visualisieren.

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

intravenous-microinjections-zebrafish-larvae-to-study-acute-kidney

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K Aufrufe.  University of Pittsburgh. Wir beschreiben eine Technik der Mikroinjektion der Aminoglykosid, Gentamicin, in 2 Tagen nach fetilization (dpf) Zebrafischlarven zu akutem Nierenversagen (AKI) zu induzieren. Wir beschreiben ein Verfahren zur whole mount Immunhistochemie, Kunststoff eingebettet und Schnitte mit Zebrabärblingembryonen der AKI-vermittelten Schaden zu visualisieren.

Serie: Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Microgavage der Zebrafischlarven

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...