Mit diesem Protokoll können wir Zytoneme im fixierten Mausgewebe im gesamten Embryo mit Standard-Lichtmikroskopie sichtbar machen. Mit dieser Technik können wir nach endogenen Signalproteinen suchen, die entlang von Cytonemen wandern, anstatt uns auf genetisch manipulierte Mausmodelle zu verlassen, die fluoreszierend markierte Proteine verwenden. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, Gewebeabschnitte für die optimale Erhaltung von Cytonemen vorsichtig zu behandeln.
Miriam Dillard, eine leitende Forscherin in meiner Gruppe, und Christina Daly, eine St.Jude-Doktorandin, werden dieses Verfahren demonstrieren. Verwenden Sie zunächst eine Sezierschere und eine Pinzette, um einen Y-Schnitt in die Peritonealhöhle zu machen. Die Gebärmutter, die den E 9.5-Embryo enthält, wird entfernt.
Sezieren Sie die Embryonen in vollständigem DMEM-Wachstumsmedium. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Eigelb-SAC, die Plazenta und die umgebenden Membranen zu entfernen. Spülen Sie die isolierten Embryonen in HBSS, um verbleibendes Fruchtfleisch und Blut zu entfernen.
Als nächstes bereiten Sie das Fixiermittel vor, indem Sie Paraformaldehyd zu HBSS für eine Arbeitskonzentration von 4% Paraformaldehyd hinzufügen. Fügen Sie einen Milliliter dieser Lösung zu jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu. Legen Sie die Embryonen in einzelne Brunnen.
Inkubieren Sie die Embryonen 45 Minuten lang mit sanfter Bewegung auf einer Wippe. Entfernen Sie nach der Inkubation das Fixiermittel und waschen Sie die Embryonen dreimal für 30 Minuten in PBS mit zugesetztem Kalzium, Magnesium und 0,1% Triton. Dann inkubieren Sie die Embryonen in Blocklösung mit sanfter Erregung zweimal, jeweils für eine Stunde.
Nach der zweiten Inkubation spülen Sie die Embryonen mit frischer Blockierlösung. In der Zwischenzeit bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie die Antikörper in supplementiertem PBS verdünnen. Nachdem die Spülung abgeschlossen ist, entfernen Sie die blockierende Lösung und fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter primäre Antikörperlösung hinzu.
Bebrüten Sie die Platte bei vier Grad Celsius mit sanfter Drehung für drei Tage. Nach der primären Antikörperinkubation waschen Sie die Embryonen fünfmal mit ergänztem PBS für eine Stunde auf einer Wippe bei 20 U / min. Dann fügen Sie jedem Bohrloch einen Milliliter sekundäre Antikörperlösung hinzu.
Bebrüten Sie die Platte drei Tage lang mit sanftem Schaukeln bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie die Embryonen dreimal für 30 Minuten in supplementiertem PBS. Bereiten Sie eine 4%ige Lösung mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in PBS mit Kalzium und Magnesium vor.
Legen Sie gleichzeitig eine 12-Well-Platte in das 55 Grad Celsius-Perlenbad und fügen Sie jedem Brunnen drei Milliliter Agarose hinzu. Als nächstes legen Sie die Platte auf eine Tischplatte und übertragen Sie die Embryonen mit einem perforierten Löffel in einzelne Vertiefungen. Verwenden Sie Pipettenspitzen, um den Embryo sanft einzubetten und auszurichten, so dass er in der Lösung zentriert ist.
Sobald die Embryonen orientiert sind, legen Sie die Platte für 10 Minuten zur Verfestigung auf minus 20 Grad Celsius. Entfernen Sie dann mit einem Skalpell den gesamten Agaroseblock aus dem Brunnen. Schneiden Sie einen rechteckigen Block um den Embryo herum und lassen Sie etwa 0,3 Zentimeter des Blocks auf jeder Seite zurück.
Lassen Sie eine zusätzliche Länge des Blocks entlang des kaudalen Endes des Embryos. Um den Embryo auf das Vibratom zu montieren, tragen Sie zuerst einen Streifen Klebeband auf den Probenhalter auf. Richten Sie den Embryo in aufrechter Position im oberen Teil des Blocks aus und kleben Sie den Agaroseblock auf das Band, so dass die Klinge axiale Abschnitte in einer vorderen bis hinteren Sequenz erzeugt.
Als nächstes füllen Sie die Vibratomkammer mit kaltem HBSS, um die Probe vollständig einzutauchen und dann die Kammer mit Eis zu umgeben. Stellen Sie die Parameter auf dem Vibratom ein und führen Sie eine serielle axiale Schnittung des Embryos durch. Verwenden Sie eine Pinzette, um einzelne Abschnitte auf eine separate Schale zu übertragen, die mit HBSS gefüllt ist.
Denken Sie daran, eine Pinzette zu verwenden, um nur die Agarose zu halten, um Gewebeschäden und die Zerstörung von Cytonemen zu vermeiden. Um eine F-Aktin-Färbung durchzuführen, entfernen Sie HBSS und inkubieren Sie die Abschnitte für 40 Minuten mit ActinRed und DAPI-Lösung in ergänztem PBS. Nach der Inkubation die Abschnitte dreimal für 20 Minuten in zugesetztem PBS waschen.
Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Markierstift eine Barriere um die Kanten eines geladenen Objektträgers und fügen Sie dem Füllbereich ein kleines Volumen HBSS hinzu. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um Abschnitte auf die Folie zu übertragen. Entfernen Sie überschüssige Agarose mit einer Pinzette.
Sobald alle Abschnitte auf den Objektträger übertragen wurden, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit durch Pipettieren und Verwenden der Ecke eines saugfähigen Handtuchs. Fügen Sie dann mehrere Tropfen Montagemedium zur Folie hinzu. Montieren Sie den Abdeckschlitten, indem Sie ihn vorsichtig auf den Schlitten legen.
Für die Analyse führen Sie eine Bildgebung der Gewebeabschnitte für mindestens drei Embryonen pro Genotyp auf einem konfokalen oder einem hochauflösenden Mikroskop durch. Korrekt ausgerichtete Abschnitte, die mit diesem Protokoll erstellt wurden, werden hier gezeigt. Im Vergleich zur Vibratom-Schnittaufnahme bewahrte die Kryostatenschnitte des Gewebes keine Zellerweiterungen.
Einige GFP-positive Membranfragmente wurden zwischen Zellen des Notochords und des Neuralrohrs und zwischen benachbarten Neuralrohrzellen in Kryostatenabschnitten nachgewiesen. Die F-Aktin-Färbung von Zellerweiterungen in den mesenchymalen Zellen, die das Neuralrohr umgeben, war jedoch in Kryostatenabschnitten beeinträchtigt. Die Vibratom-Schnitte sorgten für eine minimale Störung des gesamten Embryos und einzelner Gewebeabschnitte.
Optimal gehandhabte Abschnitte ermöglichten den Nachweis von Zykonomen zwischen benachbart lokalisierten Neuralepithelzellen der Bodenplatte und mesenchymalen Zellen. Gefaltete oder geknickte Abschnitte zeigten sich durch eine große Trennung zwischen dem Notochord und der ventralen Bodenplatte des Neuralrohrs. Und ein Verlust von zellulären Membranerweiterungen, die zwischen Epithelzellen wandern.
F-Aktin- und DAPI-gefärbte Abschnitte hatten einen konsistenten Abstand von mesenchymalen Zellen und Ktyonemen, die das Neuralrohr und das Notochord umgeben. Geringfügige Verzerrungen der Abschnitte können zu einer Fragmentierung der aktinbasierten Erweiterungen und zur Bildung großer Lücken zwischen den Zellen geführt haben, was die Notwendigkeit einer sorgfältigen Handhabung unterstreicht. Nach dem Embryonenschnitt ist es unerlässlich, das Biegen oder Falten von Gewebeschnitten zu minimieren.
um das Brechen von Cytonemen zu verhindern. Mit dieser Technik können wir direkt visualisieren, wie Signalmoleküle wie Morphogene über Gewebe verteilt werden. Dies gibt uns neue Erkenntnisse darüber, wie Gewebe und Organe strukturiert sind.
