Diese Methode könnte Leit-RNAs in Embryonen überprüfen, frühe Entwicklungsfragen testen oder bearbeitete Mäuse erzeugen. Alle Fortschritte in CRISPR Cas9 könnten mit dieser Methode genutzt werden. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie leicht zu erlernen ist und Reagenzien verwendet, die Laboren mit Zugang zu Mäusen zur Verfügung stehen.
In Zukunft wäre diese Technik nützlich, um eine Krankheit oder Mutation bei den Nachkommen eines Haustieres oder eines landwirtschaftlich wichtigen Tieres zu korrigieren. Diese Methode eignet sich am besten für die Generierung von Mausmodellen. In unserem Labor haben wir Variationen dieser Methode verwendet, um die Ereignisse rund um die Befruchtung und die frühe Präimplantationsentwicklung zu untersuchen, insbesondere die Genregulation in der Potenz des Embryos.
Der schwierigste Teil ist die Verwendung der Glasnadel, um Embryonen von Platte zu Platte zu bewegen. Chantal Diallo, eine Forschungsspezialistin in meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Um mit der Embryoentnahme und -verarbeitung zu beginnen, legen Sie die eingeschläferte weibliche Maus auf den Rücken und sprühen Sie 70% Ethanol auf den Bauch, um ihn chirurgisch zu öffnen.
Um die Bauchhöhle zu öffnen und die Eileiter zu entfernen, schneiden Sie die Hautschicht mit einer chirurgischen Schere und lokalisieren Sie die Eierstöcke. Als nächstes entfernen Sie chirurgisch beide Eileiter, die sich proximal zu den Eierstöcken befinden, und legen Sie sie in einzelne 50-Mikroliter-Tröpfchen M2 plus BSA-Medium. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop eine Dissektionszange, um die Ampulle des Eileiters zu zerschneiden, um die Cumulus-Oozyten-Komplexe oder COCs, die Eizellen enthalten, freizusetzen, und kombinieren Sie dann jede Cumulus-Oozyte zu einem einzigen 50-Mikroliter-Tröpfchen M2 plus BSA mit einer gehandhabten Pipette, die auf 20 bis 30 Mikroliter eingestellt ist.
Um Kumuluszellen aus den Zygoten zu entfernen, übertragen Sie COCs mit etwas zusätzlichem Medium auf ein Tröpfchen von 100 Mikroliter M2 plus Hyaluronidase und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren, bis die Embryonen sichtbar von den viel kleineren Kumuluszellen getrennt sind. Um Hyaluronidase zu verdünnen und lose Kumuluszellen zu entfernen, verwenden Sie eine mundbetriebene Pipette, um die Zygoten zu einem frischen 50-Mikroliter-M2-plus-BSA-Tröpfchen zu bewegen. Um die Zona pellucida des Embryos zu erodieren und zusätzliche physische Hindernisse für die Reagenzienabgabe zu reduzieren, übertragen Sie die Embryonen auf eine vorgewärmte 100-Mikroliter-Tröpfchen Säure Tyrode oder AT-Lösung auf einer 60-Millimeter-Platte.
Beobachten Sie die Zygoten kontinuierlich unter einem Stereomikroskop, bis 30% der Zona pellucida erodiert sind, und lassen Sie die Embryonen dann durch vier 50-Mikroliter-Tröpfchen M2 plus BSA passieren, um den AT zu verdünnen. Als nächstes bestimmen Sie eine geeignete Anzahl von Embryonen, die verarbeitet wurden, indem Sie sie unter dem Stereomikroskop zählen. Verdünnen Sie BSA, indem Sie die Embryonen durch zwei Tröpfchen von 50 Mikrolitern reduziertem Serummedium leiten.
Als nächstes pipettieren Sie 25 bis 30 Embryonen in einen 10-Mikroliter-Tropfen reduzierter Serummedien und fügen dann mit einer Handpipette 10 Mikroliter des Ribonukleoproteins oder RNP-Komplexes hinzu. Verdünnen Sie das viskose Glycerin aus dem RNP-Komplex und homogenisieren Sie die Probe durch 10-maliges Pipettieren oder bis das Gemisch keine Viskosität mehr aufweist. Als nächstes pipettieren Sie 20 Mikroliter Embryo und RNP-Gemisch in eine 0,1-Zentimeter-Elektroporationsküvette unter Vermeidung von Blasen, um dann die Editierreagenzien in die Zygote zu liefern, die Embryonen mit einem Rechteckwellenprotokoll von 30 Volt, 4 bis 6 Impulsen mit 3 Millisekunden Pulslänge und 100 Pulsintervallen zu elektroporieren.
Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter M2 plus BSA in die Oberseite der Küvette hinzu, um die Embryonen aus der Küvette zu spülen, und pipettieren Sie diese Mischung vorsichtig auf einen Teller. Für die Embryonenkultivierung werden 20 bis 30 Zygoten in ein Tröpfchen KSOM plus BSA in einer voräquilibrierten Kulturplatte übertragen und die Embryonen zum Tröpfchen bewegt. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit.
Übertragen Sie am nächsten Tag nur zweizellige Embryonen in ein frisches Tröpfchen KSOM plus BSA-Mischung und bringen Sie die Platte in den Inkubator zurück. Lassen oder entsorgen Sie die toten oder unbefruchteten Embryonen. Vor der Genotypisierung werden die Morula-Blastozysten-Embryonen mit zwei Tropfen DPBS gewaschen, um die Medienkomponenten zu verdünnen, die eine PCR-Reaktion stören könnten.
Übertragen Sie einzelne Embryonen mit einer Mundpipette in eine Vertiefung eines 8-Well-PCR-Streifens und fügen Sie 10 Mikroliter Lysepuffer hinzu. Um die Embryonen zu lysieren, programmieren Sie einen Thermocycler für 4 Stunden auf 55 Grad Celsius und inaktivieren Sie dann die Proteinase K mit einer 10-minütigen Inkubation bei 95 Grad Celsius. In dieser Studie wird eine Beispielstrategie gezeigt, um den Tyrosinase-Locus der Maus als Positivkontrolle anzugreifen, einschließlich Oligodesigns und Genotypisierungsstrategien für nicht-homologe End-Join und homologiegesteuerte Reparatur.
Bei der Verabreichung einer einzelnen Single-Guide-RNA (sgRNA) betrug die Abgabe von RNPs bis zu 100 % in den schwarzen 6J- und C57-6N-Mausstämmen C57, wobei die Bildung von Insertionsdeletionen bei 50 bis 100 % und der kleinen oligobasierten Ersatz zwischen 17 und 63 % lag. Protokoll gemacht wird, desto besser. Minimieren Sie auch die Exposition gegenüber Hyaluronidase und sauren Tyroden. Diese Methode beschreibt das Erzeugen eines bearbeiteten Tieres, das Testen der Implantation oder der Lebensfähigkeit der Schwangerschaft oder das mehrmalige Durchführen des Experiments, um Messungen oder Bilder und verschiedene Metriken während der Entwicklung vor der Plantage zu sammeln.
