Financiamento apoio para este projeto foi fornecido pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (2016R1A2B2006354).

1. preparação dos meios de comunicação
<ol><li>Prepare extracto de levedura com suplementos (Sim), sim sem adenina (Sim Ade de Low), média de Pombe Glutamate (PMG12) e PMG sem adenina (PMG-Ade) misturando os componentes conforme descrito na tabela 1. Sim-Ade (Ade de baixo) e placas de PMG-Ade têm todos os mesmos componentes, mas a adenina é omitida do último.<ol>
<li>Usar o estoque de sal (50 x) a seguir: 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2G/L CaCl2·2H2O, 50 g/L de KCl, 2G/L at2para4 em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm e armazenar a 4 ° C.</li>
		<li>Use a seguinte vitamina (1, 000 x) estoque: pantotenato de 1 g/L, inositol 10 g/L, 10 g/L ácido nicotínico, biotina 10 mg/L em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm e armazenar a 4 ° C.</li>
		<li>Use o seguinte mineral (10, 000 x) estoque: 5 g/L ácido bórico, 4G/L MnSO4, 4G/L ZnSO4·7H2O, 2G/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1G/L de KI, 0,4 g/L de CuSO4·5H2O , 10 g/L ácido cítrico em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm e armazenar a 4 ° C. Nota: Sim líquido de cobertura pode ser feito omitindo o ágar-ágar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Autoclave a médio e resfriá-lo para abaixo de 60 ° C, agitando com uma barra de agitação, à taxa de 200 rpm.</li>
	<li>Para placas de Sim + G418 (geneticin), adicione 1 mL/L G418 de solução para o meio de Sim.<ol>
<li>Use o seguinte G418 (1, 000 x) estoque: 100 mg/mL G418 em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm, alíquota para tubos de centrífuga de 1,5 mL e loja a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mexa por mais 5-10 min e alíquota da mídia em pratos de Petri-90mm (1L de alíquotas médias de aproximadamente 40 pratos de Petri. Armazenar as placas a 4 ° C.</li>
</ol>2. clonagem de rpt4 + e seus 5' / 3' UTRs
<ol><li>Realizar PCR com primers p1 e p2 (figura 1A) usando fissão fermento DNA genômico (gDNA) como o modelo em um volume total de 50 µ l (~ 1 µ g DNA, enzima de U 20, tampão de reação 1x), e aplicando os ciclos de reação descritos na tabela 2 para amplificar uma 3.315-base fragmento de par (bp) compreendendo rpt4 + e seus 5' / 3' UTRs. Purifica o produto do PCR usando um kit de purificação13 conforme indicado pelo fabricante (figura 1A).</li>
	<li>Digerir o pBlueScript KS(-) vector14 e o fragmento de DNA amplificado contendo rpt4 + com sua 5' / 3' UTRs com BamH1 e Xho1 em um volume total de 20 µ l (~ 1 µ g DNA, enzima de U 20, 1 tampão de digestão x) a 37 ° C em banho-maria para 16-18 h (figura 1B).</li>
	<li>Gel de purificar o vetor digerido (gel de agarose 1,2%) e DNA inserir pela realização de eletroforese em gel de agarose TAE-baseado (100 V, 1 h), extirpando as bandas de DNA dos tamanhos desejados e isolar o DNA com um gel de extração kit15.</li>
	<li>Ligam o vetor e inserção de DNA usando T4 DNA ligase realizando uma reação de ligadura de 20 µ l contendo 50-100 ng de DNA, vetor um ~ 3 vezes excesso molar de ligadura tampão 1x, 400 ligase do DNA de T4 U e o DNA de inserção. Incube a mistura a 18 ° C, durante 16-18 h.</li>
	<li>Transformar o DNA ligado em 100 µ l de e. coli DH5α aplicando choque térmico para 70 s a 42 ° C. Adicionar 1 mL de LB e incubar durante 1 h a 37 ° C, para a recuperação. Realizar a centrifugação (13.800 x g), descartar a sobrenadante, placa todos os transformado Escherichia coli células em placas LB-ampicilina (LA) e incubar a 37 ° C, durante 16 h.</li>
	<li>Escolha 4-8 colônias com palitos de dente e crescer durante a noite a 37 ° C, no meio de 3 mL de LA.</li>
	<li>Isolar o plasmídeo com um plasmídeo purificação kit16 usado de acordo com o protocolo do fabricante e executar analítica enzima de restrição digestões com 5 µ l do plasmídeo isolado, 5 U de cada enzima de restrição (BamH1 e Xho1) e 1 x buffer de restrição. Incube a mistura a 37 ° C em banho-maria por 3 h. confirmar a clonagem por sequenciamento plasmídeos de candidato.</li>
</ol>3. introdução da mutação silenciosa (Xho1 Site de restrição)
<ol><li>Desenha um par de primers 33-bp (p3 e p4) que contêm a mutação desejada na sequência de outra forma complementar.</li>
	<li>Realizar o PCR com alta fidelidade do polymerase17 (Figura 1) em um volume total de 25 µ l (10 ng de plasmídeo clonado, 2 µ l de 10 pmol cartilha mix, enzima de U 2, tampão de reação 1x) usar os ciclismo parâmetros listados na tabela 3.</li>
	<li>Digeri o plasmídeo de modelo com DpnI em um volume total de 20 µ l (20 U enzima, 1x tampão de digestão) a 37 ° C em uma água de banho para 1 h.</li>
	<li>Transformar, propagar, isolar e sequenciar o plasmídeo contendo a mutação silenciosa, conforme descrito nas etapas 2.5-2.7. Nota: A mutação silenciosa também pode ser introduzida usando um método de clonagem que permite a junção de vários fragmentos de DNA em uma única reação de18.</li>
</ol>4. random Mutagenesis de rpt4 + pelo PCR propensa
<ol><li>Realizar PCR propensa, usando o plasmídeo com a mutação silenciosa (Xho1 site) como o modelo de primeiras demão p5 e p6, um volume total de 50 µ l (a quantidade de modelo definido na etapa 4.1.1, 2 µ l de mistura de primeira demão 10 pmol, enzima de U 2.5, 1 amortecedor da reação x) , e uma polimerase especial que foi projetada para gerar um erro de alto taxa19 (Figura 1). Realize PCR conforme descrito na tabela 2.<ol>
<li>Use 4-5 µ g de plasmídeo de modelo para controlar a frequência de mutação para 1 bp/kb (quilobase). Nota: Uma alta concentração (> 500 ng / µ l) de plasmídeo, que pode ser obtido usando um prep mini kit20, é necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use a electroforese do gel para confirmar um produto do PCR da bp 2670 (gel de agarose 1,2%). Gel de purificar este produto PCR conforme descrito na etapa 2.5.</li>
</ol>5. preparação de fragmentos PCR de fusão (KAN, 3' UTR)
<ol><li>Realizar PCR usando pFA6a-KANMX621 como o modelo, as primeiras demão p7 e p8, e as condições listadas na tabela 4 para obter o fragmento de marcador (KAN). Gel de purificar o fragmento resultante de 1.480-bp, conforme descrito na etapa 2.5 (Figura 1E).<ol>
<li>Verifique se o códon de parada do gene alvo de mutação e região codificante do gene sua adjacente são separados por mais de 500 bp. O terminador endógeno não pode ser utilizado quando esta região é inferior a 500 bp; em vez disso, o exterminador de ADH deve ser usado em vez do Exterminador do futuro endógena. As mudanças de protocolo necessárias para usar o terminador de ADH são apresentadas na tabela 5. Nota: Essas alterações só se aplicam quando o exterminador de ADH , que está disponível no plasmídeo pFA6a-3HA-KANMX6, é usado em vez do Exterminador do futuro endógena.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar PCR com o clonado rpt4 +-contendo o vetor como o modelo e as primeiras demão p9 e p10 em um volume total de 50 µ l (20 ng do plasmídeo clonado, 2 µ l de 10 pmol cartilha mix, enzima de U 2, tampão de reação 1x), usando as condições apresentadas na tabela 6. Gel de purificar obtidos 506-bp 3' UTR fragmento (Figura 1E).</li>
</ol>6. geração de construção de transformação pela fusão do PCR (Figura 1E)
<ol><li>Prepare os 3 fragmentos (mutagenized + rpt4, KAN e os 3' UTR) em 50 ng / µ l.</li>
	<li>Realize fusão que PCR dos três fragmentos usando as primeiras demão p11 e p12, conforme descrito na tabela 7. (O protocolo para fusão do PCR é uma modificação do protocolo original22). Purifica o principal produto do PCR 4.398-bp.<ol>
<li>Usar rpt4 +: KAN:3'UTR fragmentos na proporção de 1:3:1 para obter melhores resultados. Nota: A quantidade total de DNA da inserção não deve exceder 500 ng. A quantidade recomendada de rpt4 +: KAN:3'UTR é 50 ng:150 ng:50 ng. A região mutagenized é aproximadamente 1,6 kb, então o número mínimo de colônias de levedura que seriam responsáveis por todas as combinações possíveis de cada base, sendo uma mutação para os outros três é 1.600 x 3 = 4.800 colônias. Como uma reação de transformação normalmente produz colônias de 400-500, pelo menos 10 reações vale de fusão PCR construir é necessária. Esta necessidade pode ser satisfeita, simplesmente aumentando a quantidade de reação (isto é, o número de tubos PCR) por um fator de dez.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. transformação de leveduras de fissão por eletroporação (Figura 1F)
<ol><li>Inocule o fermento para 10 mL de meio de sim a saturação incubando-o por mais de 16 h.</li>
	<li>Diluir as células de uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de 0,2 em 200 mL de meio de Sim e incubar a 30 ° C, com agitação por 5-6 h, a OD600 = 0.6 - 0.8.</li>
	<li>Concentre-se em células para OD600 = 30, dispense a quatro tubos de Erlenmeyer de 50 mL e relaxar no gelo por 10 min.</li>
	<li>As células da colheita, realizando a centrifugação a 1.050 x g por 3 min a 4 ° C. Coloque os tubos e 10 electro-cubetas no gelo. Execute as etapas 7.3-7,8 no gelo.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e adicionar 15 mL de sorbitol de 1,2 M. Agite os tubos para Ressuspender as células.</li>
	<li>Centrifugar as células a 1050 x g, durante 3 min a 4 ° C.</li>
	<li>Repita os passos de 7.4 e 7.5. Desprezar o sobrenadante. Adicionar 500 µ l de sorbitol 1,2 M para cada tubo, Ressuspender as células e coletar todas as células em um tubo cônico de 15 ml.</li>
	<li>Adicionar o sorbitol 1,2 M a 2,4 mL (OD600 = 10 / 0,2 mL). Mantenha o tubo no gelo.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de células de sorbitol-suspenso (certifique-se que eles são totalmente suspensos) para um tubo novo EP contendo a fusão do PCR construir, misture bem e transferir a amostra para um electro-cubeta.</li>
	<li>Electroporate as células com as seguintes opções: fungos, ShS (2.00kV, 1 pulso).</li>
	<li>Adicionar 600 µ l de sorbitol 1,2 M para cada electro-cubeta para um volume total de 800 µ l e em seguida, espalhe as células em quatro placas Sim (200 µ l/placa). Electro-10 cubetas dispensará a 40 sim placas.</li>
	<li>Incube as placas a 30 ° C por 24 h.</li>
	<li>Executar o chapeamento de réplica para Sim + G418 e incubar as placas a 30 ° C durante 3 dias.</li>
</ol>8. seleção de heterocromatina-desestabilizando mutantes e verificação de falsos positivos
<ol><li>Para cada placa de Sim + G418, execute o chapeamento de réplica para Sim-Ade (Ade baixo) e placas de PMG-Ade (Ade n). Incube as placas réplica por 1-2 dias a 30 ° C, até algumas das colônias nas placas Sim-Ade mostram uma coloração vermelha (Figura 1).</li>
	<li>Compare placas Sim-Ade e PMG-Ade e selecione células que mostram rosa ou branco na placa sim-Ade e também crescem na placa PMG-Ade. Não selecione colônias sem crescimento na PMG-Ade, como eles são falsos positivos (por exemplo, refletindo que a gaveta de KAN foi integrada em um local não-alvo Noutras partes do genoma).</li>
	<li>Pegue aproximadamente 1 x 105 células de cada colônia e incubar em 10 µ l de solução SPZ contendo 2,5 mg/mL zymolyase 100 T a 37 ° C durante pelo menos 30 min. utilizar 1 µ l desta solução para executar como o modelo inicial para colônia PCR (Figura 1 H).<ol>
<li>Fazer SPZ (50 mL) pela mistura de 30 mL de sorbitol 2m, 4,05 mL de 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 e 15 mL de água destilada (pH final, 7,5). Amostras (5 mL) podem ser suplementadas com zymolyase e armazenadas em alíquotas de 500 µ l a-20 ° C até o uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize a eletroforese em gel (gel de agarose 1,2%, 180V, 20 min) para visualizar os resultados de + a PCR de colônia. Selecione as reações que apresentam bandas PCR de tamanho adequado e digerem 5 µ l de cada produto da reação com XhoI (4 enzima U, 1 tampão de digestão x, banho-maria a 37 ° C, 1 h) para filtrar falsos positivos (Figura 1 H).</li>
	<li>Realize a eletroforese em gel para visualizar os sumários de XhoI (gel de Agarose 1,2%, 180 V, 20 min). Marca as colônias cujos produtos PCR são cortados por XhoIe passe-os para Sim + G418 placas (Figura 1I).</li>
	<li>Isolar gDNA partir de células de levedura de fissão e realizar o sequenciamento da PCR produtos23. Compare a sequência obtida com sequência de tipo selvagem para identificar mutações (Figura 1I).</li>
	<li>Diretamente Re-Introduza o mutation(s) de células de tipo selvagem, transformando-os com construções de fusão amplificadas por PCR de células mutantes23. Use a mancha para confirmar o fenótipo nas células mutantes recém-feitos (Figura 1J).<ol>
<li>Construção de transformação de fusão pode ser facilmente amplificada por PCR com primers p1 e p10 usando o DNA genômico de mutantes como o modelo em um volume total de 50 µ l (~ 1 µ g DNA, enzima de U 20, tampão de reação 1x) e aplicando os ciclos de reação descritos no tabela 2 . Transformação da construção pode ser feita seguindo as etapas 7.1-7.13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Mutagénese aleatória através de PCR propensa é uma ferramenta poderosa para gerar um pool diversificado de mutantes em uma determinada região. Esta técnica é especialmente útil para estudos que visam avaliar a função de uma proteína em uma circunstância específica. Por exemplo, usamos aqui PCR propensa para avaliar a função da subunidade de proteossomo 19S, Rpt4, em manutenção de heterocromatina. Variando a região alvo de PCR propensa e ajustando as condições de triagem, fomos capazes de transformar c...

Genética para a frente é um método clássico em que pesquisadores buscam naturalmente mutantes que exibem um fenótipo específico e realizar análises genéticas. Em genética reversa, mutações são introduzidas em um gene de interesse e o fenótipo é examinado. Neste último caso, mutagênese aleatória de um gene alvo muitas vezes é usado para gerar um grupo de mutantes que posteriormente são selecionados para desejado fenótipos, tais como a sensibilidade à temperatura ou alterado a atividade enzimática. Podem ser utilizados vários métodos para alcançar o mutagenesis aleatório, incluindo propenso a PCR1; De irradiação UV2; mutagênicos químicos, tais como Metanossulfonato de etila (EMS) ou ácido nitroso3; o uso de cepas de modificador temporário, tais como aqueles excesso expressando mutD5 4; e DNA baralhar5.
Aqui, descrevemos uma estratégia reverso-genética em que utilizamos PCR propensa para gerar piscinas mutantes para um gene alvo no fermento a fissão. Como se pode adivinhar seu nome, este método gera mutações deliberadamente introduzindo erros durante a PCR. Ao contrário de outros métodos de mutagénese, propenso a PCR permite ao usuário definir a região a ser mutagenized. Isto o torna particularmente útil nos esforços para estudar a função de um domínio/proteína de interesse.
Para demonstrar este procedimento de mutagênese aleatória, aqui usamos o rpt4 +, que codifica a subunidade de proteossomo 19S, como exemplo. Rpt4 tem sido demonstrado que têm funções independente de proteólise em organismos que não sejam fissão fermento6,7,8,9, e um defeito na proteólise pode causar efeitos indiretos, alterando as proteínas níveis. Nós, portanto, selecionados para mutantes que desencadeou mudanças de proteólise-independente, com o objetivo de investigar a função da Proteassoma em heterocromatina.
Propenso a PCR pode ser aplicado a qualquer região do gene ajustando o local em que as primeiras demão vincular. Mutantes que apresentam a mudança fenotípica desejada podem ser identificados com repórteres apropriados. Aqui, utilizamos um repórter ade6 + inserido no Centrómero 1 exterior repetição (otr) região10. Heterocromatina constitutiva é formada nesta região11, então o repórter ade6 + é silenciado na condição de tipo selvagem; Isto é indicado por colônias vermelho10. Uma mutação que desestabiliza a heterocromatina constitutiva no Centrómero conduzirá à expressão do repórter ade6 + , que é visualizada como colônias brancas.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>Adenine sulfate</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phthalate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>Sodium molybdate dihydrate</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-myo-inositol</td><td>MP biomedicals</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, geneticin</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Enzyme reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>For site-directed mutagenesis</td></tr><tr><td>GeneMorphII Random mutagenesis Kit</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>For error-prone PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>For fusion PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq&amp;nbsp;DNA Polymerase</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>For general PCR</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velveteen square, black</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>For replica</td></tr><tr><td>Replica-plating tool</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>For replica</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Biorad</td><td>1652100&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap</td><td>Biorad</td><td>1652086&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>For fusion PCR ramp reaction&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast

Mutagénese aleatória de um gene alvo é comumente usado para identificar as mutações que produzem o fenótipo desejado. Dos métodos que podem ser usados para alcançar o mutagenesis aleatório, propenso a PCR é uma estratégia eficiente e conveniente para a geração de um pool diversificado de mutantes (i. e., uma biblioteca de mutante). Propenso a PCR é o método de escolha quando um pesquisador procura para transformar uma região pré-definidos, tais como a região da codificação de um gene, deixando outras regiões genômicas não afetado. Depois que a biblioteca mutante é amplificada por PCR propensa, isso deve ser clonado em um plasmídeo adequado. O tamanho da biblioteca gerada pelo PCR propensa é restringido pela eficiência da etapa de clonagem. No entanto, no fermento de fissão, Schizosaccharomyces pombe, passo a clonagem pode ser substituído pelo uso de uma fusão de uma etapa altamente eficiente do PCR para gerar construções para transformação. Mutantes de fenótipos desejados então podem ser selecionados usando repórteres apropriados. Aqui, descrevemos esta estratégia em detalhe, tomando como exemplo, um repórter inserido no heterocromatina centromérica.

Os mutantes Rpt4 adquiridos, seguindo os procedimentos descritos na Figura 1 podem ser analisados, avaliando as cores das colônias. As cores das colônias são vistas nas chapas de relevantes na diminuição do número de células na Figura 2. O repórter ade6 + inserido na região de heterocromatina é silenciado no selvagem-tipo e mostra vermelhas colônias em placa de Sim-Ade. Uma vez que a heterocromatina é desesta...

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Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

Este artigo descreve uma metodologia detalhada para o mutagenesis aleatório de um gene alvo no fermento de fissão. Como exemplo, temos como alvo rpt4 +, que codifica uma subunidade do proteossomo 19S e tela para as mutações que desestabilizam a heterocromatina.

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

10.6K visualizações.  Korea Advanced Institute of Science and Technology. Este artigo descreve uma metodologia detalhada para o mutagenesis aleatório de um gene alvo no fermento de fissão. Como exemplo, temos como alvo rpt4 +, que codifica uma subunidade do proteossomo 19S e tela para as mutações que desestabilizam a heterocromatina.

Vídeo: Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Genética

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biologia

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

O Processo de monstro verde para a Geração de linhagens de levedura de transporte deleções de genes múltiplos

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Isolando potencializado Hsp104 variantes usando levedura Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

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A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em

Visadas

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli

O Processo de monstro verde para a Geração de linhagens de levedura de transporte deleções de genes múltiplos

Isolando potencializado Hsp104 variantes usando levedura Proteinopathy Models

Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em