Wir danken Rebecca Williams und Johanna Dela Cruz von der Cornell-BRC-Imaging und Andrew Recknagel für Anregungen und technische Hilfe. Diese Arbeit wurde auf der National Institutes of Health Zuschuss unterstützt S10-OD018516 (an Cornells Imaging Facility), T32HD057854, J.C.B und R01-GM45415, J.C.S.

Cornell University institutionelle Animal Care and Verwendung Committee (IACUC) hat alle Methoden, die hier beschrieben wird, in 2004-0038-Protokoll zu JCS zugelassen.
1. Vorbereitung der Instrumente und Kulturmedien
<ol><li>Wischen Sie der Arbeitsbereich mit 10 % Bleichmittel reinigen und lassen Sie das Bleichmittel auf die Arbeitsfläche Bereich mindestens 5 min lang zu bleiben. Entfernen Sie nach 5 min das überschüssige Bleichmittel mit sauberen Papiertüchern und 70 % Ethanol (EtOH). Reinigen der sezierenden Mikroskop gründlich mit 70 % EtOH. Hinweis: Es ist wichtig, dass der Arbeitsbereich mindestens Semi-zur Vermeidung von Kontaminationen der Orgel Kulturen steril sein.</li>
	<li>Wickeln Sie sauber Pinzetten und Scheren mit einem Papiertuch gedämpft mit 70 % EtOH bis zum Zeitpunkt der Nutzung. Hinweis: Die ideale Dissektion Werkzeuge variieren je nach Alter/Größe des Eierstocks. Beste Ergebnisse werden erzielt, mit einem scharfen Mikro sezierenden Schere, zwei feine Spitze Pinzetten (entweder Nummer 5 oder 55) und einem Mikro sezieren Iris-Schere.</li>
	<li>Machen Sie in einem konischen Rohr 50 mL der Eierstock Kultur, Medien und im Wasserbad 37 ° C Warm.<ol>
<li>Eierstock Kulturmedium4machen, Ergänzung 1 x Minimal Essential Media (MEM) mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS), 25 mM (4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES), 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 0,25 µg/mL Amphotericin B (z. B. 45 mL MEM, 5 mL Hitze inaktiviert FBS, HEPES 1,25 mL und 0,5 mL 100 X Lager von Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platten und Einsätze vor der Eierstock Kultur vorbereiten.<ol>
<li>Fügen Sie in einer Gewebekultur-Haube 1 mL Kulturmedium Eierstock an einer 35 mm-Gewebekultur-Platte.</li>
		<li>Pre-Einweichen einfügen Membran mit dem Kulturmedium. Fügen Sie genügende Medien, in der Regel ca. 0,55 mL pro darüber hinaus bis zur 24-Well-Zellkultur Trägerplatte und Ort einer Zellkultur einfügen in den Brunnen. Sicherstellen Sie, dass die Einlage Membran Medien berührt.</li>
		<li>Die Zahl der 35-mm-Platten und Brunnen mit Zelle Kultur Einsätze entsprechend der erwarteten Anzahl der Eierstöcke im Experiment vorbereiten. Legen Sie die 35 mm-Platten mit 1 mL der Kultur, Medien und die 24-Well-Trägerplatte mit Kultur, Medien und Einsätze in einem 37 ° C, 5 % CO2und atmosphärischen O2 Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ordnen Sie eine heiße Platte neben der Dissektion Umfang und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Halten Sie eine 37 ° C, 5 % CO2 und der atmosphärische O2 Inkubator ist in der Nähe der Dissektion Zimmer.</li>
</ol>(2) Eierstock Dissektion und Orgel-Kultur
Hinweis: Eierstöcke können bei Raumtemperatur seziert werden, solange die Belastung durch die nicht-ideale Temperatur minimal ist.
<ol><li>Die weiblichen Mäusen auf postnatale 5.Tag, durch Enthauptung, einzeln nacheinander einschläfern. Hinweis: Sterbehilfe muss nach IACUC-Richtlinien, die in der Einrichtung durchgeführt werden, wo die Forschung durchgeführt wird.</li>
	<li>Sprühen Sie das Tier mit 70 % EtOH. Legen Sie das Tier auf der Oberseite der trockenen Papiertuch unter dem Mikroskop Dissektion. Legen Sie eine 35 mm-Gewebekultur-Schale mit Eierstock Nährmedien in der Nähe der Dissektion Mikroskop.</li>
	<li>Machen Sie mit Zange oder einer Schere Mikro Dissektion Iris einen Schnitt durch die Haut des Tieres und in die Bauchhöhle mit Vorsicht, nicht in den Darm geschnitten. Schieben Sie den Darm aus der Bauchhöhle und suchen Sie die Eierstöcke. Extrahieren Sie die Eierstöcke und legen Sie sie in der Gewebekultur 35-mm-Schale mit Nährmedien.</li>
	<li>Sobald die Eierstöcke vom Tier seziert wurden, erhöhen Sie die Vergrößerung des Mikroskops Dissektion um Eierstöcke und alle angehängten Gewebe sichtbar zu machen. Mit reinigen Sie feiner Spitze Zange, entfernen Sie alle nicht-eierstockgewebe, wie Bursa und Fettgewebe. Achten Sie darauf, um die Eierstöcke intakt zu halten, wenn die beigefügte nicht ovariellen Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Sobald die Eierstöcke isoliert sind, legen Sie das Paar in die eingeweichter Zelle Kultur Einsätze der Träger 24-Well-Platte (siehe Schritte 1.4.2 und 1.4.3) und stellen Sie die Lautstärke des Mediums zu gewährleisten, dass es ausreicht, um die Orgel feucht zu halten (ohne komplett Eintauchen). Achtung: Darauf achten, kein Loch in der Membran der Zelle Kultur einfügen stecken, wenn die Eierstöcke zu übertragen.</li>
	<li>Ort explantiert Organe in einem 37 ° C, 5 % CO2und atmosphärischen O2 Inkubator.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.6 bis die Eierstöcke der einzelnen Tiere seziert und auf die Zellkultur platziert von der 24-Well-Platte mit dem Eierstock Kulturmedium einfügen.</li>
	<li>Änderung der Eierstock Kulturmedium alle 2 Tage mit Eierstock Medien Aliquote von 37 ° C Wasserbad erwärmt und fahren Sie mit Teil 3 des Protokolls zum gewünschten experimentelle Zeitpunkt.</li>
</ol>(3) Gewebe Fixierung
<ol><li>In einem 15 mL konische Rohr 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vorbereiten (z. B. hinzufügen 2 mL 16 % PFA Elektronenmikroskopie Grade 6 mL 1 X PBS). Achtung: PFA ist ein Gefahrstoff und unter einer chemischen Haube bearbeitet werden sollen.</li>
	<li>Die kultivierten Eierstöcke zu beheben, ohne Entfernung des Gewebes aus dem Kultur einfügen, indem Sie das Gewebe mit den frisch zubereiteten 4 % PFA-Lösung abdecken. Seal die Ränder der Platte mit Kunststoff Kleber (um Verdunstung zu vermeiden) und legen Sie die Proben bei 4 ° C über Nacht. Hinweis: Zur Vereinfachung der Handhabung und Gewebe Integrität vermeiden Sie verdrängen Eierstöcke aus der Zelle-Kultur-Einsatz während des gesamten Verfahrens. Kultivierte Eierstöcke an der Oberfläche des Einsatzes befestigt sind vorteilhaft für die Handhabung ohne Beschädigung oder Verlust der Orgel.</li>
	<li>Spülen Sie das Gewebe 3 X mit 70 % EtOH und entweder fahren Sie mit Schritt 4.1 oder laden es in Funkeln Fläschchen gefüllt mit 70 % EtOH bei 4 ° C bis zu Weiterverarbeitung. Hinweis: Wenn Sie Gewebe endogen verwenden kann mit dem Ausdruck fluoreszierende Proteine, Lagerung der Proben mit 70 % EtOH stark das Signal verringern. Alternativ kann Gewebe gespült und in die PBS mit 0,2 % Natriumazid (NaN3) gespeichert werden. NaN3 ist jedoch hochgiftig und stellt eine ernsthafte Inhalation Gefahr. Vorratslösung in der Dunstabzugshaube und Griff tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung wie ein Labor Mantel und Nitril-Handschuhe.</li>
</ol>4. ganze Mount Immunfluoreszenz
<ol><li>Legen Sie das fixierte Gewebe in 1 X PBS bei RT für ein Minimum von 4 h vor dem Permeabilisierung Schritt 4.3.</li>
	<li>Permeabilisierung Lösung und blockierende Lösung vorbereiten.<ol>
<li>Bereiten Sie Permeabilisierung Lösung, wie beschrieben. 1 X PBS fügen Sie hinzu, 0,2 % Polyvinylalkohol (PVA), 0,1 % Natrium Natriumborhydrid (NaBH4) Lösung (von 12 wt.% in 14 M Natronlauge (NaOH) Lösung) und 1,5 % Polyethylenglykol Tert -Octylphenyl Äther (nicht-ionische Tenside Reinigungsmittel). In einem 50 mL konische Rohr, fügen 5 mL 10 x PBS, 0,1 g PVA, 50 µL NaBH4und 750 µL der nichtionischen Tenside Reinigungsmittel, dann ultrapure Wasser bis zu 50 mL und bei Zimmertemperatur rühren, bis die Mischung vollständig in Lösung.</li>
		<li>Bereiten Sie blockierende Lösung, wie beschrieben. 1 X PBS hinzufügen 0,1 % nicht-ionische Tenside Reinigungsmittel, 0,15 % von 2,5 M Glycin pH 7.4, 10 % normalem ziegenserum, 3 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,2 % NaN3, 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 0,25 µg/mL Amphotericin B. bereiten eine Stammlösung der 2,5 M Glycin durch Auflösen von 93,8 g Glycin Reinstwasser zu einem Endvolumen 500 mL (pH 7,4) und eine Stammlösung 10 % NaN3 durch 5 g in 50 mL hochreines Wasser auflösen; dann, in einem 50 mL konische Röhrchen bereiten Sie die blockierende Lösung durch Zugabe von 5 mL 10 X PBS, 50 µL der nichtionischen Tenside Reinigungsmittel, 750 µL der Stammlösung Glycin, 5 mL ziegenserum, 1,5 g BSA, 1 mL der Stammlösung NaN3 , und 0,5 mL 100 X Lager von Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B. Fügen Sie Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 50 mL und Spritze Filter die endgültige Lösung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie und verwerfen Sie 1 X PBS aus der Durchstechflasche zu, und fügen Sie genug Permeabilisierung Lösung um die Eierstöcke vollständig untertauchen. Legen Sie die Probe in Permeabilisierung Lösung auf einem Orbitalschüttler (z. B. Nutator) für 4 h bei Raumtemperatur. Hinweis: Inkubationszeit variieren abhängig von der Dicke der Orgel.</li>
	<li>Ersetzt die Permeabilisierung Lösung mit genügend blockierende Lösung um die Eierstöcke komplett zu versenken. Versiegeln Sie das Fläschchen mit dem Kunststoff Kleber und lassen Sie das Gewebe für ein Minimum von 12 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler inkubieren.</li>
	<li>Bereiten Sie Primärantikörper Verdünnung in blockierende Lösung gemäß Datenblatt des Herstellers. Hinweis: Beachten Sie, dass nicht alle Antikörper mit dem Clearing Agent kompatibel sind. Das durchschnittliche Volumen pro Probe erforderlich ist etwa 750 µL.<ol>
<li>Für die Quantifizierung der Eizelle, verwenden TAp63 (nukleare Eizelle Marker) und MVH (zytoplasmatischen Keimzelle Marker). Hinweis: Die Antikörper in die Immunfluoreszenz-Bilder verwendet werden Maus Anti-p63 und Kaninchen Anti-MVH). Die primären Antikörper-Lösung kann wiederverwendet werden 2 X oder mehr, wenn bei 4 ° C zwischen Färbung Protokolle gespeichert und korrekt behandelt, um bakterielles Wachstum zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie den Einsatz, die das Gewebe in einer 24-Well-Platte enthält, und fügen Sie ca. 750 µL Primärantikörper Lösung. Sicherstellen Sie, dass die Eierstöcke vollständig eingetaucht sind. Dichtplatte mit Kunststoff Kleber Verdunstung minimieren und lassen das Gewebe für 4 Tage bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler inkubieren.</li>
	<li>Waschlösung vorbereiten.<ol>
<li>Bereiten Sie Waschlösung wie beschrieben vor. Fügen Sie 1 X PBS zu machen 0,2 % PVA und 0,15 % nichtionische Tenside Reinigungsmittel. Fügen Sie in einem 50 mL konische Röhrchen 5 mL 10 x PBS, 0,1 g PVA, 75 µL der nichtionischen Tenside Reinigungsmittel und Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie Primärantikörper Verdünnung zu, und fügen Sie eine großzügige Menge der Waschlösung. Immer darauf achten Sie, um die Eierstöcke zu versenken. Lassen Sie die Eierstöcke in die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur auf die Orbitalschüttler einweichen.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Waschlösung und inkubieren Sie auf Orbitalschüttler für 2 h oder mehr.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Schritt 4,9 eine zusätzliche Zeit.</li>
	<li>Vorbereiten der Sekundärantikörper Verdünnung in blocking-Lösung. Hinweis: Die sekundäre Antikörper verwendet, sind Anti-Maus 488 Fluoreszenzfarbstoff aufgewachsen in Ziege und Anti-Kaninchen 594 Fluoreszenzfarbstoff wuchs in Ziege. Siehe Punkt 4.5. für das durchschnittliche Volumen pro Probe benötigt.</li>
	<li>Entfernen Sie Waschlösung aus den Eierstöcken zu und fügen Sie sekundäre Antikörper-Lösung. Die Proben vor Licht (Wrap-Platte mit Alu-Folie) zu schützen und die Dichtplatte mit Kunststoff Kleber um Verdunstung zu minimieren. 2 Tage inkubieren Sie Proben auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur. Hinweis: Auch die Proben vor Licht mit Aluminiumfolie bei allen anschließenden Inkubation Arbeitsschritten zu schützen.</li>
	<li>Entfernen Sie Sekundärantikörper Lösung aus den Proben zu, und fügen Sie Waschlösung. Auf einem Orbitalschüttler für 8 h inkubieren. Hinweis: Nach Wunsch 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung fügen Sie 50 ng/mL des DAPI der ersten Waschschritt (~ 8 h Inkubation hinzu).</li>
	<li>Ersetzen Sie die Waschlösung für eine Übernachtung zu waschen.</li>
	<li>Während der Vorbereitung der Clearing-Lösung (siehe Abschnitt 5), ersetzen Sie die Waschlösung mit frischer Lösung über Nacht und die Proben auf die Orbitalschüttler bei Zimmertemperatur aufbewahren.</li>
</ol>(5) Eierstock Clearing und Imaging
<ol><li>Bereiten Sie ScaleS(0) clearing-Lösung.<ol>
<li>Bereiten Sie ScaleS(0) clearing-Lösung10 durch Zugabe von Reagenzien in einem bestimmten Verhältnis: 40 % D-(-) Sorbit (w/V), 10 % Glycerin, 4,3 M Harnstoff und 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), pH 8.1 (z. B. in einem 50 mL konische Rohr, Hinzufügen von 2,5 mL Glycerin, 10 g Sorbit , 5 mL DMSO und 12 mL von 9 M Harnstoff für ein Gesamtvolumen von 25 mL. Mischen Sie Lösung durch Inversion bei 50 ° C für 30 min und degas vor Gebrauch.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die Waschlösung und Tauchen Sie die Proben im clearing-Lösung. Erhalten Sie für bessere Ergebnisse Proben auf die Orbitalschüttler.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Clearing-Lösung 2 x täglich, bis das Gewebe wird transparent (ca. 2 Tage).</li>
	<li>Sobald das Gewebe deaktiviert ist, bereiten die Probe für die Bildgebung durch sorgfältig entfernen die einfügen-Membran mit kultivierten Eierstöcke mit einer Geldstrafe Tipp Skalpell und platzieren die Probe auf einem Objektträger.</li>
	<li>Fahren Sie mit imaging die Proben am Mikroskop in der Lage, optische schneiden.</li>
</ol>(6) Eizelle Quantifizierung
Hinweis: Es gibt viele verschiedene Computerprogramme, die in der Lage, Zellen zu quantifizieren sind. Nachfolgend beschriebenen ist ein Protokoll für die Quantifizierung der Eizelle mit dem nichtkommerziellen Bild-Verarbeitung-Paket, Fidschi-ImageJ14.
<ol><li>Mit einer abgeflachten Beihilfehöchstintensität Projektion der Z -Stapel-Bild-Serie für die spezifischen zellulären Marker (ohne DAPI-Kanal), konvertieren Sie das Bild in ein schwarz / weiß 8-Bit-Bild unter Typ in der Bild -Dropdown-Liste Menü.</li>
	<li>Markieren Sie unter dem Bild Dropdown-Menü die Registerkarte " Anpassen " und wählen Sie dann die Schwelle.</li>
	<li>Manuell passen Sie an, die Schwelle zu einem Niveau, das am besten jedes einzelne Eizelle identifiziert. Sobald die Ebene festgelegt ist, klicken Sie auf anwenden , um ein schwarz-weiß Bild zu erzeugen. Abschluss, quantifizieren Sie die Probe mithilfe von trennenden Oval oder Freehand -Symbol. Hinweis: Fidschi-ImageJ verfügt über verschiedene Optionen zur Feinabstimmung des Bildes, die für die Quantifizierung der Partikel verwendet werden. Zum Beispiel in Prozess | Binäre tab, gibt es verschiedene Optionen, die zur Verbesserung der Erkennung von was gezählt wird. In Abbildung 4die Optionen zum Follikel besser individualisieren war Erodieren, gefolgt von Löcher füllenund schließlich Wasserscheide.</li>
	<li>Wählen Sie unter Analyze -Drop-Down-Menü Analyze Partikel. Legen Sie die Parameter entsprechend der gewünschten Auflösung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence.">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Co-Culture+of+Mouse+Ovaries+and+Ovarian+Follicles.">Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li><li>Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+retinoids+on+the+meiosis+in+the+fetal+rat+ovary+in+culture.">Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).</li><li>Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+null+mutation+protects+mouse+oocytes+from+radio-induced+apoptosis.">p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis.</a> Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts+-+not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioprosthetic+ovary+created+using+3D+printed+microporous+scaffolds+restores+ovarian+function+in+sterilized+mice.">A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Studium der Säugetier-Wiedergabe erfordert verwenden und Quantifizierung von spezialisierten Zellen, die nicht routinemäßig Zellkultur zugänglich sind. Ex-Vivo -Kultur-Systeme sind jedoch wirksam am Eierstock und Follikel Lebensfähigkeit1,15beibehalten. Während der Eierstock Kultur erfordert das Gewebe eine größere Fläche für den Austausch von Nährstoffen durch Diffusion. Also, 5 - Tage alten Maus Eierstöcke eignen sich in Größe und For...

Um die zelluläre Zusammensetzung und morphologischen Merkmale von Säugetieren Eierstöcke zu studieren, setzen Wissenschaftler oft auf in Vivo Experimente gefolgt von immunohistologische Anfärbung der Eierstöcke Paraffin eingebettet. Vor kurzem, obwohl ganze Eierstock Orgel Kultur erwiesen hat eine effektive Alternative zu eierstockfunktion1,2,3,4 zu studieren, weil die Technik mit besseren Visualisierung gekoppelt werden kann und Quantifizierung Werkzeuge. Traditionell, hängt Analyse der Eierstöcke Morphologie von Rekonstruktion dreidimensionaler Eierstock Architektur von Schnittserien Paraffin eingebettet, aber abgesehen davon, dass mühsam und zeitaufwendig, seriell Paraffin eingebettete Gewebe schneiden tut nicht garantiert korrekte Rekonstruktion der Orgel, und Abschnitte oft verloren gehen oder falsch bestellte in den Prozess.
Neben den technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit seriellen Schnitt gibt es auch Unterschiede in den Methoden routinemäßig verwendet, um Follikel Nummern pro Eierstock5,6zu quantifizieren. Die methodische Variabilität derzeit verwendet beeinträchtigt Meta-Analyse der ovariellen Reserve über Studien5,7. Zum Beispiel können Follikel Zahlen aus verschiedenen wissenschaftlichen Artikeln von 10-divisibel oder mehr zwischen ähnlichen Entwicklungsstörungen Alters innerhalb einer bestimmten Belastung6variieren. Diese großen Unterschiede in den gemeldeten Follikel Quantifizierung können zu Verwirrung führen und Kreuz-Studie Vergleiche behindert haben. Experimentell, traditionelle Ansätze zur Quantifizierung der Follikel von Schnittserien von zählen Follikel eine vordefinierte Anzahl von Abschnitten ausgeführt werden (z. B. jeden fünften, zehnten, oder anderen Abschnitt). Variabilität im Follikel zählt mit diesem Ansatz entsteht nicht nur aus der Periodizität in welche Abschnitte gezählt werden, sondern auch von Variationen in Schnittdicke und technische Erfahrung in der Erzeugung von Schnittserien5,6. Zusätzlich zu ihrer Variabilität ist ein weiterer Nachteil der traditionellen Gewebe zu schneiden, dass die schneiden kleine Eierstöcke von jungen Tieren besonders anspruchsvoll und stark abhängig von Gewebe Orientierung8.
Das Protokoll unten beschreibt eine routinemäßig verwendeten Eierstock Kultur Technik1 aber stark verbessert traditionelle Follikel Quantifizierung durch Substitution von physischen Schneiden mit Gewebe clearing und optischer Schnitt mit der konfokalen Mikroskopie8 ,9. Clearing mit Gewebe Eintauchen (ohne die Notwendigkeit für Transkranielle Perfusion oder Elektrophorese) in eine Harnstoff - und Sorbit-basierte Lösung (z. B. ScaleS(0)10) erwies sich mit der Immunostaining kompatibel und erlaubt für die Reduzierung der Clearing-Zeit ohne Tiefe der Bildgebung. Andere berichteten Methoden (z.B., ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12und ClearT212) sind entweder mehr Zeit verbrauchen oder erlauben keine gründliche optischen Auflösung der Probe. Optischer Schnitt ist vorteilhaft, weil es weniger arbeitsintensiv und die Orgel dreidimensionale Architektur7,8 unterhält. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die Vorbereitung der Proben erfordert keine teure Reagenzien um das Gewebe zu löschen und kann mit relativer Mühelosigkeit durchgeführt werden.
Insbesondere das Protokoll beschrieben wurde optimiert für kultivierten Maus Eierstöcke bei postnatalen Tag fünf aber am Eierstock von postnatale Tag 0 - 10 durchgeführt wurde. Die Methode nutzt ein Eierstock Kultursystem, in dem das Gewebe natürlich auf die Membran auf dem kultiviert legt, Orgel Bearbeitung und Manipulation zu erleichtern. Das beschriebene Kultursystem kann verwendet werden, zu pflegen, dass Eizelle überleben13explantierten Eierstöcke für bis zu 10 Tage und zu beurteilen, wie die verschiedenen experimentelle Bedingungen stören können. Die Quantifizierung beschrieben erfolgt mit Hilfe der nichtkommerziellen Bildverarbeitungs-Paket Fidschi-ImageJ14 und kann auf den meisten PCs durchgeführt werden. Darüber hinaus können Bilder zur Quantifizierung weithin verfügbar für die wissenschaftliche Gemeinschaft, damit zukünftige Meta-Analyse erfolgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Micro dissecting scissor 4.5&#34;, straight, sharp points</td>
			<td style="width:200px;">Roboz</td>
			<td style="width:117px;">RS-5912</td>
			<td style="width:224px;">Micro dissecting scissor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jewelers style forceps 4-3/8&#34;, style 5</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>17-305X</td>
			<td>Fine tip forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Iris Scissors 4&#34;, straight, sharp points</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>18-1618</td>
			<td>Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Minimal Essential Media (MEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Used in Step 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm Tissue Culture Treated Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nunc&#8482; 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>141006</td>
			<td>Pore size: 8&#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nutator mixer GyroTwister&#8482;</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S1000-A-B</td>
			<td>three dimensional shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103219-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bovine Serum Albumen (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride solution (NaBH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452904-25ML</td>
			<td>Use the solution, rather than the tablet or powder form&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinyl Alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>Cold water soluble</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ML</td>
			<td>polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td>25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10mL Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-p63 antibody (4A4)</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM 163A</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-MVH antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13840</td>
			<td>Dilution 1:600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; goat anti-mouse 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; goat anti-rabbit 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(-)sorbitol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240850-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI-ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414044-034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries

Forschung auf dem Gebiet der Säugetier-Reproduktionsbiologie umfasst oft die Auswertung des Gesamtzustand der Eierstöcke und Hoden. Insbesondere bei Frauen, Eierstöcke Fitness oft bemisst sich durch Visualisierung und Quantifizierung der Follikel und Eizellen. Da der Eierstock eine undurchsichtige dreidimensionale Gewebe ist, erfordern traditionelle Ansätze mühsam Schneiden des Gewebes in zahlreichen Schnittserien um Zellen im ganzen das ganze Organ sichtbar zu machen. Darüber hinaus da Quantifizierung von dieser Methode in der Regel nur eine Teilmenge der in den Abschnitten, die getrennt von der ungefähre Durchmesser eine Eizelle erzielte umfasst, ist es anfällig für Ungenauigkeit. Hier wird ein Protokoll beschrieben, die stattdessen nutzt ganze Organ Gewebe Clearing und Immunfluoreszenz-Färbung der Maus Eierstöcke Follikel und Eizellen zu visualisieren. Im Vergleich zu traditionellen Ansätzen, dieses Protokoll ist vorteilhaft für die Visualisierung von Zellen innerhalb des Eierstocks aus vielerlei Gründen: 1) der Eierstock bleibt im gesamten Probenvorbereitung und Verarbeitung; (2) kleine Eierstöcke, die schwer zu Abschnitt sind, können mit Leichtigkeit untersucht werden; (3) zellulären Quantifizierung wird leichter und genauer erreicht; und 4) das gesamte Organ abgebildet.

Dieses Protokoll enthält 6 große Schritte folgen Dissektion der Eierstöcke, wie in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 , Abbildung 3 , Abbildung 4 markieren Sie die neuen Features dieses Protokolls, die Optimierung des Gewebes clearing für Eierstöcke und ganze Gewebe Eizelle Quantifizierung mit Fidschi-ImageJ ent...

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Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Follikel in kultivierten Eierstöcken von jungen Mäusen ohne seriellen Schnitt zu quantifizieren. Mit ganzen Organs Immunfluoreszenz und Gewebe löschen, wird körperliche Schneiden mit optischer Schnitt ersetzt. Diese Methode der Probenvorbereitung und Visualisierung Orgel Integrität bewahrt und automatisierte Quantifizierung bestimmter Zellen erleichtert.

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

whole-mount-immunofluorescence-follicle-quantification-cultured-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K Aufrufe.  Cornell University. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Follikel in kultivierten Eierstöcken von jungen Mäusen ohne seriellen Schnitt zu quantifizieren. Mit ganzen Organs Immunfluoreszenz und Gewebe löschen, wird körperliche Schneiden mit optischer Schnitt ersetzt. Diese Methode der Probenvorbereitung und Visualisierung Orgel Integrität bewahrt und automatisierte Quantifizierung bestimmter Zellen erleichtert.

Serie: Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...