Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) und die National Institutes of Health (R03NS06740402). Die Autoren danken Dr. Ivan Hernandez und seinem Labor-Mitglieder für die Laborfläche, Ausrüstung und Beratung.

Die Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden nach den Richtlinien der SUNY Downstate Medical Center Division von Labor Tier Ressourcen (DLAR)-Protokoll-Nummer 15-10492 betreut.
Hinweis: Primären Oligodendrozyten wurden isoliert von Neugeborenen (P5-P7 Wildtyp C57Bl/6N) Mäuse. In diesem Stadium bilden unreifen OLs mehr als 80 % der Nager weißen Substanz zellulären ertragreich zu gewährleisten. Alle Puffer und Reagenz Kompositionen stehen am Ende der Tabelle der Materialien.
(1) Deckgläsern Vorbereitung
Hinweis: Poly-D-Lysin (PDL) / Laminin beschichtet Deckgläsern sollten bereit sein, vor dem OL-Isolierung.
<ol><li>Platz #1 Deutsch Glas Deckgläsern in ein 50 mL konische Röhrchen und 35 mL 70 % EtOH um sie zu reinigen.</li>
	<li>Verschließen Sie das Röhrchen, legen Sie sie in einem Nutating-Mischer und gleichzeitig sanft schaukelnden bei Raumtemperatur für mindestens 30 min inkubieren. Deckgläsern können über Nacht inkubiert.</li>
	<li>70 % EtOH zu verwerfen.</li>
	<li>Waschen Sie die Deckgläsern 3 Mal mit entionisiertem Wasser, entfernen Sie das Wasser jedes Mal mit Vakuum Aspiration.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 30-35 mL PDL 50 µg/mL auf Deckgläsern in der 50 mL Tube genug Deckung der Deckgläsern.</li>
	<li>Legen Sie die 50-mL-Röhrchen mit Deckgläsern auf einem Nutating-Mixer und Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 30 min beim Schaukeln sanft.</li>
	<li>Waschen Sie die Deckgläsern 3 Mal mit entionisiertem Wasser, entfernen das Wasser jedes Mal mit Vakuum Aspiration.</li>
	<li>Übertragen Sie die Deckgläsern in 60 mm Petrischalen mit entionisiertem Wasser.</li>
	<li>Verwenden Sie eine P200 PIPETTENSPITZE um den Deckgläsern als Schicht auf der gesamten Oberfläche der Petrischale anzuordnen.</li>
	<li>Das Wasser vorsichtig von den Gerichten mit Vakuum Aspiration.</li>
	<li>Entfernen Sie das überschüssige Wasser rund um die Deckgläsern und mit geöffnetem Deckel und unter UV-Licht in der Haube über Nacht trocknen lassen. Hinweis: PDL beschichtet Glasdeckgläser können bis zu drei Monate lang bei 4 ° C in sterile Petrischalen gespeichert werden.</li>
	<li>Legen Sie die Deckgläsern in 24-Well-Platten, einer pro Well, mit feinen Pinzette.</li>
	<li>Verschieben Sie die Deckgläsern, in die Mitte der gut, dafür zu sorgen, dass die Kanten die Wand des Brunnens nicht berühren.</li>
	<li>100 µL 10 µg/mL Laminin verdünnt in B27NBMA hinzufügen (siehe die Tabelle der Materialien) beginnend in der Mitte der einzelnen Deckglas und bewegt sich in eine kreisförmige Art und Weise zu den Rändern hin um den Bereich abzudecken. Hinweis: Da Laminin OL Wartung beteiligt ist und fördert die Differenzierung in Reife OLs, ist es ein wichtiger OL Überlebensfaktor für in-vitro- Kultur41,42,43,44.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator bei 5 % CO2 für mindestens 1 h oder bis zur Beschichtung der OLs bereitstehen.</li>
</ol>(2) Maus Gehirn Kortex Dissoziation
<ol><li>Opfern Sie postnatale 5-7-Tage alten C57Bl/6N Maus Welpen durch schnelle Enthauptung mit der Schere zuvor in 70 % igem Ethanol gereinigt. Hinweis: Cerebral Cortex von 5-6 Neugeborenen Mäusen Welpen wurden für jede Zubereitung verwendet. Im Durchschnitt ergibt ein Mäusegehirn 1-1.5 x 106 OLs.</li>
	<li>Die Kopfhaut entlang der Mittellinie mit kleinen sezierenden Schere geschnitten und einfahren um den Schädel zu entlarven.</li>
	<li>Schneiden Sie den Schädel sorgfältig entlang der Mittellinie die Öffnung auf der Rückseite des Schädels auf den vorderen Bereich, heben Sie mit der Schere zur Vermeidung von Schäden des Gehirns ab. Dann schneiden Sie die Öffnung im hinteren Teil des Schädels mit in Richtung jeder Augenhöhle entlang der Schädelbasis.</li>
	<li>Verwenden Sie feine Pinzette, um sanft zu necken die Rinde vom Mittelhirn und übertragen Sie sie auf eine 60-mm-Gewebe-Kultur-Schale mit 7 mL B27NBMA. Wiederholen Sie die Schritte 2,2 bis 2,4 für jedes Gehirn, Bündelung der seziert Cortex.</li>
	<li>Der Cortex auf eine neue 60-mm-Gewebe-Kultur-Schale mit 5 mL Dissoziation Puffer übertragen (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain und 2.500 U DNase ich).</li>
	<li>Würfel der Cortex in kleine Stücke von ca. 1 mm3 mittels einer Skalpellklinge #15 und 20 min in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der bovinen Wachstum Serum (BGS), die enzymatische Reaktion zu stoppen.</li>
	<li>Übertragen Sie der Cortex zusammen mit der Dissoziation-Medien auf eine 15 mL konische Rohr mit einer 10 mL serologische pipettieren.</li>
	<li>Vorsichtig beginnen, das Hirngewebe zu trennen, von langsam bis pipettieren und 6-8 Mal mit einer 10 mL serologische pipettieren, mit sorgen um Luftblasen zu minimieren.</li>
	<li>Lassen Sie die Gewebe-Brocken für 2-3 min zu begleichen und den überstand auf eine frische Rohr übertragen.</li>
	<li>Fügen Sie 3 mL B27NBMA mit 10 % BGS/2500 U DNase I, um das Gewebe pellet.</li>
	<li>Verwenden Sie eine serologische 5-mL-Pipette, um sanft das Hirngewebe distanzieren beim pipettieren rauf und runter 6 - 8 Mal. Achten Sie darauf, um Luftblasen zu minimieren.</li>
	<li>Lassen Sie die Gewebe-Stücke für 2-3 min. zu begleichen.</li>
	<li>Übertragen Sie den überstand auf eine frische Rohr. Fügen Sie 3 mL B27NBMA mit 10 % BGS/DNase I, um das Gewebe pellet.</li>
	<li>Sanft distanzieren Sie das Hirngewebe mit einer P1000 pipettieren Spitze, beim pipettieren des Mix aus Medien und Gehirn Sie Gewebe rauf und runter. Wiederholen Sie Schritte 2.13 und 2.14, bis keine großen Stücke des Gewebes bleiben oder B27NBMA mit 10 % BGS/DNase I ist erschöpft, was zuerst eintritt. Achten Sie darauf, um Luftblasen zu minimieren.</li>
	<li>Pool-Zellsuspension mit früheren Überstände.</li>
	<li>Platz 70 µm Zelle Sieb in einen 50-mL-Tube. Mit einer 10 mL serologische pipettieren, übergehen Sie die gepoolten Zellsuspension sanft 70 µm Zelle Sieb.</li>
	<li>Waschen Sie die Zelle Sieb durch Zugabe von 1 mL B27NBMA mit 10 % BGS/DNase ich.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Zelle Sieb. 30 mL mit B27NBMA mit 10 % des Volumens bringen BGS/DNase ich.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension auf zwei 15 mL konische Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 10 min bei 200 X g.</li>
	<li>Den überstand zu entfernen, ohne die Zellen der Luft ausgesetzt. Der Überstand wird aufgrund zellenrückstand bewölkt sein. Fügen Sie 3 mL B27NBMA mit 10 % BGS zum Pellet.</li>
	<li>Trennen Sie sorgfältig die Zelle Pellet mit einem P1000 pipettieren. Bringen Sie das Volumen 15 ml mit B27NBMA mit 10 % BGS</li>
	<li>Ein frischer 40 µm Zelle Sieb übergehen Sie die Zellsuspension.</li>
	<li>Waschen Sie die Zelle Sieb durch Zugabe von 1mL B27NBMA mit 10 % BGS Entsorgen Sie die Zelle Sieb.</li>
	<li>30 mL mit B27NBMA mit 10 % des Volumens bringen BGS</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension auf 2 x 15 mL konische Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 10 min bei 200 X g.</li>
	<li>Entfernen Sie die meisten der Überstand, ohne die Zellen der Luft ausgesetzt. Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellets in 5 mL Eis kalte magnetische Zelle Sortieren (MCS) Puffer.</li>
</ol>3. Bestimmung der Zellzahl und Lebensfähigkeit
<ol><li>Verdünnen Sie 100 µL Zellsuspension mit 400 µL Trypan blau Lösung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, eine Verdünnung von 1:5 bei 0,4 % (w/V) zu erreichen.</li>
	<li>Zentrieren Sie ein Deckglas über eine Hemocytometer Kammer und füllen, die die beiden Kammern mit 10 µL der Zelle Verdünnung mit Hilfe einer Pipette P10 und die Vermeidung von Überfüllsicherung. Die Lösung wird unter dem Deckglas durch Kapillarwirkung weitergeben.</li>
	<li>Legen Sie die Hemocytometer auf den Mikroskoptisch und stellen Sie Fokus 40 X Vergrößerung ein. Hinweis: Zellenzahlen sind mit einem handgeführten Zähler in jedem der fünf Quadrate (vier Ecken und einem Zentrum) aufgenommen. Nur nicht-lebensfähige Zellen absorbieren den Farbstoff und blau, während live angezeigt und gesunde Zellen erscheinen Runde und refraktiven und nicht absorbieren die blau gefärbten Farbstoff, so dass für die Bestimmung der Anzahl der lebensfähigen und total Zellen pro Milliliter.</li>
</ol>4. Isolierung von O4+ Oligodendrozyten
<ol><li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 X g für 10 min.</li>
	<li>Sorgfältig entsorgen des Überstands mit Vakuum Aspiration, Vermeidung der Exposition der Zellen in die Luft.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie das Pellet in 90 µL MCS Puffer pro 1 x 107 total Zellen gefolgt durch die Zugabe von 10 µL Anti-O4 Perlen pro 1 x 107 Zellen.</li>
	<li>Mischen Sie die Zellsuspension und Perlen durch die 15 mL konische Rohr mit dem Finger schnippen sanft 4-5 Mal.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung für 15 min bei 4 ° C, schnippte die 15 mL konischen Rohr mit dem Finger 4-5 Timesevery 5 min.</li>
	<li>Waschen Sie die Mischung, indem das Rohr vorsichtig 2 mL MCS Puffer pro 1 x 107 Zellen hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 200 X g für 10 min.</li>
	<li>Verwerfen des Überstands vorsichtig mit Vakuum Aspiration, Vermeidung der Exposition der Zellen in die Luft. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL MCS Puffer für jeden 1 x 10-7 -Zellen.</li>
	<li>Legen Sie einen Magnetabscheider auf einem Magnetabscheider Stand. Legen Sie eine Auswahl-Spalte auf den Magnetabscheider und platzieren Sie ein 40 µm Zelle Sieb oben auf die Spalte. Legen Sie zwei 15 mL oder eine 50 mL konische Rohr unterhalb der Trennkolonne die Durchströmung zu sammeln.</li>
	<li>Vorspülen der 40 µm Sieb und Trennung Spalte mit 3 mL MCS Puffer und den Puffer durch die Säule laufen, ohne dass es trocknen zu lassen.</li>
	<li>Fügen Sie die Mischung aus Zellsuspension und Perlen in der Zelle-Sieb und in der Spalte Auswahl.</li>
	<li>Waschen Sie die 40 µm Zelle Sieb mit 1 mL der MCS-Puffer.</li>
	<li>Verwerfen Sie die Zelle Sieb und lassen Sie die Mischung von Zellen, Perlen und Puffer ohne Trocknen durch die Säule laufen.</li>
	<li>Waschen Sie die Trennsäule 3 Mal mit 3 mL MCS Puffer und 1 mal mit OL Verbreitung Medien.</li>
	<li>Entfernen Sie die Trennsäule aus der Magnetabscheider, legen Sie sie schnell in ein 15 mL konische Röhrchen, und sofort 5 mL OL Verbreitung Medien.</li>
	<li>Legen Sie einen Kolben auf der Oberseite der Spalte und fest drücken, um die markierten Zellen in das 15 mL konische Röhrchen auszuspülen.</li>
	<li>Entfernen Sie 100 µL Zellsuspension, Zellzahl und Lebensfähigkeit verwenden Trypan blau und Hemocytometer, wie in Abschnitt 3 zu bestimmen. Hinweis: Zellviabilität über 80 % gilt als akzeptabel, mit der Kultur des OLs fortzufahren, aber Rentabilität größer als 90 % ist optimal.</li>
</ol>5. Beschichtung von isolierten O4+ Oligodendrozyten
<ol><li>Verdünnen Sie die Zellsuspension auf den Wunsch Beschichtung Dichte (5 x 105 Zellen pro Deckglas) mit OL Verbreitung Medien. Hinweis: OL Dichte Aussaat ist sehr wichtig, damit entsprechende Zelldichte bestätigt werden sollte, unter Verwendung eines Mikroskops Gewebekultur, bevor Sie fortfahren. Dichte unter 10.000 Zellen/Deckgläsern Aussaat führen zu schlechten Zelle überleben. Dichte bei 10.000 bis 25.000 OL Beschichtung ist morphologischen Differenzierung langsam45. Wir Platte OLs an Aussaatdichte von mindestens 50.000 Zellen/Deckgläsern, Zelle Überleben zu sichern.</li>
	<li>Verschieben Sie die 24-Well-Platten mit Deckgläsern mit Laminin aus Inkubator, der Gewebekultur Haube überzogen.</li>
	<li>Jede Deckglas entfernen Sie Laminin und ersetzen Sie es mit 100 µL der OL-Suspension.</li>
	<li>Inkubieren Sie OLs im 37 °C/5% CO2 Inkubator für maximal 45 min OL Adhäsion zu den Deckgläsern zu fördern.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Inkubation die 24-Well-Platten aus dem Inkubator. Jede Flut gut von der 24-Well-Platte mit 500 µL OL Verbreitung Medien.</li>
	<li>Legen Sie die OLs zurück in den 37 °C/5% CO2 Inkubator für weitere 24 h.</li>
	<li>24 h nach der Beschichtung des OLs, Verbreitung Medien entfernen und ersetzen mit OL Differenzierung Medien, Differenzierung zu induzieren.</li>
	<li>Legen Sie die OLs zurück in den Inkubator und nicht entfernen Sie, bis die Zellen zur Fixierung bereitstehen. Hinweis: Veränderung des pH-Wertes sind schädlich für OLs und Zellviabilität zu verringern, unnötige Entfernung der OLs-Kulturen aus dem Inkubator sollte daher vermieden werden.</li>
</ol>6. Immunfluoreszenz-Färbung
<ol><li>Für den Nachweis von Zelle oberflächenmarker (NG2, O1 und O4) entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen.</li>
	<li>Fügen Sie 250 µL Maus Hybridom Überstände mit primären Antikörper gegen O1 (unverdünnt)13 und O4 (unverdünnt)13 und Kaninchen gegen NG2 polyklonale (1: 150 in B27NBMA verdünnt). Hinweis: Wenn im Handel erhältlichen Anti-O1 und Anti-O4 Antikörper eingesetzt werden sollen, ist es ratsam Verdünnungen vorgeschlagen vom Hersteller zu nutzen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit dem Primärantikörper in einem 37 °C/5% CO2 Inkubator maximal 45 min.</li>
	<li>Zweimal mit 0,05 % waschen Sie Tween-20/1 X PBS. Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (4 % PFA) für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Drei Mal für 5 min mit 0,05 % waschen Sie Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Verdünnen Sie Ziege Alexa 488-konjugierten Anti-Maus IgM oder Anti-Kaninchen IgG Sekundärantikörper (1: 400) in B27NBMA.</li>
	<li>Entfernen Sie die 0,05 % Tween-20/1 X PBS aus den Deckgläsern. Inkubieren Sie die Zellen mit Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Drei Mal für 5 min mit 0,05 % waschen Sie Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Entfernen Sie für doppelte Färbung für die Erkennung von internen Marker (GFAP) die 0,05 % Tween-20/1 X PBS und Block/permeabilize Zellen mit Block/Permeabilisierung Puffer für 15 min bei Raumtemperatur. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 6.17.</li>
	<li>Entfernen Sie Block/Permeabilisierung Puffer zu, und fügen Sie 250 µL Huhn Anti-GFAP (1: 100) in Block/Permeabilisierung Puffer verdünnt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-GFAP für 1 h bei Raumtemperatur. Drei Mal für 5 min mit 0,05 % waschen Sie Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Verdünnen Sie Alexa 594 konjugiert Ziege Anti-Huhn IgG Sekundärantikörper (1: 400) in B27NBMA.</li>
	<li>Entfernen Sie die 0,05 % Tween-20/1 X PBS aus den Deckgläsern. Inkubieren Sie die Zellen mit Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Drei Mal für 5 min mit 0,05 % waschen Sie Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Gegenfärbung mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und montieren Sie die Zellen mit Antifade Montage Medium mit DAPI.</li>
	<li>Lassen Sie die Deckgläsern im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht heilen.</li>
	<li>Bild der gefärbten Zellen mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop. Hinweis: In diesem Protokoll wurden die Zellen bei 40 X Vergrößerung mit einem einheitlichen Belichtungszeit abgebildet.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Angaben.

In dieser Mitteilung präsentieren wir eine Methode für die effiziente Isolierung hochgereinigte unreifen Maus Oligodendrozyt Kulturen. Im Vergleich zu früher veröffentlichten Protokolle39,40, ergab diese Methode eine höhere Reinheit mit einem viel niedrigeren Niveau der Astroglia-positiven Astrozyten und einen sehr geringen Prozentsatz von anderen Zellen nicht gekennzeichnet. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass diese unreifen OLs bereits verpflichtet, d...

Oligodendrozyten (OLs) sind die Myelinating Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS)1. Die Isolation und die Kultur der primären Oligodendrozyten in einem streng regulierten Umfeld ist ein wertvolles Werkzeug für die in-vitro- Studie über die Entwicklung der oligodendrogliazellen sowie die Biologie der demyelinisierenden Erkrankungen wie der multiplen Sklerose2 . Dies erfordert eine effiziente und robuste Oligodendrozyt Isolation und Kultur Methode3. In dieser Studie nutzten wir den Ausdruck einer unverwechselbaren Oligodendrozyt Zelle Oberfläche Markierung eine modifizierte Isolierung Technik zu implementieren, die schnellen und spezifischen ist.
Vier verschiedene Stadien der Reifung Oligodendrozyt identifiziert worden, jeweils geprägt durch den Ausdruck des unverwechselbaren Zelle oberflächenmarker für jede Entwicklungsstufe (Abbildung 1). Diese Zelle oberflächenmarker durch spezifische Antikörper4,5erkannt werden und können verwendet werden, um die OLs in bestimmten Phasen zu isolieren. In der ersten Stufe haben Oligodendrozyt Vorläuferzellen (OPCs) die Fähigkeit, sich vermehren, migrieren und speziell express Platelet-derived Wachstumsfaktor-Rezeptor (PDGF-Rα)6, Gangliosid A2B5, Proteoglykan NG27,8 , Polysialic Säure-neuronale Zelle Adhäsion Molekül9 und 7 (FABP7)-Fett-Säure-bindendes Protein10. OPCs haben bipolare Morphologie mit wenigen kurzen Prozesse ausgehend von den entgegengesetzten Polen der Zellkörper charakteristisch von neuronalen Vorläufer Zellen11ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Ausdruck der Zelle oberflächenmarker während der Maus Oligodendrozyt Entwicklung. OLs Zelle oberflächenmarker wie z. B. A2B5, GalC (O1) NG2, O4 und PDGF-Rα können verwendet werden, um speziell Oligodendrozyten in bestimmten Entwicklungsstadium isolieren mit spezifischen Antikörpern.   <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
In der zweiten Stufe OPCs geben Anlass zu Preoligodendrocytes und an der Zellmembran express nicht nur OPC Marker, sondern auch die Sulfatide (sulfatierten Galactolipid) von O4 Antikörper12,13, und das GPR17 Protein14anerkannt die weiterhin erst im Stadium der Unreife Oligodendrozyt (OL). Zu diesem Zeitpunkt verlängern Preoligodendrocytes multipolaren kurze Prozesse. Preoligodendrocytes sind die Hauptphase OL postnatale Tag 2 (P2) in der zerebralen weißen Substanz von Ratte und Maus mit einer kleineren Bevölkerung von unreifen OLs15.
Während der dritten Phase weiterhin die unreifen OLs express O4, Ausdruck von A2B5 und NG2 Markern zu verlieren und beginnen Galactocerebroside C16zum Ausdruck bringen. In diesem Stadium OLs oligodendroglial Abstammung verpflichtet und werden nach dem mitotischen Zellen mit langen verzweigten Ästen17,18. Unreife OL bilden mehr als 80 % der Nager weißen Substanz auf P7 und zu diesem Zeitpunkt die ersten Zellen der MBP+ 15,19,20,21eingehalten werden. Daher könnte Isolierung des OLs auf P7 zellulären Hochzinsanleihen sicherstellen.
In der vierten und letzten Ausbaustufe OL express Reife OLs Myelinating Proteine (Myelin basic Protein (MBP), Proteolipid-Protein (PLP), Myelin verbundenen Glykoprotein (MAG) und Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG)22,23 ,24,25,26. In diesem Stadium Reifen OLs Membranen dieser Form kompakt Messgutes Hüllen um die Axone zu erweitern und sind in der Lage zu myelinisieren. Dies deckt sich mit der Beobachtung, dass im Gehirn der Ratte und Maus MBP+ Zellen immer reichlich bei P1419,20,21geworden.
Seit der ersten Isolierung von Oligodendrozyt von Fewster und Kollegen in 196727wurden mehrere Methoden zur Isolierung des OLs von Nagetier CNS einschließlich Immunopanning28,29,30umgesetzt, Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Nutzung Zelle Oberfläche-spezifische Antigene28,31, Differentielle Zentrifugation gradient32,33,34,35 und eine schütteln Methode basiert auf differenzielle Einhaltung von verschiedenen CNS Glia36,37. Bestehende Kultur Verfahren haben jedoch Einschränkungen, insbesondere in Bezug auf Reinheit, Ertrag und Zeitaufwand Verfahren38. Daher sind effizientere Isolationsmethoden für Oligodendrozyten erforderlich.
In diesem Papier stellen wir eine einfache und effiziente Auswahlmethode für die Immunomagnetic Isolierung der Stufe drei O4+ Preoligodendrocytes Zellen von Neugeborenen Mäusen Welpen. Diese Methode ist eine Abwandlung der Techniken von Emery Et Al. berichtet 39 und Dincman Et al. 40 und bietet eine Oligodendrozyt Vorbereitung Reinheit über 80 % in etwa 4 h.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10ml serological pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml syringe Luer-Loc tip</td>
			<td>BD, Becton Dickinson</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22368547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml serological pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>6032-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>6032-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Growth Serum (BGS)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30541.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease I (DNAse I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Bx51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather disposable scalpels</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>EF7281C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round</td>
			<td>NeuVitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator stand - MACS multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator-MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex PES 0.22&#181;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLG033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media- Prolong Gold with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural mouse laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophin-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection column-LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace elements B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27NBMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27NBMA + 10% BGS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF solution stock (10 &#181;g/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer&#8217;s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 &#176;C. 
			Working solution (10 &#181;g/ml, 1000X) 
			1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize. 
			2. Dilute master stock aliquot to 10&#181;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 
			3. Aliquot (20&#181;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 
			4. Store aliquots at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Biotin stock solution (50 &#181;g/ml; 5000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 &#181;g/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37&#176;C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10&#181;g/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice. 
			2. Filter sterilize on ice 
			3. Aliquot at 200 &#181;l and freeze overnight at -20&#176;C. 
			4. Store aliquots at -20 to -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 &#181;l) and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS) (Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 &#176;C) in a cylinder and stir gently. 
			2. Add the power and stir until dissolved. 
			3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder. 
			4. Add to the solution in step 2. 
			5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume. 
			6. Keep stirring until dissolved. 
			7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH. 
			8. Add additional water to bring the final volume to 1L. 
			9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns. 
			10. Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin stock solution (4000 &#181;g/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thaw the bottle and aliquot 25 &#181;l per microcentrifuge tube and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Slowly thaw laminin in the cold (2&#176;C to 8&#176;C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5&#176; C to -20&#176; C in aliquots (e.g. 20 &#181;l) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5&#181;g/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 &#181;m Millex filter. Store the buffer at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 &#181;l). Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3 stock solution (1 &#181;g/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Master stock: 
			Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer&#8217;s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80&#176;C. 
			 
			Working stock (1&#181;g/ml; 1000X): 
			1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 
			2. Dilute master stock aliquot to 1 &#181;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 
			3. Aliquot (e.g. 20&#181;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 
			4. Store aliquots at -80&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF stock solution (10 &#181;g/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Master stock: 
			Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer&#8217;s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80&#176;C. 
			 
			Working stock (1&#181;g/ml; 1000X): 
			1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 
			2. Dilute master stock aliquot to 1&#181;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 
			3. Aliquot (e.g. 20&#181;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 
			4. Store aliquots at -80&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100&#181;l/tube). Store at -20&#176;C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 &#181;g/ml in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodendrocyte proliferation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodendrocyte differentiation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sato supplement (100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. &#38; Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. &#38; Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and specific immunomagnetic isolation of mouse primary oligodendrocytes

Die effiziente und robuste Isolierung und Kultur der primären Oligodendrozyten (OLs) ist ein wertvolles Werkzeug für die in-vitro- Studie über die Entwicklung der oligodendrogliazellen sowie die Biologie der demyelinisierenden Erkrankungen wie der multiplen Sklerose und Pelizaeus-Merzbacher-ähnliche Erkrankung (PMLD). Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und effiziente Auswahlmethode für die Immunomagnetic Isolierung der Stufe drei O4+ Preoligodendrocytes Zellen von Neugeborenen Mäusen Welpen. Da unreif OL bilden mehr als 80 % der Nagetier-Gehirn weißen Substanz bei postnatalen 7.Tag (P7) dieser Isolationsmethode sorgt nicht nur für zelluläre Hochzinsanleihen, sondern auch die spezielle Isolierung des OLs bereits verpflichtet, die oligodendroglial Linie, Verringerung der Möglichkeit der Isolierung von kontaminierenden wie Astrozyten und andere Zellen aus dem Gehirn der Maus. Diese Methode ist eine Modifikation der zuvor berichteten Techniken und bietet Oligodendrozyt Vorbereitung Reinheit über 80 % in etwa 4 h.

Der Zweck dieser Studie war es, eine verbesserte Isolationsmethode für O4 etablieren+ primäre Maustaste Oligodendrozyten erfordern die geringst mögliche Manipulation von den Zielzellen. Der gesamte Vorgang von Euthanasie der Welpen auf Beschichtung der Zellen im Deckgläsern dauert ca. 4 Stunden und Darstellung von Daten, die hier gezeigten drei unabhängige Experimenten. Nach Gewebe Dissoziation wurden durchschnittlich 4,3 ± 0,46 x 107 Zellen isoliert für jedes...

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Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Wir beschreiben die Immunomagnetic Isolierung der primäre Maustaste Oligodendrozyten, ermöglicht die schnelle und spezielle Isolierung der Zellen für in-vitro- Kultur.

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

rapid-specific-immunomagnetic-isolation-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.5K Aufrufe.  State University of New York Downstate Medical Center. Wir beschreiben die Immunomagnetic Isolierung der primäre Maustaste Oligodendrozyten, ermöglicht die schnelle und spezielle Isolierung der Zellen für in-vitro- Kultur.

Serie: Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...