Name: virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
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Herr wurde durch ein Stipendium von der dänischen Krebsgesellschaft (R146-A9394-16-S2) finanziert. MFB und MKT wurden durch AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8) finanziert. Herr und MFB wurden von Graduate School, Gesundheit, AU mitfinanziert. Das E.F.W. Labor wird unterstützt durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wirtschaft (SAF2015-70857, mitfinanziert von der EFRE-EU) und eine ERC advanced Grant (741888 - CSI-Fun).
Wir wollen danken Liliana Fajardo Mellor (Gene, Entwicklung und Krankheit; National Cancer Research Center) für kritische Lektüre des Manuskripts.

Dieses Protokoll beinhaltet einen chirurgischen Eingriff bei Labormäusen. Alle Tierversuche müssen einzeln überprüft und genehmigt durch eine institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC). Gewährleisten Sie der Ansatz basiert auf tierische Erholung und überleben, geeignete Anästhesie, Schmerztherapie und eine aseptische op-Umgebung jederzeit. Verwenden Sie ein Heizkissen, um Unterkühlung während der Operation und bis zur Genesung aus der Narkose zu verhindern.
1. ausgehend von Überlegungen
<ol><li>Abhängig von dem Virus verwendet gelten andere Titer Anforderungen; Das Virus entsprechend zu verdünnen. Hinweis: In diesem Beispiel wird eine Adeno-assoziierten Virus in PBS verdünnt auf einen Titer von 1 x 1012 IU/mL injiziert. Das Virus hat Serotyp 9 und enthält Anleitung RNA Pten und Expression von Cre-Protein unter eine Ubiquitin-Promotor (Abbildung 1). Verlust von Pten pAKT und Verbreitung der prostatischen Epithel13erhöht.</li>
	<li>Verwenden Sie männliche Mäuse im Alter von 8 Wochen zum Zeitpunkt der Operation, um angemessene Prostata Entwicklung sicherzustellen. Hinweis: In diesem Experiment gezeigt-Mäuse sind Rosa26-LSL-Cas9-EGFP Profi Mäuse C57BL/6J Hintergrund12 (Abbildung 1).</li>
	<li>Einen Vollnarkose-Mix frisch zubereiten und möglichst steril halten. Hinweis: Für bessere Tier Erholung nach der Operation, ist Gegengift Narkose empfohlen.<ol>
<li>Um ein Gesamtvolumen von 5 mL Narkose vorzubereiten, mischen Sie 0,15 mL Medetomidine Hydrochlorid (1 mg/mL), 0,4 mL Midazolam (5 mg/mL) und 0,25 mL Butorphanol (10 mg/mL) mit 4,2 mL steriles salzhaltigem Wasser. Hinweis: Alternative Anästhesie Methoden, z. B. Inhalierbare Isofluran können nach den institutionellen Tierpflege-Richtlinien verwendet werden.</li>
		<li>Um die Wirkung der Medetomidine Hydrochlorid postoperative stornieren, mischen Sie 0,1 mL Atipamezol (5 mg/mL) mit 4,9 mL steriles Kochsalzlösung Wasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine aseptische op-Umgebung durch ordnungsgemäße Desinfektion und Sterilisation. Autoklaven chirurgische Instrumente vor Gebrauch.</li>
</ol>(2) Virus-Lieferung an der murinen Prostata
<ol><li>Betäuben Sie das Tier durch intraperitoneale Injektion mit einer sterilen 1 mL Spritze und Nadel 27 x ½". Verwenden Sie eine Narkose-Dosis von 0,01 mL/g Körpergewicht. Dauert das Verfahren länger als 30 min, pflegen Betäubung durch Einspritzen von 1/3 der ersten Dosis alle 30 Minuten.</li>
	<li>Prüfen Sie die Narkose Tiefe durch die Bewertung, Muskelentspannung, Pedal Rückzug und palpebrale Reflexe. Wenn Verlust der Reflexe beobachtet wird, rasieren des unteren Bauches des Tieres.</li>
	<li>Decken Sie das Tier Augen sorgfältig mit tierärztliche Augenheilkunde Salbe mit einem sterilen Wattestäbchen gegen Blindheit aufgrund mangelnder Hornhaut Reflex ab.</li>
	<li>Wischen Sie den rasierten Bauch mit 70 % Ethanol und 10 % Povidon-Jod zu desinfizieren den OP-Bereich. Schrubben Sie den OP-Bereich von der Mitte des OP-Bereich in Richtung der Peripherie.</li>
	<li>Führen Sie einen vertikalen Hautschnitt an der niedrigen Bauch Mittellinie von ca. 1 cm mit einer sterilen chirurgischen Schere.</li>
	<li>Heben Sie das Bauchfell mit einer feinen Spitze Pinzette, damit die Organe, die unter Verlegung sind nicht beschädigt. Machen Sie vorsichtig einen < 8 mm Einschnitt mit einer chirurgischen Schere durch das Peritoneum. Hinweis: Im Gegensatz zu Menschen, ein Nagetier Prostata umfasst vier separate Lappen. Der vordere Lappen ist der Samenblase beigefügt.</li>
	<li>Sanft bewegen das Fettgewebe beiseite, fruchtbaren Vesicle aufzudecken. Heben Sie vorsichtig mit einer Pinzette Ring der Samenblase bis die vordere Prostata kann identifiziert (Abbildung 1).</li>
	<li>Injizieren Sie ein Gesamtvolumen von 30 µL Virus (3 x 1010 Viruspartikel) Lösung in der vorderen Prostata Epithel mit einer 0,5 mL Insulin Spritze mit einer Nadel 30 x 8 mm. Minimieren Sie Leckage zu und sicherzustellen Sie, dass die Flüssigkeit im Gewebe, bilden eine kleine Blase absorbiert wird. Legen Sie die Samenblase zurück in die Bauchhöhle.</li>
	<li>Das Bauchfell mit 2-3 einfache unterbrochenen Nähten mit 6-0 resorbierbaren Fäden mit einer 13 mm, 3/8 Kreis und einer konischen Punkt Nadel Naht.</li>
	<li>Heften Sie die Haut mit 3 sterile 4,8 x 6,5 mm-Clips Anheben der Haut mit einer Pinzette zu beschädigen das Bauchfell.</li>
	<li>Bessere Erholung beantragen Sie die Anästhesie Gegenmittel in einer Dosis von 0,01 mL/g Körpergewicht durch intraperitoneale Injektion mit einer sterilen 1 mL Spritze und Nadel 27 x ½". Legen Sie vorsichtig die Tiere zurück in seinen Käfig.</li>
</ol>3. postoperative Verfahren
<ol><li>Halten Sie den Käfig mit Mäusen, die operiert auf ein Heizkissen für 1 h nach dem Eingriff, um Unterkühlung bis vollständig erholt zu verhindern. Wenn das Gegenmittel angewendet wird, sollte das Tier werden wach wenige Minuten nach der Injektion.</li>
	<li>Beobachten Sie die Tiere täglich für entsprechende Wunde heilen und Schmerzen Indikationen. Bei Bedarf verwalten Sie zusätzliche Schmerzmittel nach institutionellen Tierbetreuung Richtlinien.</li>
	<li>Entfernen Sie Haut Clips nach 4-5 Tagen, sobald die Wunde geschlossen ist.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+transgenesis:+an+overview.">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis.">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis.">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li><li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus.">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+JUNB/AP-1+promotes+invasive+prostate+cancer.">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy,+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis.">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome.">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer.">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer.">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li><li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer.">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate.">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li><li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+prostate:+an+historical+survey+of+divergent+views.">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation.">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode um die Genexpression in der vorderen Lappen der murinen Prostata durch Virus Injektion zu ändern, erstellen ein leistungsfähiges neues Mausmodell für Prostatakrebs (Abbildung 2). Die erfolgreiche Verwaltung eines Adenovirus wurde erstmals von Leow Et Al. 20058beschrieben. Wir haben bereits gezeigt, wie ein Adenovirus-Codierung für eine Cre-Rekombinase-Protein zeitraubende Kreuzung eine Cre-Allel für gewebe...

Erkennung und Behandlung von Prostatakrebs haben in den letzten zehn Jahren deutlich verbessert. Dennoch steigt die Inzidenz von Prostatakrebs nach Lebenserwartung. Mit schätzungsweise 1,1 Millionen neue Fälle weltweit gehört er zu den häufigsten Ursachen für krebsbedingte Todesursache bei Männern 1. Prostatakrebs ist in seiner Entwicklung langsam, aber wenn der Krebs in einem fortgeschrittenen metastasierten Stadium fortgeschritten ist, die Prognose ist schlecht aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Bisher nur wenige Gene wurden als gemeinsame Treiber in diesem Krebs identifiziert und ihre Heterogenität und Multifocality behindert Nachweis von Biomarkern und Aktionsleisten Krankheit Treiber2,3.
Klassische Techniken der Erzeugung von GEMMs werden durch ihre Komplexität, rechtzeitige Aufwendungen und Kosten oft beeinträchtigt. Bedingte ko-Modelle wurden weithin zur Prostatakrebs Kandidatengene, studieren, die embryonale Tödlichkeit, wenn in der Keimbahn4inaktiviert führen. Alle gängigen Modelle beinhalten eine Prostata-spezifisches-Cre-Rekombinase angetrieben entweder durch eine modifizierte Probasin5 oder integriert in die GEMM durch zusätzliche Kreuzungszüchtung PSA6 Förderer. In diesen Modellen wird das Gen des Interesses gezielt in der Mehrzahl der epithelialen Zellen der Prostata, Erzeugung von Hyperplasie in das ganze Organ, das das Tier Harnwege Funktion7beeinträchtigen kann.
Virale Lieferung des Cre-Proteins durch Injektion in den vorderen Lappen der murinen Prostata kann dieses Problem beheben, indem Sie nur auf ein paar Zellen8. Unter Berücksichtigung Labors technische Voraussetzungen, Know-how und Ziele der Methode profitiert eine Vielzahl von Variationsmöglichkeiten. Erfolgreiche Ansätze nutzen Adenovirus Ausrichtung auf JunB und Pten9 oder Lentivirus targeting Pten und Trp5310 wurden unter anderem gezeigt. Transgene wie Luciferase, das virale Konstrukt oder die GEMM hinzugefügt ermöglicht außerdem nicht-invasive Überwachung des Fortschreitens der Krankheit über Biolumineszenz imaging11.
Genom-Bearbeitung auf der CRISPR/Cas9-Technologie basiert, zeigt eine neue und schnelle Möglichkeit, Krebs durch schnelle Generierung von somatischen Knockouts12zu studieren. Virale Lieferung von einzelnen Guide RNAs (SgRNAs) an der vorderen Lappen der murinen Prostata gerichtet schafft ein physiologisch relevanter Modell von Prostata-Krebs. Auf diese Weise können Einzelzellen mit ausgewählten Mutationen Klone bilden, die in der Lage sind der Ausbau und die Invasion. Darüber hinaus generiert Verwendung des Guide RNAs für mehrere Zielgene zellklonen mit Veränderungen in verschiedenen Genen. Tumor Heterogenität und einer natürlichen Selektionsdruck wird auf Tumorprogression, dadurch die Bedeutung der einzelnen Gen Veränderung oder epistatic Mechanismen aufdecken können.
Hier präsentieren wir eine Methode um Viruspartikel an der murinen Prostata für Änderung der Genexpression zu liefern. Durch einen kleinen Bauchschnitt der murine anteriore Prostate Lappen ist ausgesetzt und virale Partikel in der Lappen eingespritzt werden. Fünf Tage nach der Operation, chirurgische Clips aus der Haut entfernt werden können und der Prostata Krebs ab 8 Wochen nach analysiert werden kann. Insgesamt ist dies eine schnelle und kostengünstige Verfahren, das hat wenig Einfluss auf die Maus und ermöglicht größere Tumor zu entwickeln, ohne Kompromisse bei der Maus.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh&lt;/sup&gt;/J mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td><td>BD</td><td>324825</td><td>for virus injection</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>300013</td><td>for anesthesia injection</td></tr><tr><td>30 G 1/2&#039;&#039; needle</td><td>BD</td><td>304000</td><td>for anesthesia injection</td></tr><tr><td>6-0 Polysorb Suture</td><td>Medtronic</td><td>GL889</td><td>to close the peritoneum</td></tr><tr><td>Disposable sterilized surgery drape</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Prep Pad</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>Trimming machine</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>to shave the abdomen</td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Halsey Micro Needle Holder</td><td>F.S.T</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>F.S.T</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Narrow Pattern Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Ring Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td><td>F.S.T</td><td>12030-01</td><td>to close the skin</td></tr><tr><td>Wound Clip System Remover</td><td>F.S.T</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>different models have been used</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Butorphanol</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Medetomidinhydrochlorid</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>Virus (AAV, AV)</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td>virus used in this protocol is an in-house production</td></tr><tr><td>pAKT antibody</td><td>CST</td><td>4060</td><td>used 1:200 dillution</td></tr><tr><td>GFP anitbody</td><td>CST</td><td>2956</td><td>used 1:100 dillution</td></tr></tbody></table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

Mit einer steigenden Inzidenz von Prostatakrebs ist die Identifizierung der Tumor Fahranfänger oder Modulatoren entscheidend. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMM) für Prostatakrebs sind durch Tumor Heterogenität und seine komplexe Mikroevolution Dynamik erschwert. Traditionelle Prostatakrebs-Maus-Modellen gehören unter anderem Keimbahn und bedingte Knockouts, transgene Ausdruck der Onkogene und Xenograft-Modelle. Generation von de Novo Mutationen in diesen Modellen ist komplex, zeitaufwändig und kostspielig. Darüber hinaus zielen die meisten traditionellen Modelle den Großteil der Prostata Epithel, während menschlichen Prostata-Krebs ist bekannt als ein isoliertes Ereignis in nur eine kleine Teilmenge von Zellen zu entwickeln. Wertvolle Modelle müssen jedoch nicht nur Prostatakrebs Einleitung auch Progression zu fortgeschrittener Erkrankung zu simulieren.
Hier beschreiben wir eine Methode, um ein paar Zellen in der Prostata Epithel durch 3D-Steuerung Zellen nach Viruspartikel zu adressieren. Die Lieferung eines veränderter Virus an der murinen Prostata ermöglicht Änderung der Genexpression in der Prostata Epithelien. Virus-Typ und die Menge werden hiermit die Anzahl der Zellen zielgerichtet für gen-Änderung definieren, indem transducing ein paar für Krebs Einleitung und viele Zellen für die Gentherapie. Durch Chirurgie-basierte Injektion in die vorderen Lappen, distale aus dem Harn Track kann der Tumor in diesem Modell erweitern, ohne Beeinträchtigung der harnfunktion des Tieres. Darüber hinaus durch die Ausrichtung auf nur eine Teilmenge der epithelialen Zellen der Prostata die Technik ermöglicht klonalen Expansion des Tumors und daher imitiert menschliche Tumorentstehung sowie Verlauf und Invasion durch die Basalmembran.
Diese neuartige Technik bietet eine leistungsstarke Prostatakrebs Modell verbesserte physiologische Relevanz. Leiden der Tiere ist begrenzt, und da keine zusätzliche Zucht erforderlich ist, insgesamt tierischen Graf wird reduziert. Zur gleichen Zeit wird Analyse neue Kandidatengene und Wege beschleunigt, die wiederum ist kostengünstiger.

Virus-Lieferung an der murinen Prostata zu bewerten, wurden Proben analysiert, drei Monate nach der Operation. Die Rosa26-LSL-Cas9-EGFP-Mäusen12 express GFP in Zellen, die Cre Protein ausgedrückt durch das Virus ausgesetzt gewesen. Die Prostata Proben untersucht mit einem Fluoreszenz-Mikroskopie, Bereiche mit GFP Signal (Abb. 2A) zu identifizieren. Die GFP-Signal zeigt Kre-Aktivität in der Prostata Epithel aber nicht ob gen Bearbeit...

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Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Dieses Protokoll beschreibt eine neu gegründete Methode für Virus-Lieferung an der murinen Prostata. Mit CRISPR/Cas9 Technologie, Überexpression des Gens oder Cre-Rekombinase-Lieferung, die Technik erlaubt orthotopen Veränderung der Genexpression und implementiert eine neue Maus-Modell für Prostatakrebs.

Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.6K Aufrufe.  Aarhus University. Dieses Protokoll beschreibt eine neu gegründete Methode für Virus-Lieferung an der murinen Prostata. Mit CRISPR/Cas9 Technologie, Überexpression des Gens oder Cre-Rekombinase-Lieferung, die Technik erlaubt orthotopen Veränderung der Genexpression und implementiert eine neue Maus-Modell für Prostatakrebs.

Serie: Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to assess therapeutic avenues. However, their time-, labor- and cost-intensive nature limits their utility for systematic analysis of gene function. Recent advances in genome-editing technologies overcome those limitations and allow for the rapid generation of specific gene perturbations directly within specific mouse organs in a multiplexed and rapid manner. Here, we describe a CRISPR/Cas9-based method (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) to generate thousands of gene knock-out clones within the epithelium of the skin and oral cavity of mice, and provide a protocol detailing the steps necessary to perform a direct&#160;in vivo&#160;CRISPR&#160;screen for tumor suppressor genes. This approach can be applied to other organs or other CRISPR/Cas9 technologies such as CRISPR-activation or CRISPR-inactivation to study the biological function of genes during tissue homeostasis or in various disease settings.

Here we describe a rapid and direct in vivo CRISPR/Cas9 screening methodology using ultrasound-guided in utero embryonic lentiviral injections to simultaneously assess functions of several genes in the skin and oral cavity of immunocompetent mice.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Forschung

Genetik

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Entwicklungsbiologie

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

The CRISPR/Cas9 system offers the potential to make targeted genome editing accessible and affordable to the scientific community. This protocol is intended to demonstrate how to create viruses that will knockout a gene of interest using the CRISPR/Cas9 system, and then inject them stereotaxically into the adult mouse brain.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Neurowissenschaften

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Immunologie und Infektion

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Medizin

<meta charset="utf8"></head><body>Retrovirale Transduktion von Guide-RNA zur Geneditierung bei der Th17-Differenzierung

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Biologie

Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles ("Nanoblades")

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system has democratized genome-editing in eukaryotic cells and led to the development of numerous innovative applications. However, delivery of the Cas9 protein and single-guide RNA (sgRNA) into target cells can be technically challenge. Classical viral vectors, such as those derived from lentiviruses (LVs) or adeno-associated viruses (AAVs), allow for efficient delivery of transgenes coding for the Cas9 protein and its associated sgRNA in many primary cells and in vivo. Nevertheless, these vectors can suffer from drawbacks such as integration of the transgene in the target cell genome, a limited cargo capacity, and long-term expression of the Cas9 protein and guide RNA in target cells.
To overcome some of these problems, a delivery vector based on the murine Leukemia virus (MLV) was developed to package the Cas9 protein and its associated guide RNA in the absence of any coding transgene. By fusing the Cas9 protein to the C-terminus of the structural protein Gag from MLV, virus-like particles (VLPs) loaded with the Cas9 protein and sgRNA (named &#34;Nanoblades&#34;) were formed. Nanoblades can be collected from the culture medium of producer cells, purified, quantified, and used to transduce target cells and deliver the active Cas9/sgRNA complex. Nanoblades deliver their ribonucleoprotein (RNP) cargo transiently and rapidly in a wide range of primary and immortalized cells and can be programmed for other applications, such as transient transcriptional activation of targeted genes, using modified Cas9 proteins. Nanoblades are capable of in vivo genome-editing in the liver of injected adult mice and in oocytes to generate transgenic animals. Finally, they can be complexed with donor DNA for &#34;transfection-free&#34; homology-directed repair. Nanoblade preparation is simple, relatively low-cost, and can be easily carried out in any cell biology laboratory.

Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles "Nanoblades"

We have developed a simple and inexpensive protocol to load Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoprotein complexes within virus-like particles. These particles, called "Nanoblades", allow efficient delivery of the Cas9/sgRNA complex in immortalized and primary cells as well as in vivo.

Abgabe des Cas9/sgRNA Ribonukleoprotein-Komplexes in Immortalisierte und Primärzellen über virusähnliche Partikel ("Nanoblades")

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system has democratized genome-editing in eukaryotic cells and led to the ...

Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung

Zusammenfassung

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In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Abgabe des Cas9/sgRNA Ribonukleoprotein-Komplexes in Immortalisierte und Primärzellen über virusähnliche Partikel ("Nanoblades")