Dieses Protokoll ist das erste seiner Art, das Photostatine auf den lebenden Präimplantationsmausembryo anwendet und die Verwendung von lichtschaltbaren Medikamenten auf anderen physiologischen 3D-Systemen berücksichtigt. Lichtschaltbare Photostatine ermöglichen die Manipulation des Mikrotubuli-Wachstums in Raum und Zeit und können wieder in einen Aus-Zustand umgewandelt werden. Unbeabsichtigtes Aussetzen von Photostatinen gegenüber blauem Licht vor dem Experiment kann sie vorzeitig aktivieren.
Daher empfehlen wir, bei der Vorbereitung Ihrer Proben jederzeit in völliger Dunkelheit oder bei rotem Licht zu arbeiten. Unter strengen dunklen Bedingungen, bei denen nur rotes Licht zur Beleuchtung verwendet wird, beginnen Sie mit der Herstellung von Vorrats- und Zwischenarbeitslösung von PST-1P in Reinstwasser. Wie im Textmanuskript beschrieben.
Verdünnen Sie dann PST-1P in frischem KSOM, um die Endkonzentration von 40 zu erreichen, M.To bereiten Sie den Kammerobjektträger für die Live-Bildgebung vor, fügen Sie 10 L PST-1P-behandeltes KSOM in die Mitte eines Brunnens hinzu, um ein halbkugelförmiges Tröpfchen zu bilden. Um zu verhindern, dass das Tröpfchen verdunstet, bedecken Sie es mit ausreichend Mineralöl. Wickeln Sie dann die vorbereitete Kulturschale lose in Folie oder legen Sie die Kulturschale in einen nicht luftdichten, undurchsichtigen Behälter im Inkubator, um sicherzustellen, dass keine Lichteinwirkung erfolgt.
Stellen Sie nach dem Transfer der Embryonen in den PST-1P-behandelten KSOM-Tropfen sicher, dass die Embryonen in der Mitte des Tröpfchens gruppiert und auf dem Boden der Schale abgelegt werden. Sobald die Tauchobjektivlinse vorbereitet ist, montieren Sie den Kammerschieber auf dem Mikroskop in einer Umgebungskammer. Auf 37 ° C und 5% CO2 eingestellt und in völliger Dunkelheit, um sicherzustellen, dass sich alle PST-1Ps in der inaktiven Transkonfiguration befinden und dass Embryonen auf den Boden der Schale sinken können.
Verwenden Sie eine Rotlichtlampe, um die Objektivlinse in Kontakt mit dem Tauchmedium zu positionieren. Suchen Sie dann den Rand des Tröpfchens des Mediums und positionieren Sie das Objektiv direkt darüber. Mit dem Live-Scanning-Modus und einem 561-nm-Laser lokalisieren Sie die Embryonen im Tröpfchen.
Verwenden Sie Bühnencontroller und Live-Scanning-Modus, um die Start- und Endpunkte für die Aufnahme eines Z-Stacks des gesamten Embryos festzulegen. Passen Sie die Laserleistungseinstellungen bis zu maximal 5% entsprechend Ihrem Signal an. Und stellen Sie den digitalen Offset auf maximal 0,900 ein, entsprechend Ihrem Signal, um das Aussehen der EB3-dTomato-Kometen zu optimieren.
Minimieren Sie Hintergrundgeräusche. Stellen Sie das Loch auf 2 m. Pixelauflösung bei 512 x 512.
Und die Pixelverweilzeit liegt bei 3,15 s. Und stellen Sie den Zoom auf 2x ein. Erwerben Sie einen Z-Stapel des gesamten Embryos mit 1 m Abschnittsintervallen, um die Bereiche des Mikrotubuliwachstums im gesamten Organismus zu beurteilen.
Öffnen Sie für EB3-dTomato-Kometenverfolgungsexperimente das 3D-Z-Stack-Bild und erhöhen Sie den Zoom auf das Dreifache. Und zeichnen Sie einen rechteckigen ROI um den spezifischen subzellulären Bereich von Interesse. Erfassen Sie dann den Zeitrafferfilm einer einzelnen Z-Ebene unter Verwendung der eingestellten Parameter mit einem Zeitintervall von 500 ms.
Um PST-1P zu aktivieren, wechseln Sie zu einem 405-nm-Laser und erfassen Sie einen weiteren Zeitraffer, wobei der Laser auf 10% Leistung eingestellt ist, Lochblende maximal geöffnet ist, Pixelauflösung von 512 x 512, die Pixelverweilzeit von 3,15 s, Zoom von dreimal, in einem Zeitintervall von 500 ms, und stellen Sie 20 Bilder ein, die erfasst werden sollen. Wechseln Sie unmittelbar nach der Aktivierung zurück zum 561-nm-Laser und wiederholen Sie die Erfassung, wie zuvor gezeigt, um den Verlust von EB3-dTomato-Kometen nach der Aktivierung von PST-1P zu bestätigen. Um PST-1P nun wieder in seinen inaktiven Trans-Zustand zu versetzen, schalten Sie einen 514-nm-Laser ein und erfassen Sie einen weiteren Zeitraffer mit festgelegten Parametern.
Um die Wiederherstellung von EB3-dTomato-Kometen zu visualisieren, wechseln Sie zurück zu einem 561-nm-Laser und wiederholen Sie die Erfassung. In unbehandelten Kontrollembryonen war das EB3-dTomato-Signal vor der Beleuchtung mit einem 405-nm-Laser im gesamten Zytoplasma der Zelle mit Ausnahme des Kernbereichs hoch. Nach der Beleuchtung wurden Veränderungen im Signal nicht erkannt.
Dies deutet darauf hin, dass der 405-nm-Laser keine Photoschäden am Embryo oder die Mikrotubulidynamik verursacht hat. Während der PST-1P-Behandlung von Embryonen im 16-Zellstadium unter strengen dunklen Bedingungen wurde im 3D-Bild eine starke EB3-dTomato-Expression festgestellt, was zeigt, dass inaktives PST-1P keine Hemmung der Mikrotubulipolymerisation unter dunklen Bedingungen hervorruft. Vor der Aktivierung von PST-1P bestätigte die Zeitraffer-Bildgebung einer einzelnen Z-Ebene eine starke EB3-dTomato-Expression und Mikrotubuli-Polymerisation in einer subzellulären Region.
Nach 405 nm Lichtaktivierung wurde innerhalb von Sekunden eine Verringerung des EB3-dTomato-Kometensignals festgestellt. Und die Wiederherstellung des Signals wurde bei der Deaktivierung von PST-1P mit einem 514-nm-Laser erreicht. Die Embryonen, die mit EB3-dTomato mikroinjiziert und mit PST-1P inkubiert wurden, zeigten ein normales embryonales Potenzial und entwickelten sich bis zum Blastozystenstadium.
Und normale Mikrotubuli-Dynamik während der Mitose. Anzeige der Nichttoxizität eines aktiven PST-1P für den Embryo. In den erworbenen Zeitrafferfilmen erschien die EB3-dTomato-Etikettierung als kometenartige Strukturen und ermöglichte die Verfolgung wachsender Mikrotubuli-Filamente.
In PST-1P-behandelten Embryonen, die unter dunklen Bedingungen gehalten wurden, gingen einzelne EB3-dTomato-Kometen von der Interphasenbrücke aus, die im frühen Mausembryo als nicht-zentrosomales Mikrotubuli-Organisationszentrum fungiert. Ein T-Stack zeigt EB3-dTomato-Kometen im Bereich der Interphasenbrücke. Nach der Aktivierung von PST-1P wurden EB3-dTomato-Kometen an der Basis der Interphasenbrücke und im t-Stack reduziert.
Denken Sie daran, dass weißes Licht PST-1P vorzeitig aktivieren kann. Verwenden Sie also nur rote Lichtquellen für die Sichtbarkeit. Grünes Licht deaktiviert auch PST-1P, also vermeiden Sie bitte die Verwendung von grün fluoreszierenden Etikettenmarkierungen.
Diese Technik wurde in Drosophila, Amöben, Mäusen und mehreren In-vitro-Systemen eingesetzt, um das Wachstum von Mikrotubuli zu bekämpfen, um die Zellmigration und die Gewebebildung zu untersuchen.
