Herr wurde durch ein Stipendium von der dänischen Krebsgesellschaft (R146-A9394-16-S2) finanziert. MFB und MKT wurden durch AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8) finanziert. Herr und MFB wurden von Graduate School, Gesundheit, AU mitfinanziert. Das E.F.W. Labor wird unterstützt durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wirtschaft (SAF2015-70857, mitfinanziert von der EFRE-EU) und eine ERC advanced Grant (741888 - CSI-Fun).
Wir wollen danken Liliana Fajardo Mellor (Gene, Entwicklung und Krankheit; National Cancer Research Center) für kritische Lektüre des Manuskripts.

Dieses Protokoll beinhaltet einen chirurgischen Eingriff bei Labormäusen. Alle Tierversuche müssen einzeln überprüft und genehmigt durch eine institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC). Gewährleisten Sie der Ansatz basiert auf tierische Erholung und überleben, geeignete Anästhesie, Schmerztherapie und eine aseptische op-Umgebung jederzeit. Verwenden Sie ein Heizkissen, um Unterkühlung während der Operation und bis zur Genesung aus der Narkose zu verhindern.
1. ausgehend von Überlegungen
<ol><li>Abhängig von dem Virus verwendet gelten andere Titer Anforderungen; Das Virus entsprechend zu verdünnen. Hinweis: In diesem Beispiel wird eine Adeno-assoziierten Virus in PBS verdünnt auf einen Titer von 1 x 1012 IU/mL injiziert. Das Virus hat Serotyp 9 und enthält Anleitung RNA Pten und Expression von Cre-Protein unter eine Ubiquitin-Promotor (Abbildung 1). Verlust von Pten pAKT und Verbreitung der prostatischen Epithel13erhöht.</li>
	<li>Verwenden Sie männliche Mäuse im Alter von 8 Wochen zum Zeitpunkt der Operation, um angemessene Prostata Entwicklung sicherzustellen. Hinweis: In diesem Experiment gezeigt-Mäuse sind Rosa26-LSL-Cas9-EGFP Profi Mäuse C57BL/6J Hintergrund12 (Abbildung 1).</li>
	<li>Einen Vollnarkose-Mix frisch zubereiten und möglichst steril halten. Hinweis: Für bessere Tier Erholung nach der Operation, ist Gegengift Narkose empfohlen.<ol>
<li>Um ein Gesamtvolumen von 5 mL Narkose vorzubereiten, mischen Sie 0,15 mL Medetomidine Hydrochlorid (1 mg/mL), 0,4 mL Midazolam (5 mg/mL) und 0,25 mL Butorphanol (10 mg/mL) mit 4,2 mL steriles salzhaltigem Wasser. Hinweis: Alternative Anästhesie Methoden, z. B. Inhalierbare Isofluran können nach den institutionellen Tierpflege-Richtlinien verwendet werden.</li>
		<li>Um die Wirkung der Medetomidine Hydrochlorid postoperative stornieren, mischen Sie 0,1 mL Atipamezol (5 mg/mL) mit 4,9 mL steriles Kochsalzlösung Wasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine aseptische op-Umgebung durch ordnungsgemäße Desinfektion und Sterilisation. Autoklaven chirurgische Instrumente vor Gebrauch.</li>
</ol>(2) Virus-Lieferung an der murinen Prostata
<ol><li>Betäuben Sie das Tier durch intraperitoneale Injektion mit einer sterilen 1 mL Spritze und Nadel 27 x ½". Verwenden Sie eine Narkose-Dosis von 0,01 mL/g Körpergewicht. Dauert das Verfahren länger als 30 min, pflegen Betäubung durch Einspritzen von 1/3 der ersten Dosis alle 30 Minuten.</li>
	<li>Prüfen Sie die Narkose Tiefe durch die Bewertung, Muskelentspannung, Pedal Rückzug und palpebrale Reflexe. Wenn Verlust der Reflexe beobachtet wird, rasieren des unteren Bauches des Tieres.</li>
	<li>Decken Sie das Tier Augen sorgfältig mit tierärztliche Augenheilkunde Salbe mit einem sterilen Wattestäbchen gegen Blindheit aufgrund mangelnder Hornhaut Reflex ab.</li>
	<li>Wischen Sie den rasierten Bauch mit 70 % Ethanol und 10 % Povidon-Jod zu desinfizieren den OP-Bereich. Schrubben Sie den OP-Bereich von der Mitte des OP-Bereich in Richtung der Peripherie.</li>
	<li>Führen Sie einen vertikalen Hautschnitt an der niedrigen Bauch Mittellinie von ca. 1 cm mit einer sterilen chirurgischen Schere.</li>
	<li>Heben Sie das Bauchfell mit einer feinen Spitze Pinzette, damit die Organe, die unter Verlegung sind nicht beschädigt. Machen Sie vorsichtig einen < 8 mm Einschnitt mit einer chirurgischen Schere durch das Peritoneum. Hinweis: Im Gegensatz zu Menschen, ein Nagetier Prostata umfasst vier separate Lappen. Der vordere Lappen ist der Samenblase beigefügt.</li>
	<li>Sanft bewegen das Fettgewebe beiseite, fruchtbaren Vesicle aufzudecken. Heben Sie vorsichtig mit einer Pinzette Ring der Samenblase bis die vordere Prostata kann identifiziert (Abbildung 1).</li>
	<li>Injizieren Sie ein Gesamtvolumen von 30 µL Virus (3 x 1010 Viruspartikel) Lösung in der vorderen Prostata Epithel mit einer 0,5 mL Insulin Spritze mit einer Nadel 30 x 8 mm. Minimieren Sie Leckage zu und sicherzustellen Sie, dass die Flüssigkeit im Gewebe, bilden eine kleine Blase absorbiert wird. Legen Sie die Samenblase zurück in die Bauchhöhle.</li>
	<li>Das Bauchfell mit 2-3 einfache unterbrochenen Nähten mit 6-0 resorbierbaren Fäden mit einer 13 mm, 3/8 Kreis und einer konischen Punkt Nadel Naht.</li>
	<li>Heften Sie die Haut mit 3 sterile 4,8 x 6,5 mm-Clips Anheben der Haut mit einer Pinzette zu beschädigen das Bauchfell.</li>
	<li>Bessere Erholung beantragen Sie die Anästhesie Gegenmittel in einer Dosis von 0,01 mL/g Körpergewicht durch intraperitoneale Injektion mit einer sterilen 1 mL Spritze und Nadel 27 x ½". Legen Sie vorsichtig die Tiere zurück in seinen Käfig.</li>
</ol>3. postoperative Verfahren
<ol><li>Halten Sie den Käfig mit Mäusen, die operiert auf ein Heizkissen für 1 h nach dem Eingriff, um Unterkühlung bis vollständig erholt zu verhindern. Wenn das Gegenmittel angewendet wird, sollte das Tier werden wach wenige Minuten nach der Injektion.</li>
	<li>Beobachten Sie die Tiere täglich für entsprechende Wunde heilen und Schmerzen Indikationen. Bei Bedarf verwalten Sie zusätzliche Schmerzmittel nach institutionellen Tierbetreuung Richtlinien.</li>
	<li>Entfernen Sie Haut Clips nach 4-5 Tagen, sobald die Wunde geschlossen ist.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+transgenesis:+an+overview.">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis.">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis.">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li><li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus.">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+JUNB/AP-1+promotes+invasive+prostate+cancer.">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy,+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis.">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome.">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer.">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer.">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li><li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer.">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate.">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li><li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+prostate:+an+historical+survey+of+divergent+views.">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation.">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode um die Genexpression in der vorderen Lappen der murinen Prostata durch Virus Injektion zu ändern, erstellen ein leistungsfähiges neues Mausmodell für Prostatakrebs (Abbildung 2). Die erfolgreiche Verwaltung eines Adenovirus wurde erstmals von Leow Et Al. 20058beschrieben. Wir haben bereits gezeigt, wie ein Adenovirus-Codierung für eine Cre-Rekombinase-Protein zeitraubende Kreuzung eine Cre-Allel für gewebe...

Erkennung und Behandlung von Prostatakrebs haben in den letzten zehn Jahren deutlich verbessert. Dennoch steigt die Inzidenz von Prostatakrebs nach Lebenserwartung. Mit schätzungsweise 1,1 Millionen neue Fälle weltweit gehört er zu den häufigsten Ursachen für krebsbedingte Todesursache bei Männern 1. Prostatakrebs ist in seiner Entwicklung langsam, aber wenn der Krebs in einem fortgeschrittenen metastasierten Stadium fortgeschritten ist, die Prognose ist schlecht aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Bisher nur wenige Gene wurden als gemeinsame Treiber in diesem Krebs identifiziert und ihre Heterogenität und Multifocality behindert Nachweis von Biomarkern und Aktionsleisten Krankheit Treiber2,3.
Klassische Techniken der Erzeugung von GEMMs werden durch ihre Komplexität, rechtzeitige Aufwendungen und Kosten oft beeinträchtigt. Bedingte ko-Modelle wurden weithin zur Prostatakrebs Kandidatengene, studieren, die embryonale Tödlichkeit, wenn in der Keimbahn4inaktiviert führen. Alle gängigen Modelle beinhalten eine Prostata-spezifisches-Cre-Rekombinase angetrieben entweder durch eine modifizierte Probasin5 oder integriert in die GEMM durch zusätzliche Kreuzungszüchtung PSA6 Förderer. In diesen Modellen wird das Gen des Interesses gezielt in der Mehrzahl der epithelialen Zellen der Prostata, Erzeugung von Hyperplasie in das ganze Organ, das das Tier Harnwege Funktion7beeinträchtigen kann.
Virale Lieferung des Cre-Proteins durch Injektion in den vorderen Lappen der murinen Prostata kann dieses Problem beheben, indem Sie nur auf ein paar Zellen8. Unter Berücksichtigung Labors technische Voraussetzungen, Know-how und Ziele der Methode profitiert eine Vielzahl von Variationsmöglichkeiten. Erfolgreiche Ansätze nutzen Adenovirus Ausrichtung auf JunB und Pten9 oder Lentivirus targeting Pten und Trp5310 wurden unter anderem gezeigt. Transgene wie Luciferase, das virale Konstrukt oder die GEMM hinzugefügt ermöglicht außerdem nicht-invasive Überwachung des Fortschreitens der Krankheit über Biolumineszenz imaging11.
Genom-Bearbeitung auf der CRISPR/Cas9-Technologie basiert, zeigt eine neue und schnelle Möglichkeit, Krebs durch schnelle Generierung von somatischen Knockouts12zu studieren. Virale Lieferung von einzelnen Guide RNAs (SgRNAs) an der vorderen Lappen der murinen Prostata gerichtet schafft ein physiologisch relevanter Modell von Prostata-Krebs. Auf diese Weise können Einzelzellen mit ausgewählten Mutationen Klone bilden, die in der Lage sind der Ausbau und die Invasion. Darüber hinaus generiert Verwendung des Guide RNAs für mehrere Zielgene zellklonen mit Veränderungen in verschiedenen Genen. Tumor Heterogenität und einer natürlichen Selektionsdruck wird auf Tumorprogression, dadurch die Bedeutung der einzelnen Gen Veränderung oder epistatic Mechanismen aufdecken können.
Hier präsentieren wir eine Methode um Viruspartikel an der murinen Prostata für Änderung der Genexpression zu liefern. Durch einen kleinen Bauchschnitt der murine anteriore Prostate Lappen ist ausgesetzt und virale Partikel in der Lappen eingespritzt werden. Fünf Tage nach der Operation, chirurgische Clips aus der Haut entfernt werden können und der Prostata Krebs ab 8 Wochen nach analysiert werden kann. Insgesamt ist dies eine schnelle und kostengünstige Verfahren, das hat wenig Einfluss auf die Maus und ermöglicht größere Tumor zu entwickeln, ohne Kompromisse bei der Maus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>26175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td>for virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300013</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#39;&#39; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304000</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Polysorb Suture</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>GL889</td>
			<td>to close the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilized surgery drape</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Prep Pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-669-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming machine</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT415</td>
			<td>to shave the abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Micro Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11106-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-01</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Remover</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>different models have been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidinhydrochlorid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Takeda</td>
			<td>7242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus (AAV, AV)</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td>virus used in this protocol is an in-house production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4060</td>
			<td>used 1:200 dillution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP anitbody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2956</td>
			<td>used 1:100 dillution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

Mit einer steigenden Inzidenz von Prostatakrebs ist die Identifizierung der Tumor Fahranfänger oder Modulatoren entscheidend. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMM) für Prostatakrebs sind durch Tumor Heterogenität und seine komplexe Mikroevolution Dynamik erschwert. Traditionelle Prostatakrebs-Maus-Modellen gehören unter anderem Keimbahn und bedingte Knockouts, transgene Ausdruck der Onkogene und Xenograft-Modelle. Generation von de Novo Mutationen in diesen Modellen ist komplex, zeitaufwändig und kostspielig. Darüber hinaus zielen die meisten traditionellen Modelle den Großteil der Prostata Epithel, während menschlichen Prostata-Krebs ist bekannt als ein isoliertes Ereignis in nur eine kleine Teilmenge von Zellen zu entwickeln. Wertvolle Modelle müssen jedoch nicht nur Prostatakrebs Einleitung auch Progression zu fortgeschrittener Erkrankung zu simulieren.
Hier beschreiben wir eine Methode, um ein paar Zellen in der Prostata Epithel durch 3D-Steuerung Zellen nach Viruspartikel zu adressieren. Die Lieferung eines veränderter Virus an der murinen Prostata ermöglicht Änderung der Genexpression in der Prostata Epithelien. Virus-Typ und die Menge werden hiermit die Anzahl der Zellen zielgerichtet für gen-Änderung definieren, indem transducing ein paar für Krebs Einleitung und viele Zellen für die Gentherapie. Durch Chirurgie-basierte Injektion in die vorderen Lappen, distale aus dem Harn Track kann der Tumor in diesem Modell erweitern, ohne Beeinträchtigung der harnfunktion des Tieres. Darüber hinaus durch die Ausrichtung auf nur eine Teilmenge der epithelialen Zellen der Prostata die Technik ermöglicht klonalen Expansion des Tumors und daher imitiert menschliche Tumorentstehung sowie Verlauf und Invasion durch die Basalmembran.
Diese neuartige Technik bietet eine leistungsstarke Prostatakrebs Modell verbesserte physiologische Relevanz. Leiden der Tiere ist begrenzt, und da keine zusätzliche Zucht erforderlich ist, insgesamt tierischen Graf wird reduziert. Zur gleichen Zeit wird Analyse neue Kandidatengene und Wege beschleunigt, die wiederum ist kostengünstiger.

Virus-Lieferung an der murinen Prostata zu bewerten, wurden Proben analysiert, drei Monate nach der Operation. Die Rosa26-LSL-Cas9-EGFP-Mäusen12 express GFP in Zellen, die Cre Protein ausgedrückt durch das Virus ausgesetzt gewesen. Die Prostata Proben untersucht mit einem Fluoreszenz-Mikroskopie, Bereiche mit GFP Signal (Abb. 2A) zu identifizieren. Die GFP-Signal zeigt Kre-Aktivität in der Prostata Epithel aber nicht ob gen Bearbeit...

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Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Dieses Protokoll beschreibt eine neu gegründete Methode für Virus-Lieferung an der murinen Prostata. Mit CRISPR/Cas9 Technologie, Überexpression des Gens oder Cre-Rekombinase-Lieferung, die Technik erlaubt orthotopen Veränderung der Genexpression und implementiert eine neue Maus-Modell für Prostatakrebs.

Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

virus-delivery-crispr-guides-to-murine-prostate-for-gene

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.6K Aufrufe.  Aarhus University. Dieses Protokoll beschreibt eine neu gegründete Methode für Virus-Lieferung an der murinen Prostata. Mit CRISPR/Cas9 Technologie, Überexpression des Gens oder Cre-Rekombinase-Lieferung, die Technik erlaubt orthotopen Veränderung der Genexpression und implementiert eine neue Maus-Modell für Prostatakrebs.

Serie: Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

Ein Maus-Modell der Fatigue, induziert durch Peripheral Bestrahlung

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Forschung

Krebsforschung

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis and to identify novel therapeutic targets. To investigate molecular events that drive the progression from primary cancer to metastasis, we have developed a bitransgenic mouse model, RIP-Tag; RIP-tva. In this mouse model, the rat insulin promoter (RIP) drives the expression of the SV40 T antigen (Tag) and the receptor for subgroup A avian leukosis virus (tva) in pancreatic &#946; cells. The mice develop pancreatic neuroendocrine tumors with 100% penetrance through well-defined stages that are similar to human tumorigenesis, with stages including hyperplasia, angiogenesis, adenoma, and invasive carcinoma. Because RIP-Tag; RIP-tva mice do not develop metastatic disease, genetic alterations that promote metastasis can be identified easily. Somatic gene transfer into tva-expressing, proliferating pancreatic &#946; premalignant lesions is achieved through intracardiac injection of avian retroviruses harboring the desired genetic alteration. A titer of &#62;1 x 108 infectious units per ml is considered appropriate for in vivo infection. In addition, avian retroviruses can infect cell lines derived from tumors in RIP-Tag; RIP-tva mice with high efficiency. The cell lines can also be used to characterize the metastatic factors. Here we demonstrate how to utilize this mouse model and cell lines to assess the functions of candidate genes in tumor metastasis.

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

We present a protocol to demonstrate a novel somatic gene transfer system utilizing RIP-Tag; RIP-tva mouse model to study the function of genes in metastasis. The avian retroviruses are delivered intracardiacally to ensure gene transfer into pre-malignant, noninvasive lesions of pancreatic &#946; cells in adult mice.

Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren durch Gentransfer in die neuartige RIP-Tag; RIP-tva Mausmodell

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a common mechanism of disease progression and a prognostic-determinant feature of malignant tumors. In prostate cancer (PC), resistance to MTAs such as the taxane Docetaxel dictates treatment failure as well as progression towards lethal stages of disease that are defined by a poor prognosis and high mortality rates. Though studied for decades, the array of mechanisms contributing to acquired resistance are not completely understood, and thus pose a significant limitation to the development of new therapeutic strategies that could benefit patients in these advanced stages of disease. In this protocol, we describe the generation of Docetaxel-resistant prostate cancer cell lines that mimic lethal features of late-stage prostate cancer, and therefore can be used to study the mechanisms by which acquired chemoresistance arises. Despite potential limitations intrinsic to a cell based model, such as the loss of resistance properties over time, the Docetaxel-resistant cell lines produced by this method have been successfully used in recent studies and offer&#160;the opportunity to advance our molecular understanding of acquired chemoresistance in lethal prostate cancer.

Resistance to cancer therapies contributes to disease progression and death. Determining the mechanistic underpinnings of resistance is crucial for improving therapeutic response. This manuscript details the protocol to generate taxane-resistant cell models of prostate cancer (PC) to help dissecting the pathways involved in progression to Docetaxel resistance in PC patients.

Prostata-Krebs Zelle Modellgeneration des Widerstandes gegen die Anti-mitotische Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to generate RNA-guided nucleases, such as CRISPR-associated (Cas) 9 for site-specific eukaryotic genome editing. Genome engineering by Cas9 is used to efficiently, easily and robustly modify endogenous genes in many biomedically-relevant mammalian cell lines and organisms. Here we show an example of how to utilize the CRISPR/Cas9 methodology to understand the biological function of specific genetic mutations. We model calreticulin (CALR) mutations in murine interleukin-3 (mIL-3) dependent pro-B (Ba/F3) cells by delivery of single guide RNAs (sgRNAs) targeting the endogenous Calr locus in the specific region where insertion and/or deletion (indel) CALR mutations occur in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN), a type of blood cancer. The sgRNAs create double strand breaks (DSBs) in the targeted region that are repaired by non-homologous end joining (NHEJ) to give indels of various sizes. We then employ the standard Ba/F3 cellular transformation assay to understand the effect of physiological level expression of Calr mutations on hematopoietic cellular transformation. This approach can be applied to other genes to study their biological function in various mammalian cell lines.

Targeted gene editing using CRISPR/Cas9 has greatly facilitated the understanding of the biological functions of genes. Here, we utilize the CRISPR/Cas9 methodology to model calreticulin mutations in cytokine-dependent hematopoietic cells in order to study their oncogenic activity.

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce decellularized tongue extracellular matrix (TEM) which provides functional scaffolds for TSCC construction. TEM provides an in vitro niche for cell growth, differentiation, and cell migration. The microstructures of native extracellular matrix (ECM) and biochemical compositions retained in the decellularized matrix provide tissue-specific niches for anchoring cells. The fabrication of TEM can be realized by deoxyribonuclease (DNase) digestion accompanied with a serious of organic or inorganic pretreatment. This protocol is easy to operate and ensures high efficiency for the decellularization. The TEM showed favorable cytocompatibility for TSCC cells under static or stirred culture conditions, which enables the construction of the TSCC model. A self-made bioreactor was also used for the persistent stirred condition for cell culture. Reconstructed TSCC using TEM showed the characteristics and properties resembling clinical TSCC histopathology, suggesting the potential in TSCC research.

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

A method is shown here for the preparation of the tongue extracellular matrix (TEM) with efficient decellularization. The TEM can be used as functional scaffolds for the reconstruction of a tongue squamous cell carcinoma (TSCC) model under static or stirred culture conditions.

Herstellung von Zunge extrazellulären Matrix und Rekonstitution der Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür In-vitro-

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

Phosphopeptide Bereicherung gepaart mit quantitativen markierungsfreie Massenspektrometrie zu untersuchen, die Phosphoproteome bei Prostatakrebs

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, and intrinsic capability in intercellular delivery of various biomolecules. This work establishes an isolation protocol to achieve high yield and high purity of exosomes for siRNA delivery. Human Embryonic Kidney cells (HEK-293 cells) are cultured in bioreactor flasks and the culture supernatant (hereon referred to as conditioned medium) is harvested on a weekly basis to allow for enrichment of HEK-293 exosomes. The conditioned medium (CM) is pre-cleared of dead cells and cellular debris by differential centrifugation and is subjected to ultracentrifugation onto a sucrose cushion followed by a washing step, to collect the exosomes. Isolated HEK-293 exosomes are characterized for yield, morphology and exosomal marker expression by nanoparticle tracking analysis, protein quantification, electron microscopy and flow cytometry, respectively. Small interfering RNA (siRNA), fluorescently labeled with Atto655, is loaded into exosomes by electroporation and excess siRNA is removed by gel filtration. Cell uptake in PANC-1 cancer cells, after 24 h incubation at 37 &#176;C, is confirmed by flow cytometry. HEK-293 exosomes are 107.0 &#177; 8.2 nm in diameter. The exosome yield and particle-to-protein ratio (P:P) ratio are 6.99 &#177; 0.22 &#215; 1012 particle/mL and 8.3 &#177; 1.7 &#215; 1010 particle/&#181;g, respectively. The encapsulation efficiency of siRNA in exosomes is ~ 10-20%. Forty percent of the cells show positive signals for Atto655 at 24 h post-incubation. In conclusion, exosome isolation by ultracentrifugation onto sucrose cushion offers a combination of good yield and purity. siRNA could be successfully loaded into exosomes by electroporation and subsequently delivered into cancer cells in vitro. This protocol offers a standard procedure for developing siRNA-loaded exosomes for efficient delivery to cancer cells.

An exosome is a new generation of drug delivery carriers. We established an exosome isolation protocol with high yield and purity for siRNA delivery. We also encapsulated fluorescently labelled non-specific siRNA into exosomes and investigated the cellular uptake of siRNA-loaded exosomes in cancer cells.

Vorbereitung der Exosomen SiRNA Lieferung an Krebszellen

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

Dreidimensionale extrazelluläre Matrix Knochenmodell für Osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

Bewertung der Differenzierungskapazität von Mausprostataepithelzellen mithilfe der organoiden Kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...