Dieses Projekt wurde unterstützt von NPU ich LO1417 (Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik).

1. Vorbereitung von biologischem Material
<ol><li>Bereiten Sie biologisches Material, mit dem Ausdruck des eindringmittel tagged Proteins von Interesse sowie eine cytoplasmatische Markierung vor. Folgen Sie den Anweisungen in der Einleitung erwähnt.</li>
</ol>(2) konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
<ol><li>Das Material vorbereitet in Abschnitt 1 mit FM 4-64 Farbstoff7Fleck.<ol>
<li>Wenden Sie eine Färbung Protokoll, die für das untersuchte Material geeignet ist. Färben Sie für BY-2 tabakzellen 200 μl Zellsuspension mit 0,2 μl 10 mm FM 4-64 Lösung in Dimethylsulfoxide. Hinweis: Die typische Färbung Konzentration von FM 4-64 Farbstoff geht 10 μM mit 10 mM Stammlösung in Dimethylsulfoxide. Verwenden Sie die niedrigste Konzentration von FM 4-64 für richtige Färbung und inkubieren Sie Zellen auf Eis (FM 4-64 und niedrige Temperatur können Plasmamembran Eigenschaften beeinflussen) nicht. Fahren Sie mit Beobachtung konfokalen Mikroskopie sofort verwenden. Das Intervall zwischen der Färbung und die Bildaufnahme sollte nicht länger als 10 Minuten sein; Andernfalls wirkt Endozytose des Farbstoffs der FM 4-64 Färbung.</li>
		<li>Verarbeiten Sie mehrere Proben nacheinander zu, und keine Flecken Sie, die Proben zu Beginn des Experiments.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erfassen eines Konfokalen Querdurchmesser pro Zelle.<ol>
<li>Legen Sie eine sequenzielle Zweikanal-Scannen für den Chromophor als Protein-Tag (der erste Kanal muss) und FM 4-64 (der zweite Kanal muss) verwendet. Legen Sie eine höhere optische Auflösung (10 – 20 px/μm). Ein Beispiel-Setup: 63 X Öl Immersion Ziel, NA 1.3, Bildgröße 1.024 x 1.024 px. Sicherstellen Sie, dass die Plasmamembran Ebene senkrecht auf die konfokale Schnittebene in der aufgenommenen Bilder.</li>
		<li>Mindestens 20 Zellen pro Probe müssen genügend Daten für die statistische Auswertung zu erfassen (abhängig von der Signal-Variabilität in verarbeiteten Materials).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. erforderliche Softwareinstallation
<ol><li>Installieren Sie Fidschi ImageJ Verteilung8und das gewünschte Makro peripheren.<ol>
<li>Herunterladen Sie Software von der Website https://fiji.sc/#download und installieren Sie sie nach dem Auspacken.</li>
		<li>Starten Sie Fidschi durch Doppelklick auf die Datei "ImageJ(.exe)" in das entpackte Verzeichnis "Fiji.app".</li>
		<li>Ein Makro "peripheren" von der folgenden Website herunterladen: http://kfrserver.Natur.cuni.cz/LiDE/vosolsob/Peripheral/Source/Peripheral_.IJM.</li>
		<li>Wählen Sie in Fidschi, Plugins | Makros | Installieren... im Haupt-Menü und geben Sie den Pfad auf die heruntergeladene Datei "Peripheral_.ijm." Hinweis: Zwei neue Tools des installierten Makros "peripheren" erscheint in der Symbolleiste Fidschi: "Nehmen Sie Profil Tool" und "Peripheren Protein-Menü".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installieren Sie die R-Projekt Software9und benötigten Pakete.<ol>
<li>Folgen Sie den Anweisungen auf der Website https://cloud.r-project.org/ für R-Projekt Installation. Hinweis: Die gesamte Analyse wird in Fidschi durchgeführt werden. Die R-Software wird nur intern aufgerufen werden durch das Fidschi-Makro "peripheren" während der Berechnung.</li>
		<li>R-GUI ausführen, wählen Sie -Pakete | Installieren Sie Pakete... im Hauptmenü und geben Sie den nächsten Repository und Paket "ggplot2" für die Installation. Hinweis: Alternativ zum R Befehlszeilen eingeben: install.packages("ggplot2").</li>
		<li>Das Ziel eine periphere R-Paket herunter: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Durch die Auswahl Pakete zu installieren | Installieren Sie Pakete aus lokalen Dateien.... Hinweis: Alternativ geben Sie auf der Befehlszeile R diesen Befehl nur: install.Packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", Repo = NULL, Typ = "Quelle").</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Bildanalyse in Fidschi
<ol><li>Die konfokale Bilder der zytoplasmatischen Marker zu verarbeiten.<ol>
<li>Importieren Sie die Bilder nach Fidschi mit Plugins | Bio-Formate | Bio-Formate Importeur Fidschi im Menü mit den Standardeinstellungen.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob der Bio-Formate-Importeur die Bild-Kalibrierung richtig erkannt. Die Bild-Dimension im oberen linken Feld Bild Informationsfenster angezeigt muss die Originalmaße Bild entsprechen.</li>
		<li>Nicht ordnungsgemäß kalibriert behandeln Bilder mit den falschen Abmessungen individuell, z. B.durch die Einstellung der richtigen Parameter im Dialogfenster analysieren | Legen Sie Maßstab... Fidschi im Menü: füllen Sie die Breite des Bildes in Pixel in das Feld " Abstand in Pixel " und die wirkliche Breite in der entsprechenden Längeneinheit im Feld Abstand bekannt ). Hinweis: Wenn die Leica LCS LEI-Dateien nicht ordnungsgemäß kalibriert sind, folgen Sie Schritt 4.2.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie das Import-Optionen Makro für eine Analyse-Set-up. Das Makro aktivieren, indem Sie eine der drei Möglichkeiten: Wählen Sie Plugins | Makros | Import-Optionen [f1] in Fidschi-Hauptmenü, wählen Sie das gleiche Element nach Klicken auf das Menü Werkzeug Peripheren Protein Menüoder drücken Sie die Tastatur-Abkürzung F1. Legen Sie den Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro.<ol>
<li>Lösen Sie bei der Leica LCS LEI Format unsachgemäße Kalibrierung durch Leica.lei Bilder Kontrollkästchen aktivieren. Diese Option importiert ordnungsgemäß die Bildabmessungen aus der Datei mit der Endung "Lei".</li>
		<li>Definieren Sie den entsprechenden Wert im Feld Gaussian blur Radius (px). Dies beeinflusst Bild glätten und Lärm-Reduzierung. Ein niedriger Wert (1 px) ist ausreichend und verursacht keine Verluste Bild Informationen.</li>
		<li>Legen Sie einen Wert im Feld Profil Linienbreite (px). Eine dickere Linie verursacht höhere Glättung der Profilkurven. Ein Standardwert 10 wird px empfohlen.</li>
		<li>Legen Sie einen Bildtitel Analyse durch die Definition von "Probe Trennzeichen" und "Exportierte Elemente." Hinweis: Ein Bildtitel (Dateinamen ohne Erweiterung, z. B.: "Experiment-1_line-02_cell-11") wird um die Charaktere, die im Feld "Sample Trennzeichen" aufgeführt aufgeteilt werden (z.B.: "-_") in einer Reihe von Elementen ("Experiment", "1"," "Linie", "02", "Zelle" und "11") als Gruppierung Faktoren (Probe, Zelle, Zeile oder Behandlung Identität) in der folgenden Analyse verwendet werden können. Definieren Sie, welche Elemente verwendet werden, durch Eingabe ihrer Sequenznummer ("0" für das erste Element) in den eingereichten "Exportiert Elemente." Verwenden Sie Leerzeichen getrennte Format, z. B."3 5." In diesem Beispiel werden "02" und "11" bezeichnet als Gruppierung Faktoren namens "Fac_0" und "Fac_1." Darüber hinaus wird die Identität der einzelnen Messungen werden als bezeichnet "Ich" Faktor.</li>
		<li>Alternativ halten Sie die Probe Trennzeichen leer und geben Sie 0 in die exportierte Elemente , wenn die Vollbild-Titel beibehalten werden kann.</li>
		<li>Überprüfen Sie auf dem Windows-Betriebssystem, ob der Pfad zu den R-Software korrekt erkannt im Feld Pfad zum R.exewerden. Andernfalls geben Sie den vollständigen Pfad zu der Datei R.exe in das System (z.B."C:\Program Files\R\bin\R.exe").</li>
		<li>Klicken Sie auf "OK". Überprüfen Sie den Titel im nächsten Dialogfenster analysieren und klicken Sie auf "OK" oder wieder zurücksetzen. Hinweis: Alle Bilder werden automatisch geglättet und schließlich neu kalibriert werden. Eine Liste der alle exportierten Gruppierung Faktoren wird im Ergebnisfenster angezeigt.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine lineare Auswahl über die Plasmamembran-Region in die bearbeiteten Bilder und Messen Sie die Fluoreszenz-Profile zu.<ol>
<li>Wählen Sie das Fidschi-Werkzeug gerade Linie von der Fidschi-Symbolleiste. Klicken Sie auf das Bild und ziehen Sie eine Linie in der Plasmamembran-Region. Die Zeile sollte muss in den Extrazellulärraum beginnen und senkrecht auf der Plasmamembran. Wählen Sie Regionen mit einer dickeren und homogenere Schicht der kortikalen Zytoplasma. Die optimale Länge der linearen Auswahl ist 5-10 μm.</li>
		<li>Laufen Sie die Profil-Makro zu nehmen , indem analoge Methode wie im Schritt 4.2 (Kürzel "X") oder in der Fidschi-Symbolleiste auf Profil Tool nehmen . Die automatische Messung der Fluoreszenz-Profile in beiden Kanälen erfolgt und die Daten werden im Ergebnisfenster angezeigt.</li>
		<li>Wenn mit der Taste "X" benutzerunfreundlich gilt, die Makro-Quelldatei Peripheral_.ijm im Text-Editor zu öffnen, ersetzen Sie das "X"-Symbol in der Zeile "Makro"Take Profil [X]"{" mit einem günstigeren Symbol (, wird nicht verwendet, in der Umgebung der Fidschi-Inseln als eine aktive Tastatur-Abkürzung) und speichern Sie die Datei. Installieren Sie das Makro (Schritt 3.1.4) und starten Sie die Analyse aus dem Bildimport.</li>
		<li>Nehmen Sie nach einzelsignal Variabilität repräsentative Zahlen der Profile für jede Zelle.</li>
		<li>Sichern Sie die Daten per Datei | Ziel speichern unter.... Verwenden Sie immer die Erweiterung "Csv"; Es ist notwendig für die richtige Datenformat.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Plot-Profil-Daten-Makro (Abkürzung F5) für die grafische Visualisierung der gemessenen Profile. Legen Sie den Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro.<ol>
<li>Halten Sie das Kontrollkästchen Gebrauch Filtern nach Eingabedaten? abgewählt.</li>
		<li>Geben Sie an, ob die Handlung von aktuellen Daten im Ergebnisfenster, aus einem einzigen CSV-Datei oder aus CSV-Dateien in einem angegebenen Verzeichnis durch Klicken auf das entsprechende Optionsfeld erstellt werden soll. Hinweis: Wenn der Plot aus den jüngsten Ergebnissen erstellt, Daten werden zuerst gespeichert werden (Dialogfeld "Speichern unter... " wird automatisch aktiviert).</li>
		<li>Geben Sie an welche Gruppierung Faktoren für das Plotten durch Aktivieren der entsprechenden Kontrollkästchen verwendet werden. Wählen Sie den Faktor "i.", wenn alle Profile in einzigartige Grundstücke angezeigt werden soll. Halten Sie die Kontrollkästchen nicht ausgewählt ist, sollten alle Daten von auf einem einzigen Grundstück dargestellt. Achtung: Auswählen eines Faktors Gruppierung, die nicht in den verarbeiteten Ergebnisse Ursachen Fehler während der Ploterstellung vorhanden ist.</li>
		<li>Geben Sie den Dateinamen beim Speichern von einem Grundstück im Feld Output-Datei-Präfix und definieren Sie die Handlung Bildabmessungen in Grundstück hohe und Breite Plot-Dateien. Hinweis: Die daraus resultierende Handlung wird in einem Quell-Daten-Verzeichnis als eine PNG-Datei gespeichert werden.</li>
		<li>Wählen Sie die PDF-Ausgabe? Kontrollkästchen, wenn eine zusätzliche PDF-Ausgabe kann produziert werden.</li>
		<li>Klicken Sie auf "OK". Geben Sie den Pfad zum Speichern der Ergebnisse oder schließlich für Daten importieren Sie im nächsten Dialogfenster. Analyse zu bestätigen, indem Sie auf "OK" in den Dialogfenstern zeigen die durchgeführten R-Code. Hinweis: Die Handlung wird in einem neuen Bildfenster geöffnet werden und die R Analyseausgabe werden in Text-Fenster aufgelistet.</li>
	</ol></li>
	<li>Laufen Sie die Profil Filterung Setup Makro (Abkürzung F2) haben einige gezeichneten profile übermäßige Signale im extrazellulären Raum (für das tagged Protein) oder in den intrazellulären Raum (für das FM 4-64-Signal). Folgen Sie durch die Einstellung der Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro. Hinweis: Filter ermöglicht die Entfernung von schlechten Profile nach der maximal zulässigen Intensität Schwelle an angegebenen X-Koordinaten.<ol>
<li>Für jeden Kanal inmitten der entsprechenden Intensität Schwellenwerts die Datei Messungen mit einem übermäßigen extrazelluläre (intrazellulären) Signal zu entfernen. Geben Sie der Region, wo die Intensität Schwelle angewendet wird, in das Feld an X-Koordinaten zu senken (größer).</li>
		<li>Führen Sie die Plot-Makro der Profil-Daten (Schritt 4.4) erneut mit dem Kontrollkästchen Gebrauch Filtern nach Eingabedaten? ausgewählt; sicherstellen Sie, dass alle aberranten Profile erfolgreich entfernt wurden. Ansonsten, verbessern Sie die Filterparameter (Schritt 4.5.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie das Makro erstellen Modell (Abkürzung F3) erstellen ein Modell der Plasmamembran und die Zytoplasma-Fluoreszenz-Verteilung anhand der Kalibrierdaten. Folgen Sie durch die Einstellung der Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro.<ol>
<li>Angeben, wenn die Eingabedaten gefilterten (Schritt 4.5) durch die Wahl sein sollte die Nutzung Filtern nach Eingabedaten? Kontrollkästchen.</li>
		<li>Geben Sie die Quelldaten analogisch wie in Schritt 4.4.2.</li>
		<li>Geben Sie ein Intervall an dem das Modell wird vorhergesagt werden, per Definition von "Start", "beenden" und "Schritt" Werte in μm. Hinweis: Alle Profilmessungen sollte länger als das angegebene Intervall.</li>
		<li>Geben Sie die Wellenlängen der Fluoreszenz Anregung und Emission Maxima von der Chromophore in die entsprechenden Felder verwendet. Stellen Sie den Standardeinstellungen für GLP und FM 4-64-Kombination. Hinweis: "GLP" kennzeichnet den Chromophor verwendet für das Protein tagging (GFP, GFP, YFP, etc.) und "FM4" der Chromophor für eine Plasmamembran Färbung (in der Regel FM 4-64) verwendet.</li>
		<li>Geben Sie die Ausgabe-Datei-Präfix -Feld. Das Präfix wird für eine resultierende Modell wie die RData Datei ein Quellverzeichnis Daten speichern verwendet werden.</li>
		<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Grundstück Modell? Wenn die grafische Ausgabe erforderlich ist. Die Handlung wird gespeichert als die PNG-Datei sowie die PDF-Datei Wenn der PDF-Ausgabe? Kontrollkästchen aktiviert ist.</li>
		<li>Klicken Sie auf "OK". Geben Sie den Eingang oder Ausgang Wege im nächsten Dialogfenster und die Analyse zu bestätigen, indem Sie auf "OK" im Dialogfenster zeigt die durchgeführten R-Code. Hinweis: Die Handlung von der modellierten zytoplasmatischen und Membran Verbindung der peripher-assoziierten Protein Fluoreszenz werden in das neue Bildfenster angezeigt, und die R Analyseausgabe werden im Text-Fenster aufgelistet.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Bilder der Zellen mit dem Ausdruck des Proteins des Interesses zu verarbeiten.<ol>
<li>Importieren Sie die Bilder analog wie in Schritt 4.1.</li>
		<li>Richten Sie die Analyse analog wie in Schritt 4.2. Die Glättung und Linie Breite sollten identisch sein.</li>
		<li>Messen Sie die Profile analog wie in Schritt 4.3.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Richtigkeit der Profile durch Plotten (Schritt 4.4) und legen Sie die Filterung (Schritt 4.5) auf Wunsch.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie das berechnen Verteilung Makro (Abkürzung F4) für die Berechnung der ein Protein Partitionierung zwischen der Plasmamembran und im Zytoplasma. Folgen Sie der Parametereinstellung im Dialogfenster aufgerufene Makro.<ol>
<li>Analogisch mit dem vorherigen Schritt (Schritt 4.4), angeben der Datenquelle Filterung und Dateinamen Präfix.</li>
		<li>Geben Sie an, ob das Modell für Protein-Verteilung-Berechnung aus den letzten Modell-Berechnung in der letzten Instanz des "Peripheren" Makros auf Fidschi (select-Kontrollkästchen Aktuelle Ergebnisse) oder die RData (geladen wird Kontrollkästchen Sie aktivieren Sie das- "aus Datei").</li>
		<li>Halten Sie das Kontrollkästchen Ergebnisse mit größer als passives Variabilität entfernen aktiviert, wenn ein Ergebnis-Filterung gewünscht wird. Geben Sie den Schwellenwert der maximale zulässige residual Variabilität, die durch das Signal Zersetzung der einzelnen Profilmessung unerklärliche werden kann. Zum Beispiel: 0.200 der Wert gibt an, dass alle Messungen mit unerklärlichen Variabilität höher als 20 % der Gesamtvariabilität der Fluoreszenzintensität im Profil werden verworfen.</li>
		<li>Wählen Sie Probe Gruppierung Faktoren, die für Box-Plot erstellen (Schritt 4.4) verwendet werden dürfen.</li>
		<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen PDF-Ausgabe? für das Boxplot als PDF-Datei speichern.</li>
		<li>Klicken Sie auf "OK", geben Sie den Eingang oder Ausgang Wege und die Analyse zu bestätigen, indem Sie auf "OK" im Dialogfenster zeigt die durchgeführten R-Code. Hinweis: Boxplot der peripher-assoziierten Protein Aufteilung zwischen der Plasmamembran und Zytoplasma wird in einem neuen Bildfenster angezeigt werden, und die R Analyseausgabe werden in Text-Fenster aufgelistet.</li>
		<li>Für Fremdbearbeitung, speichern Sie die Ergebnisse im Fenster Ergebnisse über Datei angezeigt | Ziel speichern unter... in das Menü "Fenster".</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+a+polybasic+motif+determine+D6+PROTEIN+KINASE+polar+association+with+the+plasma+membrane+and+tropic+responses.">Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses.</a> Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).</li><li>Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-binding+protein+PCaP2+located+on+the+plasma+membrane+is+involved+in+root+hair+development+as+a+possible+signal+transducer.">The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer.</a> Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).</li><li>Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , (2013).</li><li>Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+plasma+membrane+expression+of+a+fusion+protein+of+Na/H+exchanger+NHE3+and+green+fluorescence+protein+(GFP)+in+living+PS120+fibroblasts.">Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts.</a> J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).</li><li>Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+acylated+peptides+and+fatty+acids+to+phospholipid+vesicles:+pertinence+to+myristoylated+proteins.">Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins.</a> Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).</li><li>Vosolsob&#283;, S., Petr&#225;&#353;ek, J., Schwarzerov&#225;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plasticity+of+plasma+membrane+interaction+in+DREPP+family+proteins.">Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins.</a> Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).</li><li>Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM-dyes+as+experimental+probes+for+dissecting+vesicle+trafficking+in+living+plant+cells.">FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells.</a> J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+plasma+membrane+polypeptides+differentially+regulated+during+plant+development.">A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development.</a> Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).</li><li>Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+a+novel,+hydrophilic+cation-binding+protein+associated+with+the+plasma+membrane.">Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane.</a> J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).</li><li>Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane-associated+protein+of+Arabidopsis+thaliana+AtPCaP1+binds+copper+ions+and+changes+its+higher+order+structure.">A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure.</a> J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDP25,+A+Novel+Calcium+Regulatory+Protein,+Mediates+Hypocotyl+Cell+Elongation+by+Destabilizing+Cortical+Microtubules+in+Arabidopsis.">MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).</li><li>Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+microtubule-destabilizing+protein+25+functions+in+pollen+tube+growth+by+severing+actin+filaments.">Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments.</a> Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).</li><li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+BY-2+Cell+Line+as+the+&amp;#34;HeLa&amp;#34;+Cell+in+the+Cell+Biology+of+Higher+Plants.">Tobacco BY-2 Cell Line as the &amp;#34;HeLa&amp;#34; Cell in the Cell Biology of Higher Plants.</a> Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).</li><li>Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+A+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+phosphatidylinositol+4-phosphate+dynamics+in+living+plant+cells.">Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells.</a> Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).</li><li>La&#328;kov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Dynamics+of+Plant+Plasma+Membrane+Proteins+with+Fluorescence+Recovery+and+Raster+Image+Correlation+Spectroscopy.">Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier beschriebene Methode erzeugt eine genauere Schätzung der Plasmamembran Partitionierung für peripher verbunden Proteine, die im Vergleich zu anderen Ansätzen basiert auf der Messung der Fluoreszenz-Intensität-5. Die wesentliche Verbesserung dieser Methode ist, dass die Lichtbeugung und Überlagerung von der Plasmamembran und zytoplasmatischen Signale berücksichtigt. Obwohl diese Methodenergebnisse im Zusammenhang mit Ergebnissen einer einfachen Methode, basierend auf dem Vergleich der...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.

Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Peripher-assoziierten Plasmamembran Proteine sind die wichtigsten Komponenten der Zelle Signalwege. Eines ihrer grundlegenden Aufgaben ist ihre transiente Plasmamembran Assoziation und Dissoziation, die wichtig für die Signalübertragung zwischen Plasmamembran und Zytoplasma ist. Plasmamembran peripher-assoziierte Proteine auf Plasmamembran durch Lipid-Anker (N-myristylierung, S-Acylation oder Prenylation) oder durch Lipid-Bindung-Domänen (Interaktion mit Phosphatidylinositol Phosphate, phosphatidic Säure, anbaubar usw.).
Plasmamembran bindenden Eigenschaften dieser Proteine können sein untersucht in Vivo, z. B.wenn ein eindringmittel getaggt Protein durch eine Site-verwiesene Mutagenese der wichtigen Aminosäuren geändert wird, oder wenn es mit verschiedenen Inhibitoren beeinflussen behandelt wird Lipid signaling. Die Verteilungen der peripheren Membranproteine, Plasma werden meist qualitativ, besonders in Fällen geprüft wenn re PROTEINVERTEILUNG offensichtlich ist. Die vorgestellte Methode ist optimal für Situationen, wenn Protein Umverteilung nur teilweise ist und quantitative Bewertung notwendig ist. Ein häufig verwendeter Ansatz Wenn Plasmamembran Vereinigung von konfokalen geschätzt wird laser scanning Mikroskopie-Bildern, wie ein Verhältnis von Fluoreszenz-Intensität an der Plasmamembran und in das Zytoplasma1,2, ist aber nicht einfach, präzise. Fluoreszenz-Intensität in der Plasmamembran reflektieren eine Überlagerung der Plasmamembran und Zytoplasma Signal aufgrund der Lichtbeugung Merkmal für die besondere Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik und optischen Elementen verwendet3. Infolgedessen ist der zytoplasmatischen Signal auch in der Membran-Region enthalten. Aus diesem Grund kann nicht FM 4-64 Färbung Muster für eine Membran Signal Auswahl4als Maske verwendet werden. Darüber hinaus einfache Messungen von Membran-Signal an der Position von FM 4-64 Färbung immer systematisch maximale definiert das echte Plasmamembran Signal des peripher-assoziierten Plasmamembran Protein durch die Überlagerung der überschätzen die Membran und zytoplasmatischen Compound. Das Maximum der beobachteten Signale für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierte Proteine auch nicht zusammen mit dem Maximum der Plasmamembran Marker (d.h. FM 4-64 Styryl Farbstoff) lokalisiert, aber ist das Zytoplasma verlagert. Eine weitere Einschränkung ist, dass der FM 4-64 Emission Höhepunkt im Vergleich zu den Emission Gipfeln für grüne fluoreszierende Proteine wie GFP aufgrund der Wellenlänge-Abhängigkeit von Lichtbeugung3breiter ist.
In die hier beschriebene Methode ist das tagged Protein-Signal durch zwei empirische Funktionen beschreiben einer hypothetischen Verteilung der Plasmamembran und Zytoplasma Signal bzw. ausgestattet. Dieses Signal Zersetzung ist auf lineare Fluoreszenz Profile angewendet, die an der Zelloberfläche senkrecht zur Plasmamembran in Quellbilder, gelten die regulären, Zweikanal-konfokale Abschnitte fluoreszent-markierte Protein zum Ausdruck zu bringen sind Zellen mit FM 4-64 Farbstoff gekennzeichnet.
Die erste Funktion, die für die Montage verwendet beschreibt eine Beugung eines Zytoplasma-Signals auf dem Zellenrand. Es wird von zuvor erworbenen Fluoreszenz Profile erhalten, die in den Zellen, die mit dem Ausdruck eines Zytoplasma Protein Markers markiert durch die gleichen Chromophor als Plasmamembran peripher-assoziierten Protein des Interesses gemessen wurden. Die zweite Funktion beschreibt eine Beugung der Plasmamembran Signal ist die Fluoreszenz von FM 4-64 abgeleitet. Dieses Signal wird zunächst von einer Gaußschen Funktion angenähert, der für eine ungefähre Modellierung von Lichtbeugung eine Punktquelle verwendet wird. Zweitens ist dieses Modell, gültig für rote FM 4-64 Emission mathematisch in der Form umgewandelt, die relevant für einer Emissionswellenlänge von den Chromophor verwendet für die Kennzeichnung von peripher-assoziierte Proteine auf der Plasmamembran von Interesse sind. Beide Funktionen werden durch die maximale Intensität und der Mittelwert von 10 % der höchsten Werte für FM 4-64 und zytoplasmatischen Proteinen Signal bzw. normalisiert. Durch dieses Signal Zersetzung (nicht-lineare mindestens quadratisch Anpassungsmethode) können das Verhältnis der Plasmamembran und Zytoplasma Bruchteil des untersuchten Proteins leicht und genau geschätzt werden. Die realen physische Dimension des berechneten Partitionierungs-Koeffizienten ist im Bereich von Mikrometer, weil zytoplasmatischen Volumenkonzentration mit oberflächenkonzentration auf der Plasmamembran verglichen wird. Es definiert den Abstand zwischen der Plasmamembran Cytoplasma, innerhalb derer die gleiche Menge an Proteinen im angrenzenden Bereich der Plasmamembran lokalisiert ist. Dieser Wert entspricht der Partitionierung Koeffizient K2 eingeführt, zuvor5. Die Methode ist sehr schnell, erfordert nur einzelne konfokale Abschnitte aufgenommen mit Routine konfokale Laser-scanning-Mikroskop, und es ist rechnerisch nicht anspruchsvoll. Der Kern der Analyse in einen tragbaren R-Paket implementiert wurde und eine zusätzliche ImageJ-Makro wurde geschrieben, um grafische Benutzeroberfläche zum Starten der Analysis über die intuitive Dialoge. Software und ausführliche Beschreibung der Methode (früher veröffentlichten6) finden Sie unter http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
Die Methode eignet sich für isolierte Zellen, Protoplasten und Geweben, wo die Plasmamembran der einzelnen Zellen deutlich unterscheidbar ist, mit dem Ausdruck ein eindringmittel getaggt Konstrukt der peripher-assoziierten Protein untersucht. Ein Chromophor kompatibel mit FM 4-64 Färbung verwendet werden muss. FM 4-64 gibt rote Fluoreszenz; Daher kann untersuchten Proteins durch ein Fluoreszenz-Protein mit blauen, grünen oder gelben Emission (z. B.GFP, GFP, YFP) markiert werden. Stabile Transformation von biologischem Material wird empfohlen, weil dadurch weniger künstliche und mehr reproduzierbare Beobachtungen der PROTEINVERTEILUNG. Es ist notwendig, dass die untersuchten Proteine eine relativ homogene zytoplasmatischen Verteilung hat. Die Lokalisation eines Proteins in das endoplasmatische Retikulum oder ein weiteres Fach der intrazellulären Membran kann künstliche Ergebnissen führen.
Darüber hinaus muss das gleiche biologische Material mit dem Ausdruck eines zytoplasmatischen Markers für den Vergleich verwendet werden. Zellen können durch eine kostenlose Chomophore (das gleiche wie für periphere Protein tagging, z. B.kostenlose GLP) oder tagged Proteins des Interesses mit abgeschafft Membran-Bindungskapazität umgewandelt werden. Membran-Bindungskapazität kann, z. B. durch Trimmen der Membran-bindende Domäne oder Site-verwiesene Mutagenese der wichtigen Aminosäure Essigreiniger (z.B. Websites für N-myristylierung, S-Acylation, oder Prenylation, etc.) abgeschafft werden.
Für die konfokale scanning-Mikroskopie müssen Zellen durch eine Membran-Marker wie FM 4-64 Farbstoff gekennzeichnet sein. Wenn FM 4-64 Färbung nicht für das untersuchte Material (wegen störenden Autofluoreszenz, schlechte Farbstoff eindringen, etc.) geeignet ist, können die Plasmamembran, z. B. durch integrale Plasmamembran Protein markiert, eine entsprechende Chomophore (beschriftet werden mCherry, RFP, etc.). Es ist wichtig, dass die Markierung vernachlässigbar Lokalisierung in die intrazellulären Membran Fächer (Endomembranes) hat.
Arbeiten mit festen Proben und Antikörper kann fixierbar analogen FM 4-64FX oder Plasmamembran Kennzeichnung durch Antikörper gegen ein geeignetes Ziel verwendet werden. In diesem Fall ist es wichtig, die Ergebnisse sehr sorgfältig ausgewertet werden, da Fixierung Verfahren zum selektiven Verlust von Proteinen aus dem Zytoplasma und der Plasmamembran führen können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:944px;" width="944">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">FM 4-64</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:384px;">T13320</td>
			<td style="width:184px;">Plasma membrane dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:384px;">D4540 Sigma</td>
			<td style="width:184px;">Dye solvent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:184px;">Equipment for cell labelling and microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:384px;"></td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Ordinary computer</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:384px;"></td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of plasma membrane partitioning for peripherally-associated proteins

Diese Methode bietet einen schnellen Ansatz für die Ermittlung der Plasmamembran Partitionierung von jedem eindringmittel getaggt peripher-assoziierten Protein mit den Profilen der Fluoreszenzintensität über die Plasmamembran. Gemessenen Fluoreszenz Profile sind durch ein Modell für die Membran und Zytoplasma Fluoreszenz Verteilung entlang einer Linie, die senkrecht auf der Peripherie der Zelle angewendet ausgestattet. Dieses Modell ist aus der Fluoreszenz Intensitätswerte in Referenzzellen auszudrücken eindringmittel getaggt Marker für Zytoplasma und mit FM 4-64-mit der Bezeichnung Plasmamembran gebaut. Die Methode kann auf verschiedene Arten von Zellen und Organismen angewendet werden; Allerdings können nur die Plasmamembranen von nicht benachbarten Zellen ausgewertet werden. Diese schnelle Mikroskopie-basierte Methode eignet sich für Experimente, wo dynamische Veränderungen der Plasmamembran-assoziierten Marker erwartet werden und müssen quantifiziert werden, z.B.bei der Analyse der mutierten Versionen von Proteinen, Inhibitor Behandlungen, und signal-Transduktion Beobachtungen. Die Methode ist eine Multi-Plattform-R-Paket implementiert, die mit einem Makro ImageJ gekoppelt ist, die als eine benutzerfreundliche Oberfläche dient.

DREPP10 ist ein anlagenspezifischen peripher-assoziierten Plasmamembran-Protein, das einhergeht mit der Plasmamembran über eine N-myristylierung und eine elektrostatische Wechselwirkung mit Phosphatidylinositol Phosphate11, 12. DREPP wurde als Bestandteil des Kalzium-Signalisierung Maschinen in der Pflanzenzelle beschrieben und auch interagiert mit dem Zytoskelett13,<sup...

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Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Quantitative Analyse des Niveaus der Plasmamembran Verein für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierten Protein durchführen. Die Methode basiert auf die rechnerische Zersetzung der Membran und zytoplasmatischen Komponente des Signals beobachtet in Zellen mit Plasmamembran fluoreszierenden Marker gekennzeichnet.

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Aufrufe.  Faculty of Science, Charles University. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Quantitative Analyse des Niveaus der Plasmamembran Verein für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierten Protein durchführen. Die Methode basiert auf die rechnerische Zersetzung der Membran und zytoplasmatischen Komponente des Signals beobachtet in Zellen mit Plasmamembran fluoreszierenden Marker gekennzeichnet.

Serie: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Forschung

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Die Cell-basierten L-Glutathion Schutz Assays zur Endozytose und Recycling von Plasmamembranproteinen Studieren

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...