Finanzielle Unterstützung für dieses Projekt lieferte die grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft und IKT (2016R1A2B2006354).

1. Vorbereitung von Medien
<ol><li>Bereiten Sie Hefeextrakt mit Ergänzungen (ja), ja ohne Adenin (ja Low Ade), Pombe Glutamate Medium (PMG-12) und PMG ohne Adenin (PMG-Ade) durch Mischen der Komponenten, wie in Tabelle 1beschrieben. Ja-Ade (Low Ade) und PMG-Ade Platten haben alle die gleichen Komponenten, aber die Adenin ist von letzterem ausgelassen.<ol>
<li>Verwenden Sie die folgenden Salz (50 X) Lager: 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L Na2SO4 in Wasser destilliertem. Filter mit einem 0,22 µm Porengröße Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgende Vitamin (1, 000 X) Lager: 1 g/L panthothenat, Nikotinsäure 10 g/L, 10 g/L Inosit, Biotin 10 mg/L in destilliertem Wasser. Filter mit einem 0,22 µm Porengröße Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgende Mineral (10, 000 X) Lager: 5 g/L Borsäure, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O , 10 g/L Zitronensäure in destilliertem Wasser. Filter mit einem 0,22 µm Porengröße Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: Ja flüssiges Medium kann durch Weglassen der Agar gemacht werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Autoklaven Medium und Abkühlen auf unter 60 ° C unter Rühren mit Stir Bar, mit einer Rate von 200 u/min.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL/L G418 Stammlösung ja + G418 (Geneticin) Platten hinzu das ja Medium.<ol>
<li>Verwenden Sie die folgenden G418 (1, 000 X) Lager: 100 mg/mL G418 in destilliertem Wasser. Filter zu sterilisieren, verwenden einen 0,22 µm Porengröße Filter, 1,5 mL Zentrifuge Röhren und Store aliquoten bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rühren Sie für eine weitere 5-10 min und aliquoten Medien in 90 mm Petrischalen (1 L des mittleren Aliquote, rund 40 Petrischalen. Speichern Sie die Platten bei 4 ° C.</li>
</ol>2. Klonen von rpt4 + und seine 5' / 3' wo
<ol><li>Führen Sie PCR Primer p1 und p2 (Abbildung 1A) mit Kernspaltung Hefe genomischen DNA (gDNA) als die Vorlage in einem Gesamtvolumen von 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U Enzym 1 x Reaktion Puffer) und Anwendung der Reaktionszyklen beschrieben in Tabelle 2 zu verstärken 3.315-Basis Paar (bp) Fragment, bestehend aus rpt4 + und seine 5' / 3' wo. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einer Reinigung Kit13 , wie vom Hersteller (Abbildung 1A) gerichtet.</li>
	<li>Die pBlueScript KS(-) Vektor14 und der amplifizierten DNA-Fragment mit rpt4 + mit seinen 5' / 3' wo mit BamH1 und Xho1 in einem Gesamtvolumen von 20 µL (~ 1 µg DNA, 20 U Enzym, 1 X Verdauung Puffer) bei 37 ° C in einem Wasserbad für 16-18 zu verdauen h (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Gel reinigen des verdauten Vektors (1,2 % Agarose-Gel) und DNA durch TAE-basierte Agarose-Gelelektrophorese (100 V, 1 h), DNA-Bänder in den gewünschten Größen besteuert, und Isolierung der DNS mit einem Gel Extraction Kit15einfügen.</li>
	<li>Verbinden Sie den Vektor und DNA-Einlage mit T4 DNA-Ligase durch Durchführung einer 20 µL Ligatur Reaktion mit 50-100 ng der Vektor-DNA, ein ~ 3-fold molaren Überschuss von Einsatz DNA, 400 U T4-DNA-Ligase und 1 x Ligatur Puffer. Inkubieren Sie diese Mischung bei 18 ° C für 16-18 h.</li>
	<li>Verwandeln die aufgespaltenen DNA in 100 µL der E. Coli DH5α durch Anwendung von Hitze-Schock für 70 s bei 42 ° C. Fügen Sie 1 mL LB und inkubieren Sie für 1 h bei 37 ° C für die Wiederherstellung. Durchführen Sie Zentrifugation (13.800 x g), verwerfen Sie die überstand, Platte alle transformierten E. Coli Zellen auf LB Ampicillin (LA) Platten und Inkubation bei 37 ° C 16 h.</li>
	<li>Wählen Sie zwischen 4-8 Kolonien mit Zahnstochern und über Nacht bei 37 ° C in 3 mL LA Medium wachsen.</li>
	<li>Isolieren Sie der Plasmide mit einem Plasmid Reinigung Kit16 laut Protokoll des Herstellers verwendet und durchführen analytische Beschränkung Enzym Verdauung mit 5 µL des isolierten Plasmids, 5 U jedes Restriktionsenzym (BamH1 und Xho1) und 1 x Einschränkung Puffer. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 3 h bestätigen das Klonen durch Sequenzierung Kandidat Plasmide.</li>
</ol>3. Einführung der Stille Mutation (Xho1 Beschränkung Site)
<ol><li>Entwerfen Sie ein paar 33-bp-Primer (p3 und p4), die die gewünschte Mutation in der ansonsten komplementäre Sequenz enthalten.</li>
	<li>PCR mit High Fidelity Polymerase17 (Abbildung 1) in einem Gesamtvolumen von 25 µL führen (10 ng von geklonten Plasmid, 2 µL 10 Pmol Grundierung Mix, 2 U Enzym, 1 X Reaktion Puffer) mit Hilfe der Radsport Parameter in Tabelle 3aufgeführt.</li>
	<li>Die Vorlage Plasmid mit Dpnich in einem Gesamtvolumen von 20 µL (20 U Enzym, 1 X Verdauung Puffer) bei 37 ° C in Wasser für 1 h Bad zu verdauen.</li>
	<li>Verwandeln, propagieren, isolieren und das Plasmid enthält die Stille Mutation, wie beschrieben in Schritten 2,5-2,7-Sequenz. Hinweis: Die Stille Mutation kann auch über eine Klonmethode, die für das Verbinden von mehreren DNA-Fragmente in eine einzige Reaktion18ermöglicht eingeführt werden.</li>
</ol>(4) Random Mutagenesis rpt4 + durch fehleranfällige PCR
<ol><li>Durchführen Sie fehleranfällige PCR mit dem Plasmid mit der Stille Mutation (Xho1 Website) als die Vorlage, Primer p5 und p6, ein Gesamtvolumen von 50 µL (die Menge der Vorlage in Schritt 4.1.1, 2 µL 10 Pmol Grundierung Mix, 2,5 U Enzym, 1 X Reaktion Puffer definiert) , und eine speziellen Polymerase, die entworfen ist, um einen hohen Fehler generieren bewerten19 (Abbildung 1). Führen Sie PCR, wie in Tabelle 2beschrieben.<ol>
<li>Verwenden Sie ca. 4-5 µg der Vorlage Plasmid die Mutation Häufigkeit auf 1 bp/kb (Kilobase) steuern. Hinweis: Ein hoher Konzentration (> 500 ng/µL) Plasmid, das mit einem Mini-Prep Kit20gewonnen werden kann, erforderlich ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie Gelelektrophorese, um ein PCR-Produkt von 2670 bp (1,2 % Agarose-Gel) zu bestätigen. Gel reinigen das PCR-Produkt, wie in Schritt 2.5 beschrieben.</li>
</ol>5. Vorbereitung der Fusion-PCR-Fragmente (KAN, 3' UTR)
<ol><li>PCR mit pFA6a-KANMX621 als Vorlage, Primer p7 und p8 durchführen, und die Bedingungen aufgeführt, in Tabelle 4 Marker (KAN) Fragment zu erhalten. Gel reinigen das resultierende 1.480-bp Fragment wie in Schritt 2.5 (Abbildung 1E) beschrieben.<ol>
<li>Überprüfen Sie, ob das Stopcodon des Gens für Mutation und der kodierenden Region des angrenzenden gen gezielt werden getrennt von mehr als 500 bp. Der endogene Terminator dürfen nicht verwendet werden, wenn diese Region weniger als 500 ist bp; Vielmehr sollte der ADH -Terminator anstelle der endogenen Terminator verwendet werden. Die Protokoll-Änderungen erforderlich, um die ADH -Terminator zu verwenden sind in Tabelle 5dargestellt. Hinweis: Diese Änderungen gelten nur, wenn der ADH -Terminator, der in der pFA6a-3HA-KANMX6-Plasmid verfügbar ist, wird anstelle der endogenen Terminator verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie PCR mit dem geklonten rpt4 +-mit Vektor als Vorlage und Primer p9 und p10 in einem Gesamtvolumen von 50 µL (20 ng von geklonten Plasmid, 2 µL 10 Pmol Grundierung Mix, 2 U Enzym, 1 X Reaktion Puffer), mit den Bedingungen, die in Tabelle 6dargestellt. Gel reinigen die erhaltenen 506-bp 3' UTR-Fragment (Abbildung 1E).</li>
</ol>6. Generation des Konstrukts Transformation durch Fusion PCR (Abbildung 1E)
<ol><li>Bereiten Sie die 3 Fragmente (mutagenisierter rpt4 +KAN und der 3' UTR) bei 50 ng/µL.</li>
	<li>Durchführen Sie Fusion, die PCR der drei mit Primer p11 und p12, Fragmente wie in Tabelle 7 beschrieben. (Das Protokoll für die Fusion PCR ist eine Modifikation des ursprünglichen Protokolls22.) Reinigen Sie das große 4.398-bp-PCR-Produkt.<ol>
<li>Verwenden Sie rpt4 +: KAN:3'UTR Fragmente in einem Verhältnis von 1:3:1 für optimale Ergebnisse. Hinweis: Der Gesamtbetrag der Einsatz DNA sollte nicht mehr als 500 ng. Die empfohlene Menge an rpt4 +: KAN:3'UTR ist 50 Ng:150 Ng:50 ng. Die mutagenisierter Region ist etwa 1,6 kb, so ist die minimale Anzahl von Hefe-Kolonien, die alle möglichen Kombinationen von jede Basis wird mutiert, die anderen drei ausmachen würde 1.600 x 3 = 4.800 Kolonien. Da eine Transformation Reaktion in der Regel 400 bis 500 Kolonien ergibt, mindestens 10 Reaktionen Wert der Fusion PCR zu konstruieren ist erforderlich. Dieses Bedürfnis kann erfüllt werden, indem einfach mehr Reaktion (z. B. Anzahl der PCR-Röhrchen) um den Faktor zehn.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Veränderung der Spalthefe durch Elektroporation (Abb. 1F)
<ol><li>Hefe, 10 mL ja Mittel-bis Sättigung von mehr als 16 h Inkubation zu impfen.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellen zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,2 in 200 mL ja Medium und inkubieren Sie bei 30 ° C mit Schütteln für ca. 5-6 h, OD600 = 0,6 - 0,8.</li>
	<li>Konzentration Zellen auf OD600 = 30, verzichten auf vier 50 mL konische Röhrchen und chill für 10 min auf Eis.</li>
	<li>Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 1.050 x g für 3 min bei 4 ° c durchführen Legen Sie die Rohre und 10 Elektro-Küvetten auf Eis. Führen Sie die Schritte 7,3-7,8 auf Eis.</li>
	<li>Verwerfen Sie den überstand und 15 mL 1,2 M Sorbit. Schütteln Sie die Rohre, um die Zellen aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1050 X g für 3 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 7.4 und 7.5. Verwerfen Sie den überstand. Jedes Rohr 500 µL 1,2 M Sorbit hinzu, Aufschwemmen der Zellen, und sammeln Sie alle Zellen in einem 15 ml konische Rohr.</li>
	<li>Hinzufügen von 1,2 M Sorbit bis zu 2,4 mL (OD600 = 10 pro 0,2 mL). Halten Sie das Rohr auf dem Eis.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Sorbit gefederten Zellen (stellen Sie sicher, sie werden vollständig ausgesetzt), eine EP-Röhrchen mit der Fusion PCR zu konstruieren, gut mischen und übertragen Sie die Probe auf eine Elektro-Küvette.</li>
	<li>Electroporate die Zellen mit den folgenden Optionen: Pilze, ShS (2.00kV, 1 Impuls).</li>
	<li>Jedes Elektro-Küvette für ein Gesamtvolumen von 800 µL 600 µL 1,2 M Sorbit hinzu, und breitete sich dann die Zellen auf vier ja-Platten (200 µL/Platte). Zehn Elektro-Küvetten werden ja auf 40 Platten verzichtet.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 24 h.</li>
	<li>Führen Sie Replica Plattierung ja + G418 und inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 3 Tage.</li>
</ol>8. Auswahl von Heterochromatin destabilisieren Mutanten und Fehlalarme werden gesucht
<ol><li>Führen Sie für jede Platte ja + G418 Replik Plattierung ja-Ade (Low Ade) und PMG-Ade (No Ade) Platten. 1-2 Tage bei 30 ° C, inkubieren Sie die Replik Platten bis einige Kolonien auf den ja-Ade-Platten einer roten Färbung (Abbildung 1 zeigen).</li>
	<li>Ja-Ade und PMG-Ade Platten und wählen Sie Zellen, rosa oder weiß auf die ja-Ade-Platte anzeigen und wachsen auch auf der PMG-Ade-Platte, zu vergleichen. Wählen Sie Kolonien ohne Wachstum auf PMG-Ade, nicht, wie sie Fehlalarme (z. B. widerspiegeln sind, dass die KAN-Kassette auf eine nicht-Ziel-Website an anderer Stelle im Genom integriert worden ist).</li>
	<li>Wählen Sie ca. 1 x 105 Zellen von jeder Kolonie und brüten in 10 µL des SPZ-Lösung enthält 2,5 mg/mL Zymolyase 100 T bei 37 ° C für mindestens 30 Minuten Einsatz 1 µL dieser Lösung als Ausgangspunkt Vorlage für Kolonie PCR (Abbildung 1 H) durchführen.<ol>
<li>Machen Sie SPZ (50 mL) durch Mischen 30 mL 2 M Sorbit, 4,05 mL 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 und 15 mL destilliertem Wasser (endgültige pH 7,5). Proben (5 mL) werden mit Zymolyase ergänzt und in 500 µL Aliquots bei-20 ° C bis zum Gebrauch gespeichert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchführen Sie Gelelektrophorese (1,2 % Agarosegel, 180V, 20 min) zur Visualisierung der Ergebnisse der + Kolonie PCR. Wählen Sie Reaktionen, die PCR Bands die richtige Größe aufweisen und verdauen 5 µL jedes Reaktionsprodukt mit XhoI (4 U Enzym, 1 X Verdauung Puffer, 37 ° C Wasserbad, 1 h), Fehlalarme (Abbildung 1 H) auf den Bildschirm.</li>
	<li>Führen Sie Gelelektrophorese um den XhoI Übersichten (1,2 % Agarose-Gel, 180 V, 20 min) zu visualisieren. Markieren Sie die Kolonien deren PCR-Produkte werden durch XhoIgeschnitten und Patchen sie ja + G418 Platten (Abbildung 1I).</li>
	<li>GDNA aus der Kernspaltung Hefezellen zu isolieren und Sequenzierung der PCR Produkte23durchführen. Vergleichen Sie die erhaltenen Sequenz mit Wildtyp Sequenz, die Mutationen (Abbildung 1I) zu identifizieren.</li>
	<li>Führen Sie direkt wieder das Auge zu Wildtyp Zellen mit Fusion-Konstrukten von mutierten Zellen23durch PCR verstärkt zu verwandeln ein. Verwenden Sie Schmierblutungen, um den Phänotyp in den neugebildeten mutierten Zellen (Abbildung 1J) zu bestätigen.<ol>
<li>Fusion Umwandlung Konstrukt kann leicht mittels PCR Primer p1 mit p10 verstärkt werden mithilfe der genomischen DNS der Mutanten als Vorlage in einem Gesamtvolumen von 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U Enzym 1 x Reaktion Puffer), und die Anwendung der Reaktionszyklen, beschrieben in Tabelle 2 . Umwandlung des Konstrukts kann erfolgen, indem Sie die Schritte 7.1-7.13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Zufällige Mutagenese über fehleranfällige PCR ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erzeugung von einem vielfältigen Pool von Mutanten in einer bestimmten Region. Diese Technik eignet sich besonders für Studien, die versuchen, die Funktion eines Proteins unter bestimmten Umständen zu beurteilen. Zum Beispiel verwendeten wir hierin fehleranfällige PCR, um die Funktion der 19 s-Proteasom Untereinheit, Rpt4, im Heterochromatin Wartung zu beurteilen. Durch Variation die Region gezielt durch die fehleranfällige PCR u...

Nach vorne Genetik ist eine klassische Methode, in der Forscher suchen natürlich vorkommende Mutanten, die einen bestimmten Phänotyp anzeigen und genetische Analysen durchführen. In reverse Genetik Mutationen in einem gen des Interesses eingebracht werden und der Phänotyp wird untersucht. Im letzteren Fall wird zufällige Mutagenese eines Ziel-Gens häufig verwendet, um einen Pool von Mutanten zu generieren, die anschließend zum gewünschten Phänotypen, wie z. B. die Temperaturempfindlichkeit ausgewählt oder enzymatische Aktivität verändert. Verschiedene Methoden können verwendet werden, um zufällige Mutagenese, inklusive fehleranfällige PCR1zu erreichen; UV-Bestrahlung-2; chemische Mutagene wie Ethyl Methanesulfonate (EMS) oder Salpetrige Säure3; die Verwendung von temporären Mutator Stämme, wie Sie zum Ausdruck zu bringen mutD5 4; und DNA Schlurfen5.
Hier beschreiben wir eine Reverse-Genetik-Strategie, in der wir fehleranfällige PCR um mutierte Pools für ein Target-gen in der Spalthefe erzeugen nutzen. Wie man aus seinem Namen vorstellen kann, erzeugt diese Methode Mutationen durch die Einführung von absichtlich Fehler während der PCR. Im Gegensatz zu anderen Methoden der Mutagenese ermöglicht fehleranfällige PCR dem Benutzer, die Region um mutagenisierter werden zu definieren. Dies macht es besonders geeignet bei den Bemühungen um die Funktion einer Protein/Domäne von Interesse zu untersuchen.
Um dieses zufällige Mutagenese-Verfahren zu demonstrieren, verwenden wir hierin rpt4 +, die die 19 s Proteasom Untereinheit kodiert, als Beispiel. Rpt4 hat gezeigt, dass Proteolyse-unabhängige Funktionen in anderen Organismen als Kernspaltung Hefe6,7,8,9haben, und ein Defekt in der Proteolyse bewirken indirekte Effekte durch die Veränderung von Proteinen Ebenen. Wir daher geschirmt für Mutanten, die Proteolyse-unabhängige Veränderungen, mit dem Ziel der Erforschung der Funktion des Proteasoms auf Heterochromatin ausgelöst.
Fehleranfällige PCR kann in jeder beliebigen Region gen angewendet werden, durch den Standort, an dem die Primer binden-tuning. Durch Mutation entstehende Variationen, die die gewünschte phänotypische Veränderung aufweisen können mit entsprechenden Reportern identifiziert werden. Hier, wir nahmen einen ade6 + Reporter eingefügt in das Zentromer 1 äußere wiederholen (Otr) Region10. Konstitutive Heterochromatin ist in dieser Region11, gebildet, so dass die ade6 + Reporter in der Wildtyp Bedingung zum Schweigen gebracht wird; Dies wird durch rote Kolonien10angezeigt. Eine Mutation, die das konstitutive Heterochromatin an das Zentromer destabilisiert führt auf den Ausdruck ade6 + Reporter, die als weiße Kolonien visualisiert wird.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>Adenine sulfate</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phthalate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>Sodium molybdate dihydrate</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-myo-inositol</td><td>MP biomedicals</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, geneticin</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Enzyme reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>For site-directed mutagenesis</td></tr><tr><td>GeneMorphII Random mutagenesis Kit</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>For error-prone PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>For fusion PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq&amp;nbsp;DNA Polymerase</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>For general PCR</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velveteen square, black</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>For replica</td></tr><tr><td>Replica-plating tool</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>For replica</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Biorad</td><td>1652100&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap</td><td>Biorad</td><td>1652086&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>For fusion PCR ramp reaction&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast

Zufällige Mutagenese eines Ziel-Gens wird häufig verwendet, um Mutationen zu identifizieren, die zu den gewünschten Phänotyp führen. Die Methoden, die verwendet werden, um zufällige Mutagenese zu erreichen, fehleranfällige PCR ist eine komfortable und effiziente Strategie für die Erzeugung von einem vielfältigen Pool von Mutanten (i.e., einer mutierten Bibliothek). Fehleranfällige PCR ist die Methode der Wahl, wenn ein Forscher versucht, eine vordefinierten Region, wie der kodierenden Region eines Gens und ohne Auswirkung auf andere genomischen Regionen zu mutieren. Nachdem die mutierte Bibliothek durch fehleranfällige PCR verstärkt wird, muss es in einem geeigneten Plasmid geklont werden. Die Größe der Bibliothek generiert durch fehleranfällige PCR ist von der Leistungsfähigkeit des Klonens Schritt eingeschränkt. Jedoch kann der Klonen Schritt in der Spalthefe Schizosaccharomyces Pombe, durch den Einsatz einer hocheffizienten einstufige Fusion PCR Konstrukte für die Transformation zu generieren ersetzt werden. Mutanten der gewünschten Phänotypen können dann mit entsprechenden Reporter ausgewählt werden. Hier beschreiben wir diese Strategie im Detail, nehmen wir als Beispiel, ein Reporter am Zentromer Heterochromatin eingefügt.

Die erworbenen Rpt4 Mutanten gemäß die in Abbildung 1 beschriebenen Verfahren können analysiert werden, durch die Beurteilung der Farben der Kolonien. Die Farben der Kolonien sind auf die entsprechenden Teller in abnehmender Anzahl von Zellen in Abbildung 2gesichtet. Die ade6 + Reporter an der Heterochromatin Region eingefügt wird in Wildtyp zum Schweigen gebracht und zeigt rote Kolonien in ja-Ade-Platte. Sobald das ...

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Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode für zufällige Mutagenese Zielgen in Spalthefe. Als Beispiel Ziel ist es, rpt4 +, die kodiert eine Untereinheit der 19 s Proteasom und Bildschirm für Mutationen, die Heterochromatin destabilisieren.

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

10.6K Aufrufe.  Korea Advanced Institute of Science and Technology. Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode für zufällige Mutagenese Zielgen in Spalthefe. Als Beispiel Ziel ist es, rpt4 +, die kodiert eine Untereinheit der 19 s Proteasom und Bildschirm für Mutationen, die Heterochromatin destabilisieren.

Serie: Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Forschung

Genetik

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Gezielt<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biologie

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Entwicklung Methode Regie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Zusammenfassung

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Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in

Gezielt

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in

Entwicklung Methode Regie in

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing