מר מומן על ידי התחברות של האגודה למלחמה בסרטן הדני (R146-A9394-16-S2). MFB ו MKT היו ממומן על-ידי AUFF נובה (AUFF-E-2015-FLS-9-8). מר MFB משותפת, במימון בית הספר, בריאות, AU. המעבדה E.F.W. נתמך על ידי מענקים ממשרד ספרדית של הכלכלה (SAF2015-70857, שותפה במימון על ידי ERDF-האיחוד האירופי), של ERC מתקדם גרנט (741888 - CSI-Fun).
אנחנו רוצים להודות ליליאנה Fajardo מלור (גנים, פיתוח ומחלות; לחקר הסרטן הלאומי) לקריאה ביקורתית של כתב היד.

פרוטוקול זה כרוך הליך כירורגי של עכברי מעבדה. ניסויים בבעלי חיים כל חייב להיות בנפרד נבדקו ואושרו על-ידי, טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC). כמו הגישה מבוססת על שחזור בעלי חיים, הישרדות, ודא ההרדמה המתאימה לניהול כאב, סביבה כירורגי aseptic בכל עת. השתמש כרית החימום כדי למנוע היפותרמיה במהלך הניתוח ועד ההתאוששות מן ההרדמה.
1. הפעלת שיקולים
<ol><li>בהתאם הנגיף שימש, דרישות כייל נוגדנים שונים עשויים לחול; לדלל את הוירוס בהתאם. הערה: בדוגמה זו, וירוס Adeno-הקשורים בלתי מדולל ב- PBS מוזרק ב כייל של עונה 1 פרק 10-12 IU/mL. הנגיף מכיל מדריך RNA Pten , ביטוי של חלבונים Cre תחת promotor אוביקוויטין (איור 1), ויש serotype 9. אובדן Pten גדל pAKT והתפשטות של האפיתל של הערמונית13.</li>
	<li>השתמש עכברים זכרים בגיל 8 שבועות בזמנו של ניתוח כדי להבטיח פיתוח הערמונית נאותה. הערה: עכברים הראו בניסוי זה הם עכברים knockin Rosa26-LSL-Cas9-EGFP על רקע C57BL/6J12 (איור 1).</li>
	<li>טרי להכין תערובת הרדמה כללית, אם אפשר שיהיה סטרילי. הערה: עבור שחזור בעלי חיים טוב יותר לאחר הניתוח, תרופת הרדמה מומלץ מאוד.<ol>
<li>כדי להכין את הנפח הכולל של הרדמה 5 מ"ל, מערבבים 0.15 מ ל medetomidine הידרוכלוריד (1 מ"ג/מ"ל), midazolam 0.4 מ ל (5 מ"ג/מ"ל) ו 0.25 mL butorphanol (10 mg/mL) עם 4.2 mL סטרילי מים מלוחים. הערה: ניתן להשתמש שיטות הרדמה חלופי, כמו איזופלוריין נשימים, על פי הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים.</li>
		<li>כדי להפוך את האפקט של medetomidine הידרוכלוריד לאחר הניתוח, מערבבים atipamezole 0.1 מ"ל (5 מ"ג/מ"ל) עם 4.9 מ ל מים מליחים סטרילי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין סביבה כירורגי aseptic מאת נכונה חיטוי ועיקור. אוטוקלב מכשירי ניתוח לפני השימוש.</li>
</ol>2. וירוס-משלוח הערמונית מאתר
<ol><li>עזים ומתנגד החיה על ידי זריקה בקרום הבטן עם מזרק עקר 1 מ"ל, מחט 27G x ½". השתמש מנה הרדמה של 0.01 מ ל/גרם משקל. אם ההליך נמשך יותר מ 30 דקות, לשמור על הרדמה על ידי הזרקת מנה 1/3 של ההתחלה כל 30 דקות.</li>
	<li>בדוק את עומק הרדמה על-ידי הערכת הרפיית שרירים, נסיגה פדלים, רפלקסים palpebral. כאשר אובדן רפלקסים נצפית, לגלח את הבטן התחתונה של החיה.</li>
	<li>בזהירות לכסות את העיניים של החיה עם וטרינרי משחה אופטלמולוגיות באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי כדי למנוע עיוורון עקב חוסר רפלקס המצמוץ.</li>
	<li>נגב את הבטן מגולח עם 70% אתנול וביו -10% povidone יוד לחטא את האזור הכירורגי. לשפשף את האזור הכירורגי במרכז האזור כירורגי לעבר הפריפריה.</li>
	<li>לבצע חתך אנכי העור בקו האמצע בבטן נמוך של 1 ס מ בעזרת מספריים כירורגי סטרילי.</li>
	<li>הרם את הצפק באמצעות מלקחיים הצבע בסדר כדי למנוע פגיעה האיברים הן הנחת מתחת. בזהירות לעשות חתך < 8 מ"מ באמצעות מספריים כירורגיים דרך הצפק. הערה: בניגוד אנושית, בלוטת הערמונית של מכרסם כוללת ארבע אונות נפרדים. האונה הקדמי מחוברת של שלפוחית הזרע.</li>
	<li>להניע בעדינות את רקמת השומן הצידה כדי לחשוף את שלפוחית הזרע. באמצעות מלקחיים טבעת, בזהירות להרים שלפוחית הזרע עד הקדמי הערמונית יכולה להיות מזוהה (איור 1).</li>
	<li>תזריק את הנפח הכולל של פתרון וירוס (3 x 1010 חלקיקים נגיפיים) µL 30 קדמי האפיתל הערמונית באמצעות מזרק אינסולין 0.5 mL עם מחט 30G x 8 מ מ. למזער את זליגת ולהבטיח שהנוזל נספג בתוך הרקמה, ויצרו בועה קטנה. מקם את שלפוחית הזרע בחזרה בחלל הבטן.</li>
	<li>תפר של הצפק עם תפרים קטע פשוט 2-3, 6-0 נספגים באמצעות של 13 מ מ, 3/8 circle ו מחט להתחדד לנקודה.</li>
	<li>סיכת הידוק העור עם 3 קליפים סטרילי 4.8 x 6.5 מ"מ הרמת העור עם מלקחיים כדי למנוע נזק של הצפק.</li>
	<li>להתאוששות טובה יותר, החל תרופת הרדמה במנה של 0.01 מ ל/גרם משקל בזריקה בקרום הבטן באמצעות מזרק עקר 1 מ"ל ו מחט 27G x ½". בזהירות המקום האחורי חיות בכלוב שלו.</li>
</ol>3. לאחר הניתוח נהלים
<ol><li>שמור את הכלוב עם עכברים נותח על משטח חימום עבור 1 h לאחר הניתוח, כדי למנוע היפותרמיה עד החלים לחלוטין. אם הנוגדן מוחל, החיה צריך להיות ער, דקות ספורות לאחר ההזרקה.</li>
	<li>לפקח על החיות מדי יום עבור אינדיקציות ריפוי וכאב הפצע המתאים. במידת הצורך, לנהל משככי כאבים נוספים לפי הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים.</li>
	<li>להסיר סרטונים העור אחרי 4-5 ימים, לאחר הפצע סגור.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+transgenesis:+an+overview.">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis.">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis.">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li><li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus.">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+JUNB/AP-1+promotes+invasive+prostate+cancer.">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy,+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis.">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome.">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer.">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer.">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li><li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer.">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate.">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li><li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+prostate:+an+historical+survey+of+divergent+views.">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation.">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לשנות ביטוי גנים באונה הקדמי של הערמונית מאתר באמצעות הזרקת וירוס, יצירת מודל חזק עכבר חדש עבור סרטן הערמונית (איור 2). ניהול מוצלח אדנו תוארה לראשונה על ידי Leow et al. . ב- 2005-8. בעבר הראינו איך קידוד אדנו Cre recombinase חלבון יכול להחליף ?...

זיהוי וטיפול בסרטן הערמונית השתפרו משמעותית בעשור האחרון. ובכל זאת, השכיחות של סרטן הערמונית עולה, בעקבות תוחלת החיים. משוערת 1.1 מיליון מקרים חדשים ברחבי העולם, זה בין הסיבות הנפוצות ביותר של מוות מסרטן גברים 1. סרטן הערמונית הוא איטי בהתפתחות שלו, אך כאשר הסרטן התפתחה למצב גרורתי מתקדם, הפרוגנוזה הוא עני בשל אפשרויות הטיפול מוגבל. עד כה, רק כמה גנים זוהו מנהלי התקנים נפוצים ב סרטן זה, ופוגע שלה הטרוגניות, multifocality זיהוי של סמנים ביולוגיים, מחלת targetable מנהלי התקנים2,3.
לטכניקות GEMMs ביצירת הם לעיתים קרובות לקוי על ידי המורכבות שלהם, הוצאות בזמן ועלויות. מודלים נוקאאוט מותנה היה בשימוש נרחב לחקר סרטן הערמונית המועמד גנים, כי התוצאה עובריים קטלני כאשר לא פעיל ב germline4. הדגמים הנפוצים ביותר לערב של recombinase Cre ספציפיים הערמונית מושפעת גם ששונה Probasin5 או מקדם6 PSA משולב של GEMM על ידי הצלב מטלטלין נוספים. דגמים אלה, הגן עניין יהיה ממוקד ברוב המכריע של הערמונית תאים אפיתל, יצירת היפרפלזיה האיבר כולו, אשר עשוי לפגום של החיה בדרכי השתן פונקציה7.
משלוח ויראלי של החלבון Cre בזריקה לתוך האונה הקדמי של הערמונית מאתר ניתן לפתור בעיה זו על ידי מיקוד רק תאים מספר8. התחשבות דרישות טכניות מעבדות, מומחיות, מטרות, יתרונות שיטת מקשת רחבה של ווריאציות אפשריות. גישות מוצלחת ניצול אדנו מיקוד JunB , Pten9 או Lentivirus מיקוד Pten ו- Trp5310 הוכחו בין השאר. הוספת transgenes, כגון לוציפראז, הבונה ויראלי או GEMM את יתר על כן תאפשר פולשני ניטור של התקדמות המחלה באמצעות ביולומינסנציה הדמיה11.
הגנום עריכה מבוסס על טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מגלה הזדמנות חדשה ומהירה ללמוד סרטן באמצעות יצירה מהירה של הסתרה סומאטית12. משלוח ויראלי של מדריך בודד RNAs (sgRNAs) למזהים ייחודיים של האונה הקדמי של הערמונית מאתר יוצר מודל פיזיולוגית רלוונטיים יותר של סרטן הערמונית. בכך תאים בודדים נשיאת מוטציות שבחרת יכולים ליצור שיבוטים מסוגלים התפשטות ופלישה. יתר על כן, השימוש מדריך RNAs עבור גנים יעד מרובים יפיק שיבוטים תאים עם שינויים בגנים שונים. פעולה זו תאפשר גידול הטרוגניות, לחץ הברירה הטבעית על התקדמות סרטן, אשר יכול לחשוף את החשיבות של כל שינוי גנטי או מנגנונים epistatic.
כאן אנו מציגים שיטה להעביר נגיפים הערמונית מאתר עבור שינוי של ביטוי גנים. בטן חתך קטן, האונה הערמונית הקדמי מאתר חשוף, נגיפים מוזרקים לתוך האונה. חמישה ימים לאחר הניתוח, ניתוח קליפים ניתן להסיר מן העור, ניתן לנתח את סרטן הערמונית מ- 8 שבועות לאחר. בסך הכל, זה הליך מהיר וחסכוני, יש השפעה קטנה על העכבר ומאפשר הגידול גדול יותר לפתח מבלי להתפשר על העכבר.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh&lt;/sup&gt;/J mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td><td>BD</td><td>324825</td><td>for virus injection</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>300013</td><td>for anesthesia injection</td></tr><tr><td>30 G 1/2&#039;&#039; needle</td><td>BD</td><td>304000</td><td>for anesthesia injection</td></tr><tr><td>6-0 Polysorb Suture</td><td>Medtronic</td><td>GL889</td><td>to close the peritoneum</td></tr><tr><td>Disposable sterilized surgery drape</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Prep Pad</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>Trimming machine</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>to shave the abdomen</td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Halsey Micro Needle Holder</td><td>F.S.T</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>F.S.T</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Narrow Pattern Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Ring Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td><td>F.S.T</td><td>12030-01</td><td>to close the skin</td></tr><tr><td>Wound Clip System Remover</td><td>F.S.T</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>different models have been used</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Butorphanol</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Medetomidinhydrochlorid</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>Virus (AAV, AV)</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td>virus used in this protocol is an in-house production</td></tr><tr><td>pAKT antibody</td><td>CST</td><td>4060</td><td>used 1:200 dillution</td></tr><tr><td>GFP anitbody</td><td>CST</td><td>2956</td><td>used 1:100 dillution</td></tr></tbody></table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

עם השכיחות הגוברת של סרטן הערמונית, זיהוי של הגידול מנהלי התקנים חדשים או מאפננים היא קריטית. מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMM) עבור סרטן הערמונית מונעים על ידי גידול הטרוגניות ואת הדינמיקה שלה microevolution מורכבים. סרטן הערמונית המסורתית העכבר דגמים הכוללים, בין השאר, germline, הסתרה מותנה, ביטוי הטרנסגניים oncogenes ומודלים xenograft. דור של מוטציות דה נובו מודלים אלה הוא מורכב, זמן רב ויקר. בנוסף, רוב המודלים המסורתיים יעד הרוב המכריע של האפיתל הערמונית, ואילו האדם סרטן הערמונית הוא ידוע להתפתח ארוע בודד ברק תת קבוצה קטנה של תאים. מודלים יקר צריך לדמות לא רק סרטן הערמונית חניכה, אלא גם סדר מחלה מתקדמת.
כאן נתאר שיטת למטרה מספר תאי האפיתל הערמונית על ידי תאים transducing על ידי נגיפים. המשלוח של וירוס מהונדס הערמונית מאתר מאפשרת שינוי של ביטוי גנים epithelia הערמונית. וירוס סוג וכמות בזאת יגדירו את מספר תאים ממוקדות עבור שינוי גנטי על ידי transducing כמה תאים לטקס החניכה סרטן ותאים רבים עבור ריפוי גנטי. באמצעות הזרקת המבוסס על ניתוח באונה הקדמי, דיסטלי מן המסלול בדרכי השתן, הגידול במודל זה ניתן להרחיב מבלי ופוגע הפונקציה השתן של החיה. יתר על כן, על ידי מיקוד רק ערכת משנה של הערמונית תאים אפיתל הטכניקה מאפשר משובט הרחבה של הגידול, ולכן מחקה גידול אנושי חניכה, התקדמות, כמו גם פלישה דרך קרום הבסיס.
טכניקה חדשנית זו מספק מודל חזק סרטן הערמונית עם שיפור הרלוונטיות פיזיולוגיים. סבלם של בעלי החיים היא מוגבלת, שכן אין גידול נוסף נדרש, מונה בסך הכל בעלי חיים מצטמצם. באותו הזמן, ניתוח של גנים מועמדים חדשים מסלולים היא מואצת, וזה בתורו עלות גבוהה יותר יעיל.

כדי להעריך וירוס משלוח הערמונית מאתר, דגימות נותחו 3 חודשים אחרי הניתוח. עכברים Rosa26-LSL-Cas9-EGFP12 מבטאים את ה-GFP בתאים נחשפו Cre לחלבון מבוטא על ידי הוירוס. הדגימות הערמונית נבחנו עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות כדי לזהות אזורים עם GFP אות (איור 2 א). האות ה-GFP ?...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration at JoVE.com

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

פרוטוקול זה מתאר שיטה שהוקם למסירה וירוס מאתר הערמונית. באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9, ביטוי גנים או Cre recombinase מסירה, הטכניקה מאפשרת שינוי orthotopic של ביטוי גנים, מיישם מודל העכבר חדשניים עבור סרטן הערמונית.

וירוס משלוח של מדריכים CRISPR הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

virus-delivery-crispr-guides-to-murine-prostate-for-gene

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.6K Views.  Aarhus University. פרוטוקול זה מתאר שיטה שהוקם למסירה וירוס מאתר הערמונית. באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9, ביטוי גנים או Cre recombinase מסירה, הטכניקה מאפשרת שינוי orthotopic של ביטוי גנים, מיישם מודל העכבר חדשניים עבור סרטן הערמונית.

Video: Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to assess therapeutic avenues. However, their time-, labor- and cost-intensive nature limits their utility for systematic analysis of gene function. Recent advances in genome-editing technologies overcome those limitations and allow for the rapid generation of specific gene perturbations directly within specific mouse organs in a multiplexed and rapid manner. Here, we describe a CRISPR/Cas9-based method (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) to generate thousands of gene knock-out clones within the epithelium of the skin and oral cavity of mice, and provide a protocol detailing the steps necessary to perform a direct&#160;in vivo&#160;CRISPR&#160;screen for tumor suppressor genes. This approach can be applied to other organs or other CRISPR/Cas9 technologies such as CRISPR-activation or CRISPR-inactivation to study the biological function of genes during tissue homeostasis or in various disease settings.

Here we describe a rapid and direct in vivo CRISPR/Cas9 screening methodology using ultrasound-guided in utero embryonic lentiviral injections to simultaneously assess functions of several genes in the skin and oral cavity of immunocompetent mice.

ב Vivo CRISPR / Cas9 הקרנה בו זמנית להעריך תפקוד גנים בעור העכבר וחלל הפה

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Genetics

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Developmental Biology

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

The CRISPR/Cas9 system offers the potential to make targeted genome editing accessible and affordable to the scientific community. This protocol is intended to demonstrate how to create viruses that will knockout a gene of interest using the CRISPR/Cas9 system, and then inject them stereotaxically into the adult mouse brain.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Neuroscience

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Immunology and Infection

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Adeno-הקשורים משלוח וירוס בתיווך של CRISPR עבור ג'ין לב עריכה בעכברים

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Medicine

<meta charset="utf8"></head><body>טרנסדוקציה רטרו-ויראלית של RNA מנחה לעריכת גנים בהתמיינות Th17

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Biology

Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles ("Nanoblades")

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system has democratized genome-editing in eukaryotic cells and led to the development of numerous innovative applications. However, delivery of the Cas9 protein and single-guide RNA (sgRNA) into target cells can be technically challenge. Classical viral vectors, such as those derived from lentiviruses (LVs) or adeno-associated viruses (AAVs), allow for efficient delivery of transgenes coding for the Cas9 protein and its associated sgRNA in many primary cells and in vivo. Nevertheless, these vectors can suffer from drawbacks such as integration of the transgene in the target cell genome, a limited cargo capacity, and long-term expression of the Cas9 protein and guide RNA in target cells.
To overcome some of these problems, a delivery vector based on the murine Leukemia virus (MLV) was developed to package the Cas9 protein and its associated guide RNA in the absence of any coding transgene. By fusing the Cas9 protein to the C-terminus of the structural protein Gag from MLV, virus-like particles (VLPs) loaded with the Cas9 protein and sgRNA (named &#34;Nanoblades&#34;) were formed. Nanoblades can be collected from the culture medium of producer cells, purified, quantified, and used to transduce target cells and deliver the active Cas9/sgRNA complex. Nanoblades deliver their ribonucleoprotein (RNP) cargo transiently and rapidly in a wide range of primary and immortalized cells and can be programmed for other applications, such as transient transcriptional activation of targeted genes, using modified Cas9 proteins. Nanoblades are capable of in vivo genome-editing in the liver of injected adult mice and in oocytes to generate transgenic animals. Finally, they can be complexed with donor DNA for &#34;transfection-free&#34; homology-directed repair. Nanoblade preparation is simple, relatively low-cost, and can be easily carried out in any cell biology laboratory.

Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles "Nanoblades"

We have developed a simple and inexpensive protocol to load Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoprotein complexes within virus-like particles. These particles, called "Nanoblades", allow efficient delivery of the Cas9/sgRNA complex in immortalized and primary cells as well as in vivo.

משלוח של Cas9/ sgRNA ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בתאים מונצחים וראשוניים באמצעות חלקיקים דמויי וירוס ("Nanoblades")

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system has democratized genome-editing in eukaryotic cells and led to the ...

וירוס משלוח של מדריכים CRISPR הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ב Vivo CRISPR / Cas9 הקרנה בו זמנית להעריך תפקוד גנים בעור העכבר וחלל הפה

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

Adeno-הקשורים משלוח וירוס בתיווך של CRISPR עבור ג'ין לב עריכה בעכברים

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

משלוח של Cas9/ sgRNA ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בתאים מונצחים וראשוניים באמצעות חלקיקים דמויי וירוס ("Nanoblades")