Dieses Protokoll hilft, Mikroglia von den mikrodissektierten Demyelinisierungsläsionen des erwachsenen Mausgehirns zu isolieren, um die Mikroglia-Eigenschaften in vivo zu untersuchen. Diese Technik spart Zeit und hat geringere Anforderungen sowohl für Experimentatoren als auch für Geräte. Diese Methode hilft, Mikroglia aus dem Gehirn des Tieres zu isolieren, insbesondere aus mikrodissektiertem Gewebe in verschiedenen Krankheitszuständen.
Beginnen Sie mit der Mikrosezierung der Läsionen, die durch neutralen Farbstoff um das Corpus callosum unter einem Stereomikroskop markiert sind. Zentrifugieren Sie das sezierte Gewebe bei 300 mal g für 30 Sekunden, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. Enzymmix eins und Enzymmix zwei auf 37 Grad Celsius in einem Inkubator vorheizen.
Dann fügen Sie 1.950 Mikroliter vorgewärmte Enzymmischung eine zu einer Probe hinzu und verdauen Sie sie in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Fügen Sie 30 Mikroliter vorgewärmtes Enzym hinzu, mischen Sie zwei und mischen Sie vorsichtig. Nach der Verdauung vier Milliliter kaltes PBS in die Tube geben und vorsichtig schütteln.
Zentrifugieren Sie die Gewebeproben bei 300 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und saugen Sie den Überstand langsam und vollständig ab. Schwebe das Zellpellet vorsichtig mit 1.550 Mikrolitern kaltem PBS. Fügen Sie 450 Mikroliter der kalten Lösung zur Entfernung von Ablagerungen hinzu und mischen Sie sie gut.
Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um die Mischung sehr langsam und vorsichtig mit zwei Millilitern kaltem PBS zu überlagern. Zentrifugieren Sie die Mischung und suchen Sie dann nach den drei Schichten. Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um die beiden oberen Schichten vollständig abzusaugen, und füllen Sie das Rohr bis zu fünf Milliliter mit Kaltladepuffer.
Drehen Sie die Röhre dreimal vorsichtig um. Als nächstes, nach der Zentrifugation und Aspiration des Überstandes, suspendieren Sie das Zellpellet mit 90 Mikrolitern Ladepuffer und fügen Sie 10 Mikroliter CD11b-Perlen hinzu. Gut mischen und 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.
Nach der Inkubation fügen Sie einen Milliliter des Ladepuffers hinzu und waschen Sie die Zellen, indem Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und saugen Sie den Überstand vollständig ab, um die ungebundenen Perlen zu entfernen. Suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern des Ladepuffers und platzieren Sie die MS-Säule mit ihrem Separator zur positiven Auswahl im Magnetfeld.
Spülen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern des Ladepuffers, um die Zellen zu schützen und die Effizienz der magnetischen Sortierung basierend auf dem Protokoll des Herstellers sicherzustellen. Wenden Sie die Zellsuspension auf die MS-Spalte an und verwerfen Sie den Durchfluss, der die nicht markierten Zellen enthält. Fügen Sie 500 Mikroliter des Ladepuffers hinzu, um die Säule zu waschen, und entfernen Sie sie aus dem Separator.
Legen Sie die Säule auf ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie einen Milliliter des Ladepuffers in die Säule ein. Drücken Sie schließlich den Kolben an den Boden der Säule, um die magnetisch markierten Zellen auszuspülen. Eine schematische Darstellung der Gating-Strategie, die in der Durchflusszytometrie-Analyse von Mikroglia verwendet wird, die aus Demyelinisierungsläsionen erwachsener Mäuse vor und nach der magnetisch aktivierten Zellsortierung isoliert wurden, ist hier dargestellt.
Die grafischen Bilder stellen die Vorwärtsstreuhöhe und die Seitenstreuhöhe für die Auswahl von Zellen, die Vorwärtsstreufläche und die Vorwärtsstreuhöhe für die Auswahl einzelner Zellen sowie CD11b-FITC und CD45-APC für die Auswahl der myeloischen Zellen und Mikroglia dar. Der Anteil an Mikroglia hat nach der magnetisch aktivierten Zellsortierung deutlich zugenommen. Das grafische Bild stellt die Gating-Strategie dar, die in der Durchflusszytometrie-Analyse für lebende und tote Einzelzellen nach der magnetisch aktivierten Zellsortierung verwendet wird.
Hier wurden 7-Aminoactinomycin D und die seitliche Streuhöhe verwendet, um die lebenden Zellen auszuwählen. Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, die demyelinisierenden Läsionen unter einem Stereomikroskop basierend auf den neutralen roten Markierungen genau zu sezieren.
