Wir möchten, dass die Mitglieder der Gynäkologie Onkologie Gruppe für das kritische Lesen des Manuskripts danken. Diese Arbeit wird teilweise durch Mittel aus dem National Health and Medical Research Council, der Australian Research Council und der Cancer Institute NSW (PST) unterstützt. MK ist ein Empfänger von der University of Newcastle Postgraduate Research Fellowship.

Tierpflege und experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Animal Care und Ethikkommission der Universität von Newcastle und bestätigt die New South Wales Animal Research Act, New South Wales Tierforschung Verordnung und der australischen Code für die Pflege durchgeführt und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke. Alle an Mäusen durchgeführten Verfahren wurden von der Tierpflege und Ethikkommission der Universität von Newcastle genehmigt. 1. Zeit Mating <ol><li> Paar 6 - 8 Wochen alten männlichen und weiblichen Mäusen unmittelbar vor dem Ende der Sommerzyklus. </li><li> Schauen Sie sich die Frauen für das Vorhandensein von Vaginalpfropf frühen Morgen (am oder vor 08.00 Uhr), jeden Tag. Tag der Stecker als 0,5 dpc betrachtet. </li><li> Übertragen Sie das Weibchen mit Vaginalpfropfens in einen neuen Käfig (ohne Stecker) und das Datum der Stecker beschriften. </li></ol> 2. Isolierung von embryonalen Maus-Genitalleiste <ol><li> Isolieren Maus embryonic Genitalleiste von 15,5 dpc schwangeren Frauen , wie in 9, mit einigen Modifikationen beschrieben , wie unten beschrieben. </li><li> Führen Sie Dissektion vor Mittag als die Zeit schwangere Frauen berücksichtigt werden in den nächsten Tag der Schwangerschaft bis zum Nachmittag zu betreten. </li><li> Sacrifice 15,5 dpc trächtige Weibchen Zervikaldislokation (oder gemäß dem genehmigten Protokoll, das von den institutionellen Tierethikkommission). </li><li> Halten Sie die Maus auf dem Rücken auf saugfähige Tissuepapier und sprühen die ventrale Seite des Bauches mit 70% Ethanol. </li><li> Heben Sie die untere Bauchhaut (Bauchseite) mit einer Pinzette und machen einen seitlichen Schnitt chirurgische Schere, von urogenitalen Öffnung bis zum Ende Brustkorb verläuft. Ziehen Sie die Haut in Richtung des Kopfes des Tieres den Bauch zu belichten. </li><li> Schneiden Sie die Bauchmuskeln mit chirurgische Scheren Bauchhöhle zu belichten. Besorgen Sie sich die graviden Uterus mit einer Pinzette gerade über dem Gebärmutterhals und einen Schnitt zu machen. Nun heben Sie die Gebärmutter, indem auf to der Harnblase und schneiden Sie die Uterus breit durch Schnitte gefolgt Band an den uterotubale Kreuzungen Uterus aus der Bauch Befestigung zu lösen. </li><li> Übertragen Sie die Gebärmutter in einen 50-ml-Röhrchen eiskaltem HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) enthält. Waschen Sie die graviden Uterus sanft mit eiskaltem HBSS das überschüssige Blut zu entfernen. </li><li> Halten Sie die Gebärmutter in einer Petrischale mit eiskaltem HBSS und auf Eis halten. Schneiden Sie die Gebärmutterwand und nehmen Sie die Embryonen aus. Halten Sie die Embryonen in einer frischen Petrischale mit HBSS auf Eis. </li><li> Nehmen Sie ein sauberes sterile Tissue-Papier und legte es auf eine neue Petrischale. Spray 70% -igem Ethanol auf das Tissue-Papier. Halten Embryo auf dieser Tissue - Papier auf der lateralen Seite und schneiden Sie es aus Unterbauch eine sterile Klinge in Richtung verwendet , wie durch die gestrichelte Linie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Befestigen Sie den Embryo auf einem sterilen Schwamm Basis durch die Wirbelsäule feststecken. </li><li> Legen Sie sie unter dem Sezieren Stereomikroskop und vorsichtig entlang der ventralen Mittellinie geschnitten. Entfernen Sie die Leber und Darm. Die Maus Urogenitalsystems (Niere, Harnleiter, Hoden, WD und vas deferens) sollte nun erkennbar sein. </li><li> Schneiden Sie den Hoden und WD aus und halten eine frische Petrischale mit HBSS in, auf Eis. Um die WD und Hoden herausnehmen, schneiden Sie die Samenleiter der Nähe ihrer Befestigung an der Harnröhre und schneiden Sie die Befestigung des unteren Teils von WD von gubernaculum. </li><li> Pool die Hoden und RDG aus den Embryonen von der gleichen Gruppe (dies gemäß dem Versuchsplan können variieren). </li></ol> 3. Kultur embryonaler Genitalleiste (Abbildung 2) <ol><li> Bereiten Medium für die embryonale Genitalleiste Züchten von DMEM / F12 mit 10% FBS (Fetal Bovine Serum) ergänzt, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% L-Glutamin. Erwärmen Sie die Medien auf 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> In 300 &amp; mgr; l Medium pro Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte. </li><li> Nehmen Sie eine frische Petriplatte und einen kleinen Tropfen steriler HBSS auf sie. Setzen Sie ein Polycarbonat Spur Etch-Membran (0,881; m) auf dieser Tropfen HBSS mit seiner glänzenden Oberfläche die HBSS gegenüber. </li><li> Mit sauberen Pinzette legte zwei RDG und Gonaden auf der Membran (auf seiner rauen Oberfläche, nach oben gerichtet ist) und die maximale Menge an HBSS mit sterilen Tüchern / saugfähigem Papier entfernen. Nicht das Gewebe mit saugfähigem Papier berühren; andernfalls wird es in das Gewebe beschädigen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass weder die RDG noch die Gonaden einander berühren. Andernfalls werden sie zusammen bei der anschließenden Inkubation bleiben. </li><li> Übertragen, um die Membran mit den Geweben in die Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 300 &amp; mgr; l Kulturmedium und Kultur sie an der Luft-Medium-Schnittstelle. Zu viel Kulturmedium auf Membranen führt zu einem zystischen Wachstum von RDG. </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C Inkubator in Gegenwart von 5% CO 2. </li><li> Wechseln Sie jeden Tag das Kulturmedium. Um das Medium mit der Pipette zu ändern, entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen erste und fügen Sie dann 300 ul der vorgewärmten frisches Medium. Hinweis:Um den Effekt der verschiedenen Signalwege auf WD Morphogenese studieren, chemische Aktivatoren und / oder Inhibitoren bei den erforderlichen Konzentrationen können zu dem Kulturmedium zugegeben werden. </li><li> Kultur die Gewebe für 3 d. Innerhalb von 3 d, gesammelt abgewickelte RDG aus einem 15,5 - dpc - Embryonen verwandeln sich in stark gewundene Rohre (3B). Die Zugabe des Wnt - Inhibitor, IWR1, führt zu einer Hemmung von WD Aufwickeln (3C). </li><li> Für die Ernte nehmen diese Gewebe eine Petrischale mit eiskaltem PBS. Übertragen Sie die Membran mit kultivierten Gonaden und WD in die Petrischale. Die Membran wird auf dem PBS schweben. Drücken Sie die Membran in PBS zu versenken und die Gonaden und WD herausnehmen. </li><li> Fixieren Sie die Gewebe mit 4% Paraformaldehyd (PFA) O / N bei 4 ° C oder für 1 h bei RT. Bei Bedarf nehmen Hellfeldbilder der RDG vor der Fixierung. </li></ol> 4. Ganze Berge Immunofluoreszenz <ol><li> Waschen Sie 3x die fixierten Gewebe mit PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) mit langsamen rocking, 10 min jeweils bei RT. </li><li> Entwässern das Gewebe in einer abgestuften Reihe von Ethanol (25%, 50%, 75% und 100%), 10 min jeweils bei 4 ° C unter langsamem rocking (~ 30 rpm). Bei diesem Schritt können die Gewebe bei 4 ° C in 75% Ethanol aufbewahrt werden. <ol><li> Um das Ethanol zu ändern, halten Sie die ungestörte Gewebe für 2 Minuten und lassen Sie sich die Gewebe beruhigen. Nehmen Sie so viel Überstand wie möglich und dann die nächst höhere Konzentration an Ethanol hinzu. Um eine Beschädigung der Gewebe zu vermeiden, sollte die Pipettenspitze berühren nicht die Gewebe in jedem Stadium. </li></ol></li><li> Folgende Dehydratisierung rehydratisieren die Gewebe in einer abgestuften Reihe von Ethanol (100%, 75%, 50% und 25%), 10 min jeweils bei 4 ° C unter langsamem rocking. </li><li> Waschen der Gewebe mit PBS-T (PBS + 0,1% Triton X-100), 4x, 20 min jeweils bei RT unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm). </li><li> Blockieren die Gewebe für 1 h bei RT mit Blockierungspuffer (PBS + 1% BSA + 0,2% fettfreier Trockenmilchpulver + 0,3% Triton X-100). </li><li> after zu blockieren, übertragen die Gewebe zu primären Antikörperlösung (verdünnt in Blockierungspuffer) und O / N bei 4 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm) inkubiert. Verdünnungen der primäre Antikörper verwendet werden , in der Material Tabelle beschrieben. </li><li> Am nächsten Tag waschen Gewebe mit PBS-MT (PBS + 2% fettTrockenMilchPulver + 0,5% Tween-20), 4x, jeweils 30 min bei RT unter leichtem Schütteln (~ 30 min). </li><li> Nach diesem Waschschritt hinzufügen sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 250 (dieser Schritt benötigt Optimierung für einzelne Antikörper) in Blockierungspuffer und Inkubation für 1 h bei RT unter leichtem Schütteln. </li><li> Ab sofort halten weiter die mit Aluminiumfolie abgedeckt Gewebe Lichteinwirkung zu verhindern, als Sekundärantikörper mit lichtempfindlichen Fluorophoren markiert sind. </li><li> Waschen Sie die Gewebe 3x mit PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20), jeweils 30 min, unter leichtem Schütteln. </li><li> Bereiten Sie Folien für die gefärbten Gewebe Montage. <ol><li> Dazu schneiden Sie die Glasplättchenin dünne Streifen einen Diamantstift und kleben zwei Streifen übereinander auf dem Glasträger mit Nagellack. Machen Sie zwei Grenzen und Platz Gewebe zwischen diesen beiden Grenzen. </li><li> In DAPI enthält Eindeckmediums und auf einem Deckglas. Bewerben Nagellack an den Ecken des Deckglases um es zu beheben, um die Folie. Hinweis: Die Gewebe sind nun bereit für die Bildgebung. Bewahren Sie diese Folien bei -20 ° C. </li></ol></li></ol>

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	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Organkultursystem hat viele Vorteile gegenüber der traditionellen Zellkultursystem. Das System behält die ursprünglichen strukturellen Beziehungen und Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen. Es ahmt in vivo - Systemen und gibt genauere Informationen als Zellkulturstudien , bei denen die Nische Faktor fehlt. Die Verwendung von Organkultursysteme haben sogar Vorteile gegenüber das ganze Tier mit. Dazu gehören die höheren Kosten für die Nutzung des ganzen Tieres, einfache Pflege und Wartung von ...

Das männliche Fortpflanzungssystem besteht hauptsächlich aus Hoden, der Ort für Keimzellentwicklung und -differenzierung und einem komplexen duktalen System, das für die Reifung, den Transport und die Lagerung von Spermien benötigt wird. Epididymis ist ein röhrenförmiges Organ , das mit Hoden Samenleiter und vorrangig im post-Hoden - Entwicklung und Reifung der Keimzellen verbindet 1. Die hoch Coiled erwachsenen Maus Epididymis entwickelt sich aus einer einfachen und geraden Vorläuferrohr, Urnierengang (WD) 1. Die komplexe und gewundene Struktur der Epididymis ist von wesentlicher Bedeutung für die Spermien die Fähigkeit zu erwerben , weibliche Keimzellen 2 zu befruchten. Wie solch ein wichtiges Organ für die männliche Fruchtbarkeit entwickelt und wird in Form ist nicht gut verstanden. Verschiedene Signalwege sind in der Entwicklung von WD wie der Wnt - Signalwegs 3,4 und dem Androgen - Signalweg 5 einbezogen werden gezeigt. Unsere jüngsten Arbeiten hat die Forderung von bal etabliertgene Wnt - Signalisierung für WD Wickel während der vorgeburtlichen Entwicklung 4. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die Mechanismen in der postnatalen epididymal Wickeln, Zelldifferenzierung und Zell-zu-Zelle innerhalb des epididymal Epithel und mit interstitiellen Zellen Kommunikation beteiligt zu verstehen. Genetisch veränderte Mausmodelle haben sich bewährt , für die Identifizierung / Validierung von molekularen Mechanismen ein mächtiges Werkzeug , um zugrundeliegende Entwicklung und Krankheit verschiedener Organsysteme 6. Trotz seiner umfangreichen Gebrauch gibt es erhebliche Einschränkungen der genetisch veränderten Maus-Modellen, einschließlich der unpredicted Phänotyp gezielte Mausmutanten in Bezug auf vermutete Genfunktion und keine Phänotyp in Null-Mutanten in einigen Modellen Einfluss von genetischen und Umweltfaktoren, arbeitsintensiv und zeitraubender Prozess Mausmodelle zu entwickeln. Daher ist die Interpretation der Bedeutung der Ergebnisse nur aus genetisch modiFied Mausmodellen ist nicht immer einfach 6. Diese Einschränkungen können mit in vitro - Organkultursystem überwunden werden , die wir die Flexibilität gibt , um mehrere Signalwege in Echtzeit in kontrollierten Kulturbedingungen zu manipulieren. Organkultursystem ist instrumental 7 die Physiologie und Pathologie der ganzen Organen zu verstehen. Außerdem Abbildungs ganzer Organe gefärbt mit Fluorophor markierten Antikörper erlaubt es, die Marker von Interesse in einem dreidimensionalen Rahmen zu visualisieren, wie er in vivo vorliegt, um dadurch ein besseres Verständnis für die Form des Organs bietet, die Struktur und Funktion 8. Hier haben wir die Methoden zur Isolierung von embryonalen Maus - Genitalleiste, in - vitro - Kultur und whole mount Immunofluoreszenz Bildgebung von RDG beschrieben, die angewendet werden können , eine Vielzahl von Fragen zu beantworten über die Morphogenese von röhrenförmigen Organen wie RDG. In diesem Protokoll wirisolierten Maus embryonale urogenitalen Grate von 15,5 Tagen nach coitum (DPC) schwanger Dämme und kultiviert sie für 3 d durch Immunfärbung für eine epitheliale Zellmarker gefolgt (Zytokeratin 8, CK8), einer Zellproliferationsmarker (Phospho-Histon 3, PH 3) und aktiv βcatenin.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Corning, USA</td><td>3524</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30031.02</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Sigma, USA</td><td>D8437</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Interpath,&amp;nbsp; Australia</td><td>SH30034.02</td><td>10% FBS used in culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30034.01</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, USA</td><td>15070-063</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&amp;nbsp;</td><td>Whatman, USA</td><td>110409</td><td>Membrane (0.8 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma, USA</td><td>10161-5mg</td><td>100 &amp;micro;M concentration used</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences, USA</td><td>15710</td><td>16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot&lt;br/&gt; be disposed of in the sink</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>214-20L PL</td><td>Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>2509-500ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, USA</td><td>T8787-50ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>621-500mg</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Di-hydrogen Phosphate</td><td>Ajax Finechem, USA</td><td>4745-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>465-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cytokeratin8/Troma I</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td><td>TROMA-I</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>active &amp;beta;catenin&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology,&amp;nbsp; USA</td><td>D13A1</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>phospho-Histone 3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>111-545-047</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>112-585-072</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>242-500ml</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>n-Propyl galate</td><td>Sigma, USA</td><td>2370</td><td>-</td></tr><tr><td>2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td><td>Sigma, USA</td><td>D9564-10mg</td><td>Use to stain nucleic acids (DNA)</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>2225-500ml</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Cover Slips (24 x 50 mm)</td><td>Lomb Scientific</td><td>CS24501GP</td><td>-</td></tr></tbody></table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

Tubal Morphogenese ist eine grundlegende Voraussetzung für die Entwicklung der meisten Säugetierorganen, einschließlich des männlichen Fortpflanzungssystems. Der Nebenhoden, ein integraler Bestandteil des männlichen Reproduktionstraktes, ist verantwortlich für die Spermien Lagerung, Reifung und Transport. Der erwachsene Epididymis ist ein hoch gewundenes Rohr, das als Urnierengang (WD) bekannt von einer einfachen und geraden embryonale Vorläufer entwickelt. Die richtige Wickeln der Epididymis ist von wesentlicher Bedeutung für die männliche Fruchtbarkeit, wie Spermien im Hoden sind nicht in der Lage eine Eizelle zu befruchten. Jedoch bleibt der Mechanismus für epididymale Entwicklung und Aufwickeln unklar, teilweise aufgrund des Fehlens von ganzen Organkultur und Abbildungsverfahren. In dieser Studie beschreiben wir ein in - vitro - Kultursystem und whole mount Immunofluoreszenz Protokoll besser , den Prozess der WD Wickel- und Entwicklung sichtbar zu machen , die auch zu studieren anderen röhrenförmigen Organen angewendet werden kann.

Während der Entwicklung erfährt der WD signifikanten Veränderungen bei der eine einfache und gerades Rohr in einem hochkomplexen und Spiralkanal umgewandelt wird. Verwendung von oben beschriebenen Verfahren unterzogen RDG eine ähnliche Umwandlung in Kulturbedingungen. Hier haben wir die Ergebnisse von RDG kultiviert 3 d (Figur 3) dargestellt. Zur molekularen Mechanismen sezieren in WD Morphogenese beteiligt sind, kann das Kulturmedium mit Inhibitoren und Aktivatoren verschiedene Signalwege gezielt e...

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultur der Maus Urnierengang (WD). Wir haben auch ein detailliertes Verfahren für ganze Berg Immunfärbung von kultivierten / frisch isolierten RDG mit fluoreszenz getaggten Antikörper nachweisen. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken die Untersuchung von WD Entwicklung, Wickeln und Differenzierung.

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Aufrufe.  University of Newcastle.  Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultur der Maus Urnierengang (WD). Wir haben auch ein detailliertes Verfahren für ganze Berg Immunfärbung von kultivierten / frisch isolierten RDG mit fluoreszenz getaggten Antikörper nachweisen. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken die Untersuchung von WD Entwicklung, Wickeln und Differenzierung. 

Serie: Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Krebsforschung

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>Dreidimensionale Bildgebung von Organoiden zur Untersuchung der primären Ziliogenese während der ex vivo Organogenese

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

Dreidimensionale Bildgebung von Organoiden zur Untersuchung der primären Ziliogenese während der ex vivo Organogenese

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

Genetik

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neurowissenschaften

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Biologie

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Zusammenfassung

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Verwendung

Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle

Dreidimensionale Bildgebung von Organoiden zur Untersuchung der primären Ziliogenese während der ex vivo Organogenese

Dreidimensionale Bildgebung von Organoiden zur Untersuchung der primären Ziliogenese während der ex vivo Organogenese

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse