Name: visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization
Uploaded: 2018-06-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization at JoVE.com

Wir danken Dr. Mustafa Khokha, Yale University, für die Bereitstellung von seinem Labor Ressourceneinsatz. Wir sind dankbar, Herr Wu Ming Jie für ausgezeichnete technische Unterstützung. EF ist ein HHMI Investigator. Diese Arbeit wurde durch ein Geschenk von John Monsky und Jennifer Weis Monsky Lyme Disease Research Fund unterstützt.

1. Vorbereitung der DNA-Templates
<ol><li>Die 16 s rRNA Sequenz spezifische auf jede bakterielle Gattungen von NCBI Datenbank und Design Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kompatibel vorwärts herunterladen und reverse Primer, die Gattungen-spezifische Regionen (~ 200-250-Basenpaare lang) verstärken werden, wie oben beschrieben 19. Siehe auch die open-Source-Datenbanken SILVA20,21 und ProbeBase22 Online-Ressourcen für rRNA-gezielte Oligonukleotid Sonden und Grundierungen, RNA-Sonden für einige bakterielle Gattungen kommerziell sein mag zur Verfügung. Hinweis: Es ist wichtig, wählen Genregionen, die nur für bestimmte Gattungen sind und dafür sorgen, dass gestaltete Primer nicht verwandte bakterielle Gattungen verstärken. Dies ist entscheidend für gen/Gattungen-spezifischen Sonde Hybridisierung zu erhalten.</li>
	<li>Ernähren Sie Zecken sich für 24, 48 oder 72 h an Mäusen, Tick Mut zu sezieren und RNA und cDNA von Tick Mut wie beschrieben früheren23vorzubereiten. Verwendung cDNA als Vorlage zur PCR verstärken Gattungen-spezifischen Amplifikate mit einem Thermocycler. Führen Sie eine Aliquote des PCR-Produkt/Amplifikate auf einem 1,5 % Agarose-Gel und bestätigen Sie, dass der erwarteten Größe der Amplifikate durch Visualisierung unter ultraviolettem (UV) Licht mit einem Gel imaging-System entspricht.</li>
	<li>Klonen Sie die bakterielle 16 s ribosomalen RNA Amplifikate von Interesse in einen handelsüblichen TA Vektor (Table of Materials), die RNA-Polymerase Promotoren geeignet für Bakteriophage Polymerasen (SP6, T7 oder T3) enthalten. Die Klone zur Bestätigung der Identität der Amplifikate und die Richtwirkung des Klons in Bezug auf jeden der Promotoren-Sequenz. Bestimmen Sie auf dieser Basis, dass der Veranstalter der Wahl um Sinn oder antisense-RNA zu generieren (Abb. 1) Sonden.</li>
	<li>Linearisieren Sie 1 mg des Plasmids mit einem entsprechenden Beschränkung Enzym in einem Reaktionsvolumen von bis zu 30 µLfor 2 h bei Temperaturen, die vom Hersteller empfohlenen. Wählen Sie Restriktionsenzyme anhand der Projektträger, der verwendet wird, um den Sinn oder antisense-Sonde (Abbildung 1) zu erzeugen. Überprüfen Sie die Linearisierung durch Visualisierung von 2 µL Digest Reaktion auf einem 1 % Agarose-Gel.</li>
	<li>Die restlichen 28 µL verdaute DNA mit Hilfe eines handelsüblichen PCR Produkt Spalte Reinigung-Kits zu reinigen und Quantifizierung der DNA-Konzentration von Spektralphotometer. Hinweis: Einige Sinn-Sonden möglicherweise Hintergrundfärbung viel höher als die entsprechende Antisense-Sonde und andere Optionen können erforscht werden müssen. Alternative Negativkontrollen enthalten Plasmide Codierung Sequenzen in der Probe oder einer anderen Sonde, die ergibt sich ein charakteristisches Muster der Hybridisierung nicht vertreten.</li>
</ol>2. Konstruktion des Digoxygenin-UTP-RNA-Sonden
<ol><li>Bereiten Sie die Nukleotid-Mischung durch die Kombination von 7,5 µL 100 mm UTP, 25 µL 10 mM Digoxygenin-UTP und 10 µL pro 100 mM ATP, GTP und CTP in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Führen Sie in Vitro Transkription mit handelsüblichen T7 oder Sp6 RNA-Polymerase-Kits, mit 1 µL Nukleotid-Mix (Schritt 2.1) und 0,25 - 1 µg DNA-Vorlage. Das Volumen bis zu 20 µL mit Wasser zu bringen. Streichen Sie das Rohr zu kombinieren und Impuls-Spin. Inkubation bei 37 ° C für 2,5-3 h. Hinweis: Sonde Bau war erfolgreich mit verdaute Plasmid Konzentrationen so niedrig wie 7 ng/µL, aber typische Konzentrationen an diesem Schritt reichen von 15-25 ng/µL. Die Transkription Reaktion kann auch über Nacht bei 37 ° C inkubiert werden, aber dies erhöht sich nicht deutlich die RNA-Ausbeute.</li>
	<li>Fügen Sie 1 µL DNase (2.000 Einheiten/µL) und bei 37 ° C für 10 min inkubieren. 10 min nicht überschreiten, oder das Enzym kann beginnen, erniedrigende RNA.</li>
	<li>Fügen Sie 30 µL eiskalte 7,5-8 M Lithiumchlorid und 30 µL Nuklease-freie Kaltwasser, überstürzen sich die RNA. Streichen Sie das Rohr zu mischen. Lassen Sie Ausfällung von RNA über Nacht bei-20 ° c gehen</li>
	<li>Sammeln Sie RNA durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 20 min bei 4 ° C. Waschen Sie das Pellet einmal mit 1 mL frisch zubereitete 75 % Ethanol in Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Wasser zu, dann wiederholen Sie Zentrifugation.</li>
	<li>Entfernen den überstand verwerfen, Invertieren Sie das Rohr auf einem sauberen Papiertuch und trocknen lassen für 10 min. Aufschwemmen das Pellet in Nuklease-freies Wasser. Wenn die Pellets leicht sichtbar ist, in 25 µL aufzuwirbeln. Wenn das Pellet sehr klein oder nicht sichtbar ist, Aufschwemmen in 15-20 µL. erhalten eine Schätzung der RNA-Konzentration durch Spektralphotometer. Hinweis: Typische RNA-Konzentrationen reichen von 200-500 ng/µL.</li>
</ol>(3) Visualisierung der RNA-Sonden durch RNA Formaldehyd Gelelektrophorese RNA Reinheit bewerten
Achtung: Formaldehyd birgt die Gefahr eines Einatmen; Daher generiert die Lösungen für RNA Gelanalyse unter einem Abzug. Interkalation bromid ist karzinogenverdächtig; mit Vorsicht handhaben.
<ol><li>Bereiten Sie eine 1 % Formaldehyd-Agarose-Gel, wie zuvor24 beschrieben und warf das Gel in einer Gel-Box frei von RNases. Nach dem Abkühlen, füllen Sie die Gel-Box mit 1 x Puffer (1 X MOPS bei pH 7,0, 5 % Formaldehyd) laufen.</li>
	<li>Bereiten Sie den Probenpuffer (5 µL 400 mg/mL Interkalation Bromid, 20 µL 10 x MOPS, 35 µL Formaldehyd und 100 µL Formamid). Kombinieren Sie 2 µL RNA-Sonde (Schritt 2.6) mit 8 µL Probenpuffer. Bei 70 ° C für 10 min inkubieren.</li>
	<li>Bereiten Sie RNA laden Puffer durch die Kombination von 5 mL 50 % Glyzerin, 1 mL 10 % Formaldehyd 40 mg Bromophenol blue, 40 mg Xylol Cyanol und 20 µL 0,5 M EDTA (pH 7,5). Nach dem Gebrauch speichern dieser Puffer bei-20 ° C.</li>
	<li>3 µL Puffer laden die RNS-Probe aus Schritt 3.2 hinzufügen und mischen. Halten Sie Probenröhrchen auf Eis.</li>
	<li>Laden Sie das gesamte Probenvolumen aus Schritt 3.4 in das Gel. Laden Sie eine Aliquote einsträngige RNA Leiter neben um RNA Größe zu überprüfen. Führen Sie das Gel bei 100 V oder senken Sie, bis der blaue Farbstoff ca. 75 % der Weg nach unten das Gel wandert. Visualisierung der RNS unter UV-Licht mit einem Gel-imaging-System. Hinweis: Eine gute Qualität-RNA-Sonde sollte als diskrete Band mit einer Mobilität, die entsprechend der erwarteten Größe der Sonde (Abbildung 2, Spur 1) angezeigt. Wenn die Sonde als diffus und schmierig Band (Abbildung 2Lane 2) erscheint, dies sollte nicht verwendet werden.</li>
</ol>4. kreuzen Sie Darm Sammlung und Fixierung
<ol><li>Sammeln Sie Ixodes Scapularis Nymphen, die genährt haben bei Mäusen nach der Zeit Points of Interest. Hinweis: Für die Zwecke dieser Technik gefüttert Zecken am besten für 48 oder 72 h Arbeit.</li>
	<li>Zerlegen Sie den Darm von der Zecke in MEMFA (Tabelle 1) auf einen Glasobjektträger Mikroskop Dissektion, Vermeidung von Schäden an der Orgel so weit wie möglich. Setzen Sie ein Häkchen auf einen sauberen Objektträger in 20-30 µL des MEMFA. Mit ein paar sterile High-Carbon Stahl Klinge #11 Stück des Kopfes am Scutum der Zecke aus dem Körper der Zecke. Drücken Sie sanft den Körper, um den Darm Divertikel und Speicheldrüsen, die Körper Nagelhaut schieben. Die Speicheldrüsen und den Darm zu trennen und Schaufel den Mut auf der Rasierklinge.</li>
	<li>Sammeln Sie Mut in einem 1,5 mL Röhrchen mit 500 µL MEMFA. Inkubieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur mit sanftes Schaukeln für 1 Stunde oder über Nacht bei 4 ° C. Hinweis: Speicheldrüsen der Zecke kann auch seziert und ebenso fixiert und gefärbt.</li>
	<li>Entwässern Sie das Gewebe durch Waschen sanft 3 Mal mit 1 mL eiskaltes 100 % Ethanol. Lassen Sie den Mut, die natürlich auf den Grund des Rohres zwischen jedem Waschgang sinken, Zentrifugation das Gewebe beschädigen. Halten Sie für die langfristige Lagerung die Proben in 100 % igem Ethanol bei-20 ° C.</li>
</ol>5. Bau von Mesh Probe Körbe und 24 Wohlen Korbträger
<ol><li>Schneiden Sie die Böden von 2 mL oder 5 mL Snap-Top Zentrifuge Röhren mit einer beheizten einschneidig Rasierklinge auf ein Skalpell. Achtung: Die Klinge möglicherweise müssen Sie mehrmals aufgewärmt werden, bevor der Schnitt abgeschlossen ist.</li>
	<li>Schneiden Sie Quadrate von 110 µm-Nylon-Mesh etwas größer als die neue Röhre Öffnung. Binden Sie das Netz auf den Boden des Rohres durch zusammendrücken sie leicht auf einer heißen Platte auf mittlerer Hitze bis eine gute Abdichtung vorgenommen wird. Lassen Sie abkühlen, sicherzustellen Sie, dass keine Lücken zwischen dem Netz und den Schlauch, und schneiden Sie überschüssiges Gewebe an den Rändern.</li>
	<li>Löcher in den Deckel von einer 24-Well-Platte geschnitten, so dass die Lippe der Probe Korb gemacht im Schritt 5.2 am Loch sitzen und nicht durchfallen, nachgeben ein Setup, wo werden die Böden der Körbe Probe ganz in den Vertiefungen sitzen, wenn sie in platziert werden, die Löcher in der Abdeckung.</li>
	<li>Verwenden Sie diese angepassten korbträger Körbe mit relativer Leichtigkeit für die Gesamtheit der in Situ Hybridisierung Protokoll von einer Platte auf einen anderen übertragen. Verwenden Sie zwei 24-Well-Platten, so dass während einer Inkubation stattfindet, die andere Platte für die nächste Wäsche bereit ist.</li>
</ol>6. in Situ Hybridisierung: Tag 1 (Timing: 4-5 Std.)
<ol><li>Transfer-Mut, beschriftet Probe Körbe, getrennt durch versuchsbedingung und RNA-Sonde bestimmt. Hinweis: Flecken von mindestens 5 Mut pro Zustand, um natürliche Unterschiede zwischen den Wiederholungen zu berücksichtigen.</li>
	<li>Rehydrieren Sie die Proben vorsichtig, um zu vermeiden, Einführung von Luftblasen in das Gewebe durch die schrittweise Erhöhung des Verhältnisses von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % nichtionische Tenside (PTw; Tabelle 1) zu Ethanol in den Waschungen. Hinweis: Schließe alle wäscht in 24 Wohlen korbträger bei Raumtemperatur mit sanften Agitation, sofern nicht anders angegeben. Aliquoten 500-600 µL Waschlösungen in jede Vertiefung des Inhabers so, dass die Eingeweide in jedem Korb vollständig eingetaucht sind. Bereiten Sie alle Lösungen mit DEPC-behandeltem Wasser, RNA-Abbau zu verhindern.<ol>
<li>Gewaschen Sie die Proben für 5 min in 500 µL 100 % igem Ethanol werden.</li>
		<li>Bereiten Sie mindestens 500 µL pro Probe Korb von 75 %, 50 % und 25 % Ethanol in PTw. rehydrieren die Proben durch Waschen für 5 min in jeder Umzug von der höchsten ethanolkonzentration auf den niedrigsten Ethanol-Lösung.</li>
		<li>Waschen Sie die Proben 4 mal 5 min in PTw.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilize der Proben mit Proteinase K (10 µg/mL) in 5 min PTw.</li>
	<li>Bereiten Sie das Gewebe für die Hybridisierung mit der RNA-Sonden.<ol>
<li>Waschen Sie die Proben zweimal wie in 6.2 in 24 Wohlen korbträger bei Raumtemperatur mit sanften Agitation für 5 min in 500 µL Triethanolamin Puffer (0,1 M, pH 7.0-8.0) (Tabelle 1) weiterhin die Proben in einem Amin-freie Umgebung beschrieben.</li>
		<li>Behandeln Sie die Proben zweimal mit 500 µL 0.25 % Essigsäureanhydrid in Triethanolamin Puffer (0,1 M, pH 7.0-8.0) für 5 min, dann waschen Sie die Proben zweimal in PTw für 5 min. Hinweis: Die Essigsäureanhydrid acetylates freie Amine um positive Ladung, der ist entscheidend für verhindern elektrostatische Wechselwirkungen unspezifische und spezifische Bindung der Sonde zu mRNA zu neutralisieren.</li>
		<li>Befestigen Sie den Mut für 20 min mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd in PTw, dann waschen Sie 5 Mal für 5 min in PTw.</li>
		<li>Prehybridize durch Inkubation der Proben in 500 µL Hybridisierung Puffer /in 24 Wohlen korbträger in der 24-well-Platte (Tabelle 1) 1,5-2,5 Stunden bei 60 ° C mit sanften Agitation im Wasserbad schütteln. Speichern des Hybridisierung Puffers verwendet für den prehybridization Schritt zur Wiederverwendung in der Tag-2-Protokoll (Schritt 7.1).</li>
		<li>Bereiten Sie Sonde Hybridisierung Lösungen durch RNA-Sonden in Hybridisierung Puffer, eine Endkonzentration von 1 µg/mL zu verdünnen.  Inkubieren Sie Proben mit Sonde Hybridisierung Lösungen in der 24-Well korbträger bei 60 ° C mit sanften Agitation über Nacht in einem schütteln Wasserbad (Tabelle 2). Die Abdeckplatte tragen die korbträger behaglich mit Alufolie um Verdunstung der Hybridisierung Lösung zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. in Situ Hybridisierung: Tag 2 (Timing: 4,5-5,5 h)
<ol><li>Entfernen Sie die Proben aus der Sonde Hybridisierung Lösungen und legen Sie sie in den reservierten Hybridisierung Puffer vom Vortag. Bei 60 ° C mit sanften Agitation für 3 min inkubieren. Hinweis: Sonde Hybridisierung Lösungen können bei-20 ° C zur Wiederverwendung bis zu 3 Mal gespeichert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 x Kochsalzlösung-Natrium-Citrat-Puffer (SSC) durch Verdünnung 20 X SSC in DEPC-behandeltem Wasser (Tabelle 1). Waschen Sie die Proben zweimal für 3 min mit 2 x SSC, dann 3 Mal für 20 min mit 2 X SSC bei 60 ° C, alle Spuren von Sonde und Hybridisierung Puffer zu entfernen.</li>
	<li>Behandeln mit RNase ein (20 µg/mL) und RNase T1 (10 µg/mL) 2 x SSC für 30 min bei 37 ° C zu entfernen, einzelne gestrandet vertritt freie RNA-Sonde hybridisiert RNA.</li>
	<li>Waschen, einmal mit 2 X SSC für 10 min bei Raumtemperatur. Bereiten Sie 0,2 X SSC durch Verdünnung 2 X SSC in DEPC-behandeltem Wasser, dann waschen Sie zweimal mit 0,2 X SSC für 30 min bei 60 ° C, überschüssige RNases zu entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie zweimal mit 500 µL Puffer Maleic Acid (MAB; Tabelle 1) für 10 Minuten.</li>
	<li>Inkubieren Sie Proben mit blockiert Lösung (2 % blocking Reagenz in MAB) für 1,5-2 h. Hinweis: Das blockierende Reagenz kann schwierig zu lösen sein; sanfte Erwärmung hilft Auflösung.</li>
	<li>Ersetzen Sie die blockierende Lösung mit Anti-Digoxigenin alkalische Phosphatase konjugiert 500 µL Antikörper bei einem 1:3,000 Verdünnung in blocking-Lösung und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur für ca. 4 h oder bei 4 ° C.</li>
</ol>8. in Situ Hybridisierung: Tag3 (Timing: 6 h, Übernachtung)
<ol><li>Waschen Sie die Proben mindestens 5 mal 30 min mit 500 µL MAB, überschüssige Antikörper zu entfernen. Hinweis: Diese Waschungen sind flexibel und können verlängert werden, um 1-2 h, oder 3-4 Wäschen können für eine Übernachtung zu waschen bei 4 ° C mit minimalen Auswirkungen auf die Wirksamkeit ersetzt werden.</li>
	<li>Waschen Sie zweimal für 5 min mit alkalischer Phosphatase-Puffer, pH 9,5 (AP-Puffer; ( Tabelle 1).</li>
	<li>Beginnen Sie die Farbreaktion, indem der letzten Wäsche mit 500 µL des chromogenen Substrates für alkalische Phosphatase (Table of Materials). Decken Sie Probenteller mit Alufolie ab und gehen lassen Sie, die Färbung bei Raumtemperatur für 3 - 5 h oder über Nacht bei 4 ° c gehen Sie Überwachen Sie die Färbung Reaktion in regelmäßigen Abständen durch Anzeigen des Gewebes unter dem sezierenden Mikroskop um overstaining zu vermeiden. Hinweis: Wenn die Färbung abgeschlossen ist, ein lila Farbton ist von Auge in der Antisense-sondiert Proben unter dem Mikroskop erkannt, aber das Gewebe darf nicht zu sehr dunkel geworden. Färbung kann geht sehr langsam bei 4 ° C und bis zu 20-24 Uhr.</li>
	<li>Die Farbreaktion durch Waschen für 5 min in 500 µL MAB stoppen, dann das Gewebe über Nacht in Bouins Lösung zu beheben. Achtung: Behandeln Sie die Bouins Lösung in einer Dampfhaube; Es ist eine ätzende Karzinogen.</li>
</ol>9. in Situ Hybridisierung: Tag 4 (Timing: 3-3,5 h)
<ol><li>Bereiten Sie mindestens 7 mL pro Probe Korb 1 X SSC durch Verdünnung 20 X SSC in DEPC-behandeltem Wasser. Entfernen Sie die Bouins Lösung durch Waschen der Proben 4 bis 6 Mal mit 70 % Ethanol in 1 X SSC bis das Gewebe nicht mehr gelb ist.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 µL pro Probe Korb von 75 %, 50 % und 25 % Ethanol Lösungen in 1 X SSC. Waschen Sie die Proben 5 min in jeder Lösung Verschieben von höchsten ethanolkonzentration auf niedrigsten das Gewebe zu rehydrieren. Waschen zweimal für 5 min jeweils in 1 X SSC.</li>
	<li>90 min auf einem Leuchtkasten in einer Dampfhaube Proben in das Bleichmittel-Lösung (Tabelle 1) inkubieren. Hinweis: Dieser Schritt erlaubt Pigmentierung in den Proben oder Färbung von Bouins Lösung entfernt werden und erhöht die Sonde Signal für die übersichtliche Visualisierung.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben zweimal mit 500 µL 1 X SSC für 5 Minuten.</li>
	<li>Die Eingeweide mit minimalen Schäden durch Umdrehen des Probe-Korbes in einen Brunnen einen neuen 24-Well-Platte zu verlagern und Waschen mit 70 % Ethanol durch den Netz-Boden mit einer transferpipette. Aufbewahren Sie bei-20 ° C, bei Bedarf.</li>
	<li>Um eine Übersicht über die Färbung Muster von mehreren Proben, wie in Abbildung 3, pflegen Sie die Eingeweide in 70 % igem Ethanol in der 24-Well-Platte und Sicht mit jedem Hellfeld Mikroskop. Zu einzelnen Mut unter dem Hellfeld Mikroskop zu untersuchen, wie in Abbildung 4, Abbildung 5gezeigt, und Abbildung 6, montieren Sie die Eingeweide in 100 % Glycerin unter Deckgläsern. Mit einem Spatel aus Kunststoff, um sanft das Gewebe mit minimalen Schäden zu manipulieren. Hinweis: Die hohe Viskosität des Glycerins schützt das Gewebe vor Schäden durch Kompression und ermöglicht die sorgfältige Positionierung der Divertikel so, dass das Gewebe optimal bei höheren Vergrößerungen angezeigt werden kann.</li>
	<li>Aufnahmen auf dem Mikroskop mit Mikroskop bestimmtes Image Capture-Software (Table of Materials) und als TIFF-Bilder zu einem generischen Bildbearbeitungs-Software exportieren. Zur Quantifizierung der relativen Färbung Unterschiede zwischen experimentelle Behandlungen herunterladen Sie eine generische Bildanalyse-Software (Table of Materials). Öffnen Sie das Bild in der Analysesoftware und verwenden Sie die Anweisungen in der Software zur Messung Pixel Intensität der Färbung und Histogramm Grundstücke der Färbung zu berechnen.</li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+gel+electrophoresis+of+total+RNA.">Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA.</a> Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ribosomopathy+genes+during+Xenopus+tropicalis+embryogenesis.">Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis.</a> BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).</li><li>Khokha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development.">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li><li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+DOPE+(double+labeling+of+oligonucleotide+probes)-FISH+(fluorescence+in+situ+hybridization)+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations.">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li><li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner.">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li><li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos.">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Dies ist die erste Verwendung einer vollständig-hängen in Situ Hybridisierung (WMISH)-Technik, die Mikrobiota ein Arthropoden Vektor von Krankheitserregern zu studieren. Unser Protokoll wurde von einem zur Entwicklung von Drosophila und Frosch-Embryonen25,26Untersuchung angepasst. Vollständig-hängen RNA in Situ Hybridisierung wurde routinemäßig verwendet, um gen Transkripte räumlich zu lokalisieren und zeitlich2...

Mensch und Vieh Krankheitserreger übertragen durch Arthropoden Vektoren finden sich weltweit und entfallen etwa 20 % von Infektionskrankheiten weltweit1, aber effektiv und sichere Impfstoffe gegen die meisten dieser Erreger sind nicht verfügbar. Unser Verständnis für die Bedeutung von Kommensalen, symbiotische und pathogenen Mikroorganismen, zusammen bekannt als Mikrobiom2, Modulation und Formen die Gesundheit fast aller Metazoen3 erweitert. Es ist nun offensichtlich, dass Arthropoden Überträger von Krankheitserregern auch Darm Microbiota Hafen und dieser Vektor-assoziierten Mikrobiota haben gezeigt, dass verschiedene Vektoren übertragene Krankheitserreger4,5beeinflussen. Die Arthropoden Microbiome besteht aus Eubakterien, Archaeen und Viren eukaryotic Mikroben wie Protozoen, Nematoden und Pilze6. Aber wurde die vorherrschende Forschungsschwerpunkt Eubakterien zurückzuführen, zum Teil, um die Verfügbarkeit von Markergenen und Referenzdatenbanken, bestimmte bakterielle Mitglieder zu identifizieren.
Mit einem Fokus auf Ixodes Scapularis, die Zecke Vektor mehrere humanpathogene Erreger Borrelia Burgdorferi7, einschließlich der Erreger der Lyme-Borreliose, die Optimierung der mikrobiellen Visualisierungstechnik zielte ein besseres Verständnis der Zecke Darm Microbiota im Zusammenhang mit Vektor-Pathogen Interaktionen. Einige Fragen bleiben, um im Feld Tick Microbiome beantwortet werden. Der Darm ist die Website der erste längere Begegnung zwischen der Zecke und der eingehenden Erreger im Zusammenhang mit horizontal übertragenen Krankheitserreger; Daher wird das Verständnis der Rolle der Vektor Darm Microbiota Modulation Vektor-Pathogen Interaktionen aussagekräftige Erkenntnisse offenbaren. Zecken haben eine einzigartige Art der Blutmahlzeit Verdauung, wo Platz Verarbeitung der Blutmahlzeit Komponenten erfolgt intrazellulär8. Die Darm-Lumen scheinbar dient als Gefäß für die Blutmahlzeit der Zecke Feeds enthalten, und Nährstoff Verdauung und Assimilation ergeben in den Tagen der Fütterung und weiter nach Übersättigung. Die Krankheitserreger erworben von der Zecke während der Fütterung geben Sie das Darm Lumen zusammen mit dem Blutsaugen und somit das Lumen eines primären Standorts von Interaktionen zwischen den Tick, Erreger und resident Mikrobiota. Im weiteren Verlauf Verdauung durch die Kalorienzahl und Ixodid Häckchen Häutung erfährt der Darm strukturelle und funktionelle Veränderungen9. Die Zusammensetzung und die räumliche Organisation der Darmbakterien dürfte auch im Konzert mit den wechselnden Darm-Milieu zu variieren. Deshalb ist es wichtig, die Architektur der ansässigen Bakterien im Darm zu verstehen, das Zusammenspiel von Tick, Erreger und Darm Microbiota Tick zu verstehen.
Molekulare Techniken, um Host-assoziierten Mikrobiota routinemäßig beschreiben nutzen parallel Hochdurchsatz-Sequenzierung Strategien10 zu verstärken und zu sequenzieren bakterielle 16 s ribosomalen DNA (rDNA). Diese Abfolge Strategien umgehen axenic Kulturen von bestimmten Bakterien zu erhalten und bieten eine ausführliche Beschreibung aller bakteriellen Mitglieder in der Stichprobe vertreten werden müssen. Dennoch sind solche Strategien durch die Unfähigkeit, ökologische Verunreinigungen von Bona Fide Bewohner unterscheiden verwechselt. Weiter, bei der Beurteilung von Proben, wie Zecken, die sind klein und daher enthalten geringe Mikrobiota-spezifische DNA ergibt, die Wahrscheinlichkeit der Verstärkung von Umweltschadstoffen erhöhte11 und führt die zweideutige Interpretation des Microbiome Zusammensetzung. Funktionelle Charakterisierung in Verbindung mit der Visualisierung von bestimmten lebensfähige Bakterien, daher werden kritisch zu definieren und zu erkennen das Mikrobiom der Zecke, zeitlich und räumlich. Auf dieses Ziel nutzten wir die gesamte-Mount RNA in Situ Hybridisierung. Diese Technik wird routinemäßig verwendet, um gen Expressionsmuster in Organen und Embryonen12,13,14 beurteilen und ermöglicht semiquantitative Analyse des Ausdrucks über die gesamte Stichprobe von Interesse. Dies unterscheidet sich von traditionellen in Situ Hybridisierung Techniken die Gewebeschnitte nutzen und erfordern häufig umfangreiche Analyse des geschnittenen Materials mit einer rechnerischen Versammlung Ausdruck in ganze Organe15vorherzusagen. Während vollständig-hängen in der Regel auf ganze Organismen12bezieht, bezieht sich hier ganze-Mount auf ganze Eingeweide und Organe. Die Vorteile der Verwendung von ganz-Mount RNA in Situ Hybridisierung Ansatz um zu beurteilen, die Architektur der Zecke Darm Microbiota sind vielfältig. Die Zecke Darm besteht aus 7 Paar Divertikel, jedes Paar unterschiedlicher Größe16. Die funktionalen Unterschiede, wenn jemand unter dieser Divertikel nicht im Zusammenhang mit der Zecke Biologie verstanden werden kreuzen Mikrobiota oder Tick-Pathogen Interaktionen. Manipulationen des Darms, die den Darm Divertikel platzen würde Mikrobiota in das Lumen des Darms oder die lose mit den Darm und führen zu Fehlinterpretationen der räumliche Lokalisation der Mikrobiota verdrängen. Fluoreszenz-markierte RNA in Situ Hybridisierung wurde früher verwendet worden, um Tick Darm Transkripte17 untersuchen durch Fixierung und öffnen einzelne Darm Divertikel Sonde Hybridisierung zu gewährleisten und B. Burgdorferi zu lokalisieren Abschriften von Paraffin-eingebetteten ganze Zecken18-Schnitt. Beide Ansätze erfordern Manipulationen der Zecke Gewebe vor der Hybridisierung, die die Darm Microbiota Architektur beeinflussen würden.
In diesem Bericht beschreiben wir ausführlich das Protokoll um tragfähige Tick Darm Microbiota mit vollständig-hängen in Situ Hybridisierung (WMISH) zu untersuchen. Die Verwendung von ganzen-Mount RNA in Situ Hybridisierung ermöglicht ein globales Verständnis der Gegenwart und Fülle von bestimmten Darmbakterien in den verschiedenen Regionen des Darms und kann neue Einblicke in die Zecke Darm Biologie im Rahmen des Erregers Kolonisation Sporn und Getriebe. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von RNA-Sonden, die gegen bestimmte bakterielle RNA Erkennung von lebensfähigen Bakterien im Darm von Zecken.

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I(RNAse-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 RNA synthesis kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Water, RNase-free, DEPC-treated</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37%</td><td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>RNA from torula yeast</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin, sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt&#039;s Solution, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Chromogenic substrate for alkaline phosphatase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&#039;s solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Single stranded RNA ladder</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;#11 High-Carbon steel blades&amp;nbsp;</td><td>C and A Scientific Premiere</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>DS-500E Digital Orbital shaker</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Gel&amp;nbsp; documentation system</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ Gel documentation system</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Light box</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Image capture software</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>Image editing software&amp;nbsp;</td><td>Adobe&amp;nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 version 11.0</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>Automation compatible instrumentation</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&amp;nbsp;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization

Infektionskrankheiten, die durch Arthropoden Vektoren übertragen weiterhin eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit weltweit dar. Die Erreger dieser Krankheiten verursachen existieren nicht isoliert, wenn sie den Vektor kolonisieren; vielmehr führen sie wahrscheinlich Interaktionen mit ansässigen Mikroorganismen im Darm Lumen. Die Vektor-Mikrobiota nachgewiesen wurde, eine wichtige Rolle bei der Übertragung der Erreger für mehrere vektorübertragene Krankheiten. Ob ansässige Bakterien im Darm der Zecke Ixodes Scapularis , der Vektor der mehrere humanpathogene Erreger Borrelia Burgdorferi, einschließlich Tick Übertragung von Krankheitserregern beeinflussen werden nicht bestimmt. Wir benötigen Methoden zur Charakterisierung der Zusammensetzung der Bakterien ermöglichen ein besseres Verständnis der Interspezies Wechselwirkungen im Darm Tick Tick Darm zugeordnet. Mit vollständig-hängen in Situ kann Hybridisierung, RNA-Transkripte, die verbunden sind mit bestimmten Bakterienarten zu visualisieren für die Sammlung qualitativer Daten in Bezug auf die Häufigkeit und Verteilung der Mikrobiota in intaktem Gewebe. Diese Technik kann verwendet werden, um Änderungen im Darm Microbiota Milieu im Laufe der Zecke, die Fütterung zu überprüfen und kann auch angewendet werden, um die Expression von Genen Tick zu analysieren. Färbung des ganzen Tick Eingeweide Ausbeute Informationen über die grobe räumliche Verteilung der Ziel-RNA im Gewebe ohne die Notwendigkeit für dreidimensionale Rekonstruktion und weniger Umweltverschmutzung, die häufig die Sequenzierung-basierte verwirrt betroffen ist Methoden, die häufig verwendet, um komplexe mikrobielle Gemeinschaften zu studieren. Insgesamt ist diese Technik ein wertvolles Instrument, das besser genutzt werden kann Vektor-Erreger-Mikrobiota Interaktionen und ihre Rolle bei der Übertragung von Krankheiten zu verstehen.

Die Messung und Einschätzung der Qualität der RNA-Sonden sind kritische vor Beginn der Färbung. In-vitro- Transkription Effizienz hängt in hohem Maße auf die Menge und Qualität der DNA-Vorlage. Wir visualisieren routinemäßig die RNA-Sonden auf einem Formaldehyd-Gel zur Überprüfung der Reinheit und Menge der Sonde durch die Transkription Reaktionen erzeugt. Die Sonden erscheint als helles, diskrete Banden (Abbildung 2). Photometrische Messun...

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Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein von lebensfähigen Mikrobiota in Tick Eingeweide mit einem modifizierten vollständig-hängen in-situ Hybridisierung Ansatz räumlich und zeitlich zu bewerten.

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Research

JoVE Journal

Genetics

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

9.5K Aufrufe.  Yale University School of Medicine. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein von lebensfähigen Mikrobiota in Tick Eingeweide mit einem modifizierten vollständig-hängen in-situ Hybridisierung Ansatz räumlich und zeitlich zu bewerten.

Serie: Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Forschung

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Immunologie und Infektion

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Verfolgung von Krankheitserregern im ganzen Organ durch Quantifizierung von fluoreszierenden Reportern

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der bakteriellen Reaktionen auf Antibiotika und Immunsystem in Geweben

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Zusammenfassung

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Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen