The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.

1. Aufbau der LED-Illuminator HINWEIS: Die erforderliche LED-Geräte sind in der Liste der Materialien zusammengefasst. Die gesamte LED - Setup ist klein und kann überall im Labor aufgestellt werden, obwohl wir es empfehlen , in einem dunklen Raum platziert werden 4 Lichtexposition von Würmern zu steuern. <ol><li> Schließen Sie das LED an einen Controller mit Kabel (1A, D). </li><li> Schließen Sie den Controller an einen digitalen Funktionsgenerator / Verstärker mit einem BNC - Kabel (Abbildung 1A, C, D). </li><li> Befestigen Sie die LED - Leuchte 10 cm über der Bühne einen benutzerdefinierten Halter (Abbildung 1A). HINWEIS: Es wird der Halter mit Metallteilen. </li><li> Decken Sie die LED - Beleuchtung Einrichtung teilweise, aber Wärmestau (1B) zu vermeiden, die Würmer krank macht. HINWEIS: Wir verwenden eine maßgeschneiderte Hartplastikhülle mit oben und unten offen (Abbildung 1A). Der Deckel ist für die Mutagenese selbst ist nicht erforderlich, wird aber verwendet to begrenzen unnötige Exposition des blauen Lichts in die Umgebung. Wir empfehlen nicht den LED - Setup völlig abdecken (Abbildung 1B) eine Überhitzung der Würmer zu verhindern. </li><li> Tragen Sie Laser-Schutzbrille. HINWEIS: Wir tragen Laser-Schutzbrille, weil das Licht sehr hell ist. Sonnenbrille kann auch arbeiten. </li><li> Schalten Sie den Hebel des LED-Controller auf &quot;Int.&quot; für kontinuierliche Beleuchtung (1D) und es bei 65% der maximalen Leistung (1C) eingestellt. </li><li> Verwenden Sie ein Photometer die blaue Lichtintensität auf der Bühne zu messen, wo die Würmer gestellt werden Protokoll des Herstellers verwendet wird. Das Setup gibt 2,0 mW / mm 2 unter kontinuierlicher Beleuchtung. </li></ol> 2. Blau-Licht-Behandlung HINWEIS: Verwenden Sie den Stamm CZ20310 juSi164 [pMEX-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ed3) III 4 Der Stamm ist verfügbar. am Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/). <ol><li> Pflegen Sie den His-MSOG Stamm im Dunkeln auf Standard - Nematode Wachstumsmedium (NGM) Platten mit E. coli OP50 nach einem Standardprotokoll 10,11. HINWEIS: Unter Umgebungslicht, juSi164 haltigen Stämme mit einer Mutationsrate über einer spontanen Rate 4 nicht angezeigt werden soll . Routine Stamm Durchgang einen Binokular mit einer Halogenlampe mit im Allgemeinen nicht Mutationen auch verursacht. Dennoch sollte darauf unnötige Lichteinwirkung vermieden wird, zum Beispiel mit den Stämmen in einem Standard - dunkel innerhalb Inkubator zu halten, oder Abdecken der Stämme mit Folie. Es wird empfohlen, Teilmengen des Stammes einzufrieren, nachdem es im Fall unnötige Mutationen ansammeln im Laufe der Zeit zu empfangen. </li><li> Pick - trächtige junge Erwachsene (ca. 12 h nach L4) Tiere mit einem Wurm Pick 11. HINWEIS: Die kleinen Tiere zeigen weniger mutagene Wirkung 4, während ältere Tiere niedriger Brut Größe haben können. </li><li> Schneiden Sie einen Filter paper eine 60 - mm - Platte mit 25 mm x 25 mm Vierkantloch und setzen auf eine ungeimpfte Platte (Abbildung 1E) zu passen. HINWEIS: Ein quadratisches punch verwendet werden kann, aber die Größe des Stempels muss nicht genau zu sein. </li><li> Drop 100 ul 100 mM CuCl 2 auf dem Filterpapier gleichmäßig Würmer auf der Platte innerhalb der quadratischen Öffnung zu beschränken. </li><li> Wählen Sie gewünschte Anzahl von trächtigen jungen Erwachsenen Hermaphroditen (siehe Schritt 3 für ein Beispiel) und Transfer zum Zentrum der CuCl 2 - Platte. </li><li> Tragen Laserschutzbrille. </li><li> Schalten Sie das LED und den Funktionsgenerator. </li><li> Schalten Sie den Hebel des LED-Controller zu &quot;Ext.&quot; zu steuern , es wird von dem Funktionsgenerator (Figur 1D). </li><li> Stellen Sie den Regler auf 65% der maximalen Leistung und den Funktionsgenerator als Sinuswelle, 4 Hz (1C). </li><li> Legen Sie die CuCl 2 - Platte aus Schritt 2.5 ohne Deckel auf der Bühne unter der LED (1A &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Illuminate die Tiere mit blauem Licht für 30 min. </li><li> Übertragen Sie gesund aussehende Würmer auf eine geimpfte Platte als P 0. HINWEIS: Die gewünschte Anzahl von P 0 ist abhängig von der Art des Bildschirms. Siehe Schritt 3 für ein Beispiel. Die P 0 Würmer erscheinen nach der Lichtbehandlung unkoordiniert sofort sein und wird im Laufe der Zeit zu erholen. </li><li> Halten Sie Würmer abgedeckt mit Folie in einem Inkubator oder im Dunkeln; und folgen Sie dem Standardverfahren zu beginnen , bei ihren Nachkommen 2,10 gewünschten Phänotypen Screening. </li></ol> 3. Beispiel eines Forward genetischen Screen . ANMERKUNG: Dies ist ein Beispiel für die klonale Bildschirm mit 120 haploiden Genomen zu überprüfen , ob die LED und Belastung arbeiten Abbildung 2 zeigt ein Schema des Verfahrens. <ol><li> [Day1] Nach blaues Licht Behandlung, Pick fünf gesunde Würmer auf eine NGM Platte mit OP50 als P 0, halten sie in einem 20 ° C Inkubator suchen, und lassen Sie sie Eier legen für 1d ( &#39;Day1&#39; Schild). </li><li> [Day2] Übertragung P 0 auf eine neue ausgesät Platte ( &#39;Day2&#39; Schild). </li><li> [Day3] Pick - and - Platte P 0 auf der &#39;Day2&#39; töten sie durch Verbrennen. </li><li> [Day4] 30 trächtige jungen Erwachsenen F - Pick 1 von der Platte &quot;Tag1&quot; und sie auf einzelnen Platten (30 F 1 Platten für &#39;Day1&#39;) übertragen. </li><li> [Day5] Wiederholen Sie Schritt 3.4 für die &#39;Day2&#39; Platte (30 F 1 Platten für &#39;Day2&#39;). </li><li> Prüfen Sie [Day7-9] , um die anomalen Morphologien und / oder das Verhalten von F 2 Würmer im Vergleich zum WT - Stamm (3A) unter einer Standardstereo , wenn sie erwachsen werden. Hinweis: Um eine vererbbare Mutation zeigt etwa ein Viertel der Würmer mit dem gleichen Phänotyp unter F 2 , wenn es mit hoher Penetranz rezessiv ist. Allerdings wachsen einige Mutanten können langsam und / oder Teil Penetranz zeigen. Daher ist es möglich, dass weniger als ein Viertel der Mutanten auf eine gefunden werden kannTeller. </li><li> Pick-Würmer mit sichtbaren Phänotypen individuell und überprüfen Sie die Erblichkeit des Phänotyps in der nächsten Generation. </li></ol> 4. Beispiel eines extrachromosomalen Transgene Integration <ol><li> Injizieren Sie die DNA von Interesse in CZ20310 juSi164 [pMEX-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ed3) und bereiten transgene Würmer mit einem niedrige Übertragungsrate (10-30%) nach einem Standard - Injektionsprotokoll 12,13. HINWEIS: Alternativ etablierte extrachromosomale Arrays können in die juSi164 Stämme gekreuzt werden. Um zu vermeiden , Genotypisierung für juSi164, juSi164 Heterozygoten kann als P verwendet werden 0 obwohl Effizienz könnte verringert werden. Die Genotypisierung Methode für juSi164 wird in Abschnitt 5 beschrieben. </li><li> [Day1] Saures ~ 20 transgene Tiere als P 0 mit blauem Licht wie in Schritt 2 beschrieben. HINWEIS: Weitere P 0 Würmer sind notwendig , je nach tr<html> ansmission Rate. Transgene können durch Phänotypen oder Co - Injektion Marker 12,13 identifiziert werden. </li><li> Wählen Sie 10 gesund aussehende P 0 auf einzelnen Platten, halten sie in einem 20 ° C Inkubator, und lassen Sie sie legen Eier für ein paar Tage (P 0 Platten) </li><li> Einzel aus 20 transgenen F 1 Würmer aus jeder P 0 Platte [Day4] auf einzelne Platten und lassen sie Eier legen. (20 F 1 x 10 P 0 Platten = 200 F 1 Platten insgesamt.) </li><li> [Day7] Finden F 1 Platten mit&gt; 75% F 2 mit Transgene. </li><li> Wählen Sie fünf transgenen Tiere aus dem&gt; 75% Übertragungsrate F 1 - Platten (F 2 Platten). </li><li> [Day10] Halten Sie F 2 - Platten mit 100% Übertragungsrate als potentielle integrierte Linien. </li><li> Auskreuzung die möglichen integrierten Linien ein Standardverfahren 10 mit der Mendelschen Segregation zu überprüfen und mögliche Hintergrundmutationen entfernen. </li></ol>le &quot;&gt; 5. Genotypisierung <ol><li> Lyse 20 kreuzt F 2 Würmer in Lysepuffer mit einem Standardprotokoll 14. </li><li> Führen PCR unter Verwendung der Primer für MosSCI Insertion 9, juSi164, (Tabelle 1) mit einer Annealingtemperatur von 58 ° C nach einem Standardprotokoll 14. HINWEIS: Es ist nicht notwendig , unc-119 (ed3) , weil unc-119 (ed3) durch unkoordinierte Verhalten nachgewiesen werden , zu dem Genotyp nach der Rettung von Transgen (juSi164) in den folgenden Schritte 5.4 und 5.5 zu entfernen. </li><li> Führen Sie Agarose - Gelelektrophorese 15 und die Bandgrößen (Tabelle 1) untersuchen die WT für juSi164 zu finden. </li><li> Überprüfen Sie, ob die F 2 Nachkommen Würmer aufgrund der Existenz von unc-119 (ed3) gelähmt hat. </li><li> Wenn unkoordiniert Würmer auf Schritt 5.4, einzelne mehrere nonuncoordinated Würmer alle nonuncoordinated Würmer in der nächsten Generation zu finden sind erhalten. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Hier beschreiben uns ein detailliertes Verfahren von optogenetische Mutagenese unter Verwendung von His-MSOG in der Keimbahn exprimiert und ein Beispiel für einen kleinen Maßstab vorwärts genetischen Bildschirm liefern. Im Vergleich zu Standard chemische Mutagenese weist dieses optogenetische Mutagenese Methode mehrere Vorteile. Zum einen ist es ungiftig, dadurch hält das Laborpersonal weg von giftigen chemischen Mutagenen wie EMS, ENU und Trimethylpsoralen mit ultraviolettem Licht (TMP / UV). Zweitens kann das expe...

Vorwärts genetischen Screens wurden verschiedene biologische Prozesse in Modellorganismen genetische Mutanten zu erzeugen , zu stören wie Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1 weit verbreitet. Analysen solcher Mutanten führen zur Entdeckung von funktionell wichtigen Gene und ihre Signalwege 1,2. Traditionell Mutagenese in C elegans unter Verwendung mutagener Chemikalien erreicht, Strahlung oder Transposonen 2. Chemikalien , wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS) und N - Ethyl - N -nitrosourea (ENU) sind für den Menschen giftig; gamma-Strahlen oder Ultraviolett (UV) -Strahlung Mutagenese erfordert spezielle Ausrüstung; und Transposon-aktiven Stämmen wie Mutatorstämme 3 können unnötige Mutationen während der Wartung führen. Wir haben eine einfache Ansatz entwickelt vererbbare Mutationen zu induzieren 4 eine genetisch kodierte Photosensibilisator verwendet wird . Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) können DNA 5 beschädigen.Der Mini - Singlet Sauerstoff - Generator (miniSOG) ist ein grün fluoreszierendes Protein von 106 Aminosäuren, die von der LOV (Licht, Sauerstoff und Voltage) Domäne von Arabidopsis Phototropin 2 6 entwickelt wurde. Bei Bestrahlung mit blauem Licht (~ 450 nm), miniSOG ROS erzeugt , einschließlich Singulett - Sauerstoff mit fl avin Mononukleotid als Cofaktor 6-8, die in allen Zellen vorhanden ist. Wir konstruierten eine His-Fusionsprotein durch MSOG miniSOG an den C-Terminus von Histon-72, ein C - Tagging elegans Variante von Histon 3. Wir erzeugten eine Einzelkopie - Transgen 9 His-MSOG in der Keimbahn von C. auszudrücken elegans. Unter normalen Kulturbedingungen in der Dunkelheit, die His-MSOG transgenen Würmer haben normale Brut Größe und Lebensdauer 4. Bei Bestrahlung mit blauem LED - Licht, die His-MSOG Würmer produzieren vererbbare Mutationen unter ihren Nachkommen 4. Das Spektrum der induzierten Mutationen umfasst Nukleotidänderungen, wie G: C zu T: A und G: C zu C: G, und kleine chromosome Löschungen 4. Dieses Mutagenese Verfahren ist einfach durchzuführen und erfordert nur minimale Laborsicherheit Setup. Hier beschreiben wir die LED-Beleuchtung Einrichtung und Verfahren für optogenetische Mutagenese.

<table><tbody><tr><td>Ultra High Power LED light source</td><td>Prizmatix</td><td>UHP-mic-LED-460</td><td>460 &amp;plusmn; 5 nm</td></tr><tr><td>LED controller</td><td>Prizmatix</td><td>UHPLCC-01</td><td></td></tr><tr><td>Digital function generator/amplifier</td><td>PASCO</td><td>PI-9587C</td><td>PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.</td></tr><tr><td>BNC cable male/male</td><td>THORLABS</td><td>CA3136</td><td></td></tr><tr><td>USB-TTL interface</td><td>Prizmatix</td><td></td><td>Optional</td></tr><tr><td>Photometer</td><td>THORLABS</td><td>PM50 and Model D10MM</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate</td><td></td><td></td><td>Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 &amp;micro;g/mL cholesterol in 1 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. After autoclaving, add 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(pH 6.0).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lysis solution</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 100 &amp;micro;g/mL Proteinase K</td></tr></tbody></table>

optogenetic random mutagenesis using histone-minisog in c. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Wir führten eine vorwärts genetischen Bildschirm mit CZ20310 juSi164 unc-119 (ed3) 30 min Belichtung mit nach dem Standardprotokoll in den Abschnitten 2 und 3 unter 60 F 1 Platten bis 120 mutagenisiert haploide Genome entspricht, fanden wir 8 F 1 Platten mit F 2 Würmer sichtbar Phänotypen wie Körpergröße Defekt (3B), unkoordinierte Bewegung (3C) und Erwachsenen Letalität (3D) angezeigt wi...

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Optogenetische Zufallsmutagenese mit Histon-miniSOG in C. elegans | Genetik | Video

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetisch kodierte Histon-miniSOG induziert genomweite vererbbare Mutationen in einem blauen Licht abhängig. Diese Mutagenese-Methode ist einfach, schnell, frei von giftigen Chemikalien und gut geeignet für vorwärts genetisches Screening und Transgen-Integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

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Serie: Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Gezielt<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Forschung

Genetik

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Entwicklungsbiologie

Epigenetische Vererbung und ChIP bei Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through factors such as non-coding RNAs and chromatin modifications. The phenomenon of RNA interference (RNAi) inheritance in the nematode Caenorhabditis elegans is an effective model to investigate TEI that takes advantage of this model organism's short life cycle, self-propagation, and transparency. In RNAi inheritance, exposure of animals to RNAi leads to gene silencing and altered chromatin signatures at the target locus that persist for multiple generations in the absence of the initial trigger. This protocol describes the analysis of RNAi inheritance in C. elegans using a germline-expressed nuclear green fluorescent protein (GFP) reporter. Reporter silencing is initiated by feeding the animals bacteria expressing double-stranded RNA targeting GFP. At each generation, animals are passaged to maintain synchronized development, and reporter gene silencing is determined by microscopy. At select generations, populations are collected and processed for chromatin immunoprecipitation (ChIP)-quantitative polymerase chain reaction (qPCR) to measure histone modification enrichment at the GFP reporter locus. This protocol for studying RNAi inheritance can be easily modified and combined with other analyses to further investigate TEI factors in small RNA and chromatin pathways.

Autor im Rampenlicht: RNAi-Vererbung und ChIP in C. elegans 

This protocol describes an RNA interference and ChIP assay to study the epigenetic inheritance of RNAi-induced silencing and associated chromatin modifications in C. elegans.

Analyse der transgenerationalen epigenetischen Vererbung in C. elegans mittels Fluoreszenzreporter und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Neurowissenschaften

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or identification of new ones can provide invaluable information about the function of a protein of interest. Some of the traditional methods for extract preparation frequently require labor-intensive and time-consuming techniques. Here, a modified extract preparation protocol using a bead mill homogenizer and metal beads is described as a rapid alternative to traditional protein preparation methods. This extract preparation method is compatible with downstream co-immunoprecipitation studies. As an example, the method was used to successfully co-immunoprecipitate&#160;C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 and two known ALG-1 interactors: AIN-1, and HRPK-1. This protocol includes descriptions of animal sample collection, extract preparation, extract clarification, and protein immunoprecipitation. The described protocol can be adapted to test for interactions between any two or more endogenous, endogenously tagged, or overexpressed C. elegans proteins in a variety of genetic backgrounds.

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

This method describes a protocol for high-throughput protein extract preparation from Caenorhabditis elegans samples and subsequent co-immunoprecipitation.

Proteinextrakt-Präparation und Co-Immunpräzipitation von Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in

Zusammenfassung

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Gezielt

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Analyse der transgenerationalen epigenetischen Vererbung in C. elegans mittels Fluoreszenzreporter und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Analyse der transgenerationalen epigenetischen Vererbung in C. elegans mittels Fluoreszenzreporter und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Analyse der transgenerationalen epigenetischen Vererbung in C. elegans mittels Fluoreszenzreporter und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während

Proteinextrakt-Präparation und Co-Immunpräzipitation von Caenorhabditis elegans

An Introduction to Worm Lab: von Kultivierung Worms zu Mutagenese