이 프로젝트는 NPU에 의해 지원 되었다 I, LO1417 (교육, 청소년 및 스포츠의 체코 공화국).

1입니다. 생물 자료의 준비
<ol><li>붙일 태그가 단백질 세포질 마커 뿐 아니라 관심의 표현 하는 생물 학적 자료를 준비 합니다. 소개에서 언급 하는 절차를 따릅니다.</li>
</ol>2. confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법
<ol><li>4-64 염료7제 1 fm 준비 자료를 얼룩.<ol>
<li>공부 자료에 대 한 적합 한 얼룩 프로토콜을 적용 합니다. 담배 BY-2 셀, 10mm FM의 0.2 μ와 200 μ 셀 서 스 펜 션의 dimethylsulfoxide에서 4-64 솔루션 얼룩. 참고: FM의 전형적인 착 색 농도 4-64 염료는 10 m m 재고 솔루션을 사용 하 여 dimethylsulfoxide에서 10 μ M에 대 한. 적절 한 얼룩에 대 한 FM 4-64의 가능한 가장 낮은 농도 사용 하 고 셀 얼음 (FM 4-64와 저온 수 플라즈마 멤브레인 속성에 영향을 미칠)에 품 어 하지 마십시오. 관찰 즉시 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 계속 합니다. 얼룩 및 이미지 수집 간격; 10 분 이상 하지 않아야 그렇지 않으면, 염료의 endocytosis 4-64 얼룩 FM 적용 됩니다.</li>
		<li>연속적으로, 여러 개의 샘플을 처리 하 고 실험의 시작 부분에 모든 샘플 얼룩이 되지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>한 셀 당 한 적도 confocal 섹션을 캡처하십시오.<ol>
<li>(첫 번째 채널에 있어야) 단백질 태그와 FM 4-64 (두 번째 채널에 있어야)로 사용 하는 발 색 단에 대 한 순차적 2 채널 스캔 설정 합니다. (10-20 픽셀/μ m) 높은 광학 해상도 설정 합니다. 예를 들어 설정: 63 X 기름 침수 목표, NA 1.3, 이미지 크기 1024 x 1024 픽셀. 원형질 막 비행기 획득된 이미지에 confocal 섹션 평면에 수직인 인지 확인 합니다.</li>
		<li>캡처 통계 평가 대 한 충분 한 데이터를 견본 당 적어도 20 셀 (가공된 소재에서 신호 변화에 따라 달라 집니다).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 필요한 소프트웨어 설치
<ol><li>피지 ImageJ 배포8와 주변 필요한 매크로 설치 합니다.<ol>
<li>사이트 https://fiji.sc/#download에서 소프트웨어를 다운로드 하 고 그들을 풀고 여 설치.</li>
		<li>압축 푼된 "Fiji.app" 디렉터리에 "ImageJ(.exe)" 파일을 두 번 클릭 하 여 피지를 시작 합니다.</li>
		<li>"주변" 매크로 다음 사이트에서 다운로드: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.ijm입니다.</li>
		<li>피지에 플러그인을 선택 | 매크로 | 설치... 메인 메뉴에서 "Peripheral_.ijm" 다운로드 한 파일의 경로를 지정 하 고 참고: 설치 매크로 "주변 장치"의 두 가지 새로운 도구 피지 도구 모음에 표시 됩니다: "받아 프로필 도구"와 "주변 단백질 메뉴."</li>
	</ol>
</li>
	<li>R 프로젝트 소프트웨어9및 필요한 패키지를 설치 합니다.<ol>
<li>R 프로젝트 설치에 대 한 사이트 https://cloud.r-project.org/에 지시를 따릅니다. 참고: 전체 분석 피지에서 수행 됩니다. R 소프트웨어만 내부적으로 호출할 수 것입니다 피지 매크로 계산 "주변 장치"에 의해.</li>
		<li>R GUI를 실행, 패키지를 선택 | 설치 패키지를... 메인 메뉴에서 가장 가까운 저장소 및 설치 패키지 "ggplot2" 지정. 참고: 또는, r 명령줄 입력: install.packages("ggplot2").</li>
		<li>대상에서 주변 R 패키지를 다운로드: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. 패키지를 선택 하 여 설치 | 로컬 파일에서 패키지를 설치. 참고: 또는 R 명령줄에이 명령을 입력: install.packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo NULL 입력 = = "소스").</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 피지 이미지 분석
<ol><li>세포질 마커의 confocal 이미지를 처리 합니다.<ol>
<li>플러그인을 사용 하 여 피지를 가져오기는 이미지 | 바이오-형식 | 바이오-형식 가져오기 기본 설정으로 피지 메뉴에서.</li>
		<li>바이오-형식 가져오기 이미지 보정을 제대로 인식 경우 확인 하십시오. 상단 왼쪽된 정보 필드 이미지 창에 표시 된 그림 차원 원래 그림 크기를 같아야 합니다.</li>
		<li>치료는 잘못에서 잘못 된 이미지 보정 대화 창 분석에에서 올바른 매개 변수를 설정 하 여 개별적으로, 예를 들어, 크기 | 설정 규모... 피지 메뉴에서: 까지의 거리를 픽셀 단위로 필드와 거리 알려진 필드에 적절 한 길이 단위로 실제 너비에 이미지 너비 (픽셀) 입력). 참고: Leica LCS LEI 파일 잘못 교정 단계 4.2.1를 따라 라.</li>
	</ol></li>
	<li>분석 설정에 대 한 가져오기 옵션 매크로 실행 합니다. 세 가지 방법 중 하나에 의해 매크로 활성화: 플러그인을 선택 | 매크로 | 가져오기 옵션 [f1] 주 피지 메뉴에서 선택 같은 메뉴 도구 주변 단백질 메뉴, 클릭 한 후 항목을 누르거나 키보드 지름길 F1. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>Leica LCS LEI 형식 경우 Leica.lei 이미지 확인란을 활성화 하 여 부적 절 한 보정 해결. 이 옵션은 제대로 "lei" 확장자를 가진 파일에서 이미지 크기를 가져옵니다.</li>
		<li>가우스 블러 반경 (픽셀)필드에 적절 한 값을 정의 합니다. 이 그림 스무 딩 및 소음 감소 영향. 낮은 값 (1 픽셀) 충분 하 고 모든 이미지 정보 손실이 발생 하지 않습니다.</li>
		<li>프로 파일 선 두께 (픽셀)필드에 값을 설정 합니다. 두꺼운 라인 프로 파일 곡선의 높은 다듬기 발생 합니다. 기본값 10 픽셀 것이 좋습니다.</li>
		<li>"샘플 구분 기호" 와 "수출 항목." 의 정의 의해 구문 분석 이미지 제목 설정 참고: 이미지 제목 ( 예:확장명 없이 파일 이름: "실험-1_line-02_cell-11") "샘플 구분 기호" 필드에 나열 된 모든 문자가 주위 분할 됩니다 (예: "-_") 항목의 집합으로 ("실험", "1"," 라인","02","셀", 및"11") 요소를 그룹화 (샘플, 셀, 행, 또는 치료 정체성)에 다음과 같은 분석으로 사용할 수 있습니다. 항목을 "내보낸 항목." 출원으로 그들의 시퀀스 번호 ("0"의 첫 번째 항목에 대 한)를 입력 하 여 사용 됩니다 정의 공백으로 형식, 예를 들어, "3 5."을 사용 하 여 이 예제에서 항목 "02", "11" 참조 됩니다 "Fac_0" 및 "Fac_1" 라는 요소를 그룹화 하는 것으로 서 또한, 각 측정의 id로 "나" 요소를 메시지를 지칭 합니다.</li>
		<li>또는 빈 샘플 구분 기호 를 유지 하 고 전체 이미지 제목 유지 될 수 있습니다 경우 수출 항목 에 0을 입력.</li>
		<li>Windows 운영 체제에서 R 소프트웨어를 경로에 있을 것입니다 잘못 자동 검색 필드 R.exe 경로확인 합니다. 그렇지 않으면, 시스템 (예:"C:\Program Files\R\bin\R.exe")에서 R.exe 파일에 전체 경로 지정 합니다.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다. 다음 대화 창에서 구문 분석 하는 제목을 확인 하 고 확인 또는 다시 재설정을 클릭 합니다. 참고: 모든 사진은 자동으로 부드럽게 그리고 결국 recalibrated 될 것입니다. 모든 내보낸된 그룹화 요인의 목록이 결과 창에 표시 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>처리 된 이미지의 원형질 막 지역에 걸쳐 선형 선택 수행 하 고 형광 프로 파일을 측정.<ol>
<li>피지 도구 모음에서 직선 피지 도구를 선택 합니다. 이미지를 클릭 하 고 원형질 막 지역 선 끌어. 선 세포 외 공간에서 시작 해야 하며 플라즈마 멤브레인에 수직 이어야 한다. 대뇌 피 질의 세포질의 두꺼운 및 더 균질 층으로 영역을 선택 합니다. 선형 선택의 최적의 길이 5-10 μ m입니다.</li>
		<li>4.2 (단축키 "x") 단계에서 비슷한 방법으로 또는 프로필 도구 걸릴 피지 도구 모음에서 클릭 하 여 프로 파일 매크로 받아 실행 합니다. 두 채널에 형광 프로필의 자동 측정 수행 됩니다 하 고 데이터는 결과 창에 표시 됩니다.</li>
		<li>"X" 키를 사용 하 여 생소 간주 됩니다, 경우 텍스트 편집기에서 매크로 소스 파일 Peripheral_.ijm 를 열고, 줄에 "x" 기호 대체 ' 매크로 "걸릴 프로필 [x]" {' 더 유리한 기호 (하지로 피지 환경에서 사용 되는 활성 키보드 지름길) 저장 합니다. 매크로 (3.1.4 단계)를 재설치 하 고 이미지 가져오기에서 분석을 시작.</li>
		<li>개별 신호 변화에 따라 각 셀에 대 한 프로필의 대표 번호를 가져가 라.</li>
		<li>파일을 통해 데이터 저장 | 저장 다른 이름으로. 항상 사용 "csv" 확장; 그것은 적절 한 데이터 형식이 필요 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프로필 데이터 매크로 플롯 (지름길 F5) 측정 된 프로필의 그래픽 시각화에 대 한 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>체크 상자 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 선택 되지 않은.</li>
		<li>줄거리는 단일 CSV 파일 또는 모든 CSV 파일에서 적절 한 라디오 단추를 클릭 하 여 지정된 된 디렉터리에 있는 결과 창에서 최근 데이터 에서 만들 수 경우 지정 합니다. 참고: 최근 결과에서 줄거리를 만드는 경우 데이터 저장 됩니다 먼저 (다른 이름으로 저장 대화 상자는 자동으로 활성화).</li>
		<li>그룹화 요소 는 적절 한 체크 박스를 선택 하 여 그래프에 사용 됩니다 지정 합니다. 모든 프로 독특한 플롯에 표시 해야 하는 경우 "i." 요소를 선택 합니다. 하나의 플롯에서 플롯 모든 데이터에 의해 해야 하는 경우 선택 하지 않은, 체크 박스를 유지. 주의: 플롯 작성 중 처리 결과 원인 오류에 존재 하지 않는 그룹화 요소의 선택 합니다.</li>
		<li>출력 파일 접두사 필드에서 음모를 저장할 때 파일 이름 지정 하 고 파일 높은 줄거리 와 플롯 폭에 그림 이미지 치수 를 정의 합니다. 참고: 결과 플롯 저장 됩니다 소스 데이터 디렉토리에 PNG 파일로.</li>
		<li>선택은 Pdf 출력? 확인란 추가 PDF 출력 생성 될 수 있습니다.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다. 결과 대 한 경로 지정 가져오거나 결국 데이터에 대 한 다음 대화 창에서. 분석 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 확인 합니다. 참고: 새 이미지 창에서 열 것 이다 음모 그리고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>만약 일부 플롯된 프로필 과도 한 신호 (태그 단백질)에 대 한 세포 외 공간에 나 (4-64의 FM 신호)에 대 한 세포내 공간에서 프로 파일 필터링 설정 매크로 (지름길 F2) 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 하 여 따르십시오. 참고: 필터링 지정 된 x 좌표에서 최대 허용된 강도 임계값에 따라 가난한 프로 파일의 제거를 수 있습니다.<ol>
<li>각 채널에 대 한 과도 한 세포 외 (세포내) 신호 측정을 제거하는 파일에 적절 한 강도 임계값을 설정 합니다. X 좌표에서 (보다) 낮은필드에서 강도 임계값 적용 될 영역을 지정 합니다.</li>
		<li>체크 상자는 프로필 데이터 매크로 플롯 (단계 4.4) 다시 실행 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 선택; 모든 탈 프로필 성공적으로 제거 되었습니다 확인 하십시오. 그렇지 않으면, 필터링 매개 변수 (4.5.1 단계) 개선.</li>
	</ol></li>
	<li>실행 만들기 모델 매크로 (지름길 f 3) 원형질 막 및 교정 데이터에 따라 세포질 형광 분포 모델을 만듭니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 하 여 따르십시오.<ol>
<li>지정 하는 경우 입력된 데이터를 선택 하 여 필터링된 (4.5 단계) 있어야는 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 체크 박스.</li>
		<li>4.4.2 단계 에서처럼 analogically 원본 데이터 를 지정 합니다.</li>
		<li>Μ m에서 간격 을 모델 "시작", "끝"의 정의 의해 예측 될 것 이다 하 고 "단계" 값을 지정 합니다. 참고: 모든 프로 파일 측정 지정 된 간격 보다 더 이상 이어야 한다.</li>
		<li>적절 한 분야에서 사용 chromophores의 형광의 파장 여기 및 방출 맥시 마를 지정 합니다. 4-64 조합 GFP와 FM에 대 한 기본값을 설정 합니다. 참고: "GFP" 단백질 (GFP, CFP, YFP, 등), 태그에 사용 되는 발 색 단을 나타내고 "FM4" 발 색 단 (일반적으로 4-64 FM) 얼룩 원형질 막에 대 한 사용을 나타냅니다.</li>
		<li>출력 파일 접두사 필드를 지정 합니다. 접두사 원본 데이터 디렉터리로 RData 파일 결과 모델 저장에 대 한 사용 됩니다.</li>
		<li>체크 박스를 선택 음모 모델? 그래픽 출력 필요한 경우. 경우와 또한 PDF 파일 PNG로 줄거리 저장 됩니다는 Pdf 출력? -확인란을 선택.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다. 입력을 지정 또는 다음 대화 창에서 경로 출력 하 고 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 분석을 확인 합니다. 참고: 줄거리는 모델의 세포질 및 주변 관련 단백질 형광의 막 화합물에에서 표시 됩니다 새 이미지 창 고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>관심사의 단백질을 표현 하는 셀의 이미지를 처리 합니다.<ol>
<li>4.1 단계 에서처럼 analogically 이미지를 가져옵니다.</li>
		<li>4.2 단계 에서처럼 analogically 분석을 설정 합니다. 부드럽게 하 고 선 폭 동일 해야 합니다.</li>
		<li>측정 단계 4.3 에서처럼 analogically 프로필.</li>
		<li>(단계 4.4)을 그려서 프로필의 정확성을 확인 하 고 (4.5 단계) 원하는 경우 필터링 설정.</li>
	</ol></li>
	<li>원형질 막 사이 및 세포질 단백질 분할의 계산에 대 한 계산 배포 매크로 (지름길 F4)를 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수 설정에 따라.<ol>
<li>Analogically 이전 단계 (단계 4.4), 데이터 원본, 필터링 및 파일 이름 접두사를 지정 합니다.</li>
		<li>피지 (선택 체크 박스 최근 결과)에 "주변" 매크로의 최근 인스턴스에서 마지막 모델 계산 또는 RData 파일 (단백질 분포 계산에 대 한 모델 로드 됩니다 지정 "파일"에서체크 박스 선택) 합니다.</li>
		<li>확인란 활성화 원하는 결과 필터링 하는 경우 잔여 가변성 보다 큰 결과 제거 하십시오. 최대 허용 잔류 프로 파일 측정의 신호 분해에 의해 설명할 수 없는 수 있는 임계값을 지정 합니다. 예: 0.200 나타냅니다 프로필에 형광 강도의 총 다양성의 설명할 수 없는 변화 20% 보다 높은 모든 측정 삭제 됩니다.</li>
		<li>샘플 그룹화 요소, 상자-플롯 만들기 (단계 4.4)에 사용할 수 있습니다를 선택 합니다.</li>
		<li>체크 박스를 활성화 Pdf 출력? PDF 파일로 상자 그림을 저장 하기 위한.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다, 그리고 지정 하는 입력 또는 출력 경로, 고 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 분석을 확인 합니다. 참고: 새 이미지 창에 표시 됩니다 주변 관련 단백질 플라즈마 막과 세포질 사이 분할의 상자 그림 그리고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.</li>
		<li>파일을 통해 결과 창에 표시 하는 결과 저장 하는 외부 처리에 대 한 | 저장 다른 이름으로... 창 메뉴.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+a+polybasic+motif+determine+D6+PROTEIN+KINASE+polar+association+with+the+plasma+membrane+and+tropic+responses.">Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses.</a> Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).</li><li>Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-binding+protein+PCaP2+located+on+the+plasma+membrane+is+involved+in+root+hair+development+as+a+possible+signal+transducer.">The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer.</a> Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).</li><li>Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , (2013).</li><li>Janecki, A. 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저자는 공개 없다.

여기 설명 하는 방법을 원형질 막 형광 강도5측정에 따라 다른 방법에 비해 주변 관련된 단백질에 대 한 분할의 더 정확한 견적을 생성 합니다. 이 방법의 주요 향상은 그것 계정에 빛의 회절 및 원형질 막의 세포질 신호 중첩입니다. 비록 이러한 메서드 결과 평균 세포질 막 위치에서 형광 강도의 비교에 기반 하는 간단한 방법의 결과와 상관 관계에는 신호 (같이 이전<sup class="xre...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.

Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

주변 관련 된 플라즈마 막 단백질은 세포 신호 통로의 주요 구성 요소. 그들의 과도 플라즈마 멤브레인 협회와 분리, 플라즈마 막과 세포질 사이 신호 변환에 대 한 중요 한 그들의 기본적인 역할 중 하나입니다. 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질 지질 앵커 (N-myristoylation, S-acylation, 또는 prenylation) 또는 지질 바인딩 도메인 (phosphatidylinositol 인산 염, phosphatidic 산, 와 상호 작용 하 여 원형질 막에 붙어 있을 수 있다 등).
이 단백질의 속성 수 플라즈마 멤브레인 바인딩 검사 vivo에서, 예를 들어, 붙일 태그가 단백질 핵심 아미노산의 사이트 감독 mutagenesis에 의해 수정 될 때 또는 때 그것에 영향을 미치는 다양 한 억제제 처리 됩니다. 지질 신호입니다. 주변 플라즈마 막 단백질의 분포는 주로 되 고 질적으로, 경우에 특히 때 평가 단백질 다시 메일은 분명 합니다. 제시 방법은 상황에 대 한 최적의 단백질 다시 배포만 부분 이며 양적 평가 필요한 때입니다. 플라즈마 멤브레인 협회 confocal에서 추정 되는 때 자주 사용된 접근 레이저 스캐닝 현미경 이미지의 원형질 막에 및 세포질1,2, 형광 강렬 비율 아니다 간단 하지만 정확한. 원형질 막에 형광 강렬 특정 형광 현미경 검사 법 기술과 사용 하는 광학 요소3에 대 한 빛의 회절 특성 때문 원형질 막 및 세포질 신호의 중첩을 반영합니다. 따라서, 세포질 신호 막 지역에도 포함 됩니다. 이러한 이유로, FM 4-64 얼룩 패턴 막 신호 선택4마스크로 사용할 수 없습니다. 또한, 막 신호 FM 4-64 항상 체계적으로 최대 얼룩에 의해 정의 된 위치에서의 간단한 측정 평가의 중첩으로 인해 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질의 진짜 플라즈마 막 신호는 막 그리고 세포질 화합물입니다. 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 관찰 된 신호의 최대 또한 공동 플라즈마 멤브레인 마커 (즉, FM 4-64 styryl 염료), 최대를 지역화 하지 않습니다 하지만 세포질 쪽으로 이동 된다. 또 다른 한계는 FM 4-64 방출 피크는 빛 회절3의 파장 의존성 때문 GFP 같은 녹색 형광 성 단백질을 위한 방출 봉우리에 비해 넓은 사실에 기반입니다.
여기에 설명 된 메서드에서 태그 단백질 신호 원형질 막 세포질 신호를 가상 배포를 설명 하는 것은 각각의 경험적 함수 두 개 장착 되어 있습니다. 이 신호 분해 수직 붙일 태그가 단백질 표현 confocal 섹션 일반, 2 채널 소스 이미지에서 원형질 막으로 세포 표면에 적용 되는 선형 형광 프로필에 적용 됩니다. 셀 FM 4-64 염료와 함께 표시입니다.
피팅을 사용 하는 첫 번째 함수는 셀 가장자리에 세포질 신호의 회절을 설명 합니다. 그것은 관심의 원형질 막 주변 관련 된 단백질으로 같은 발 색 단에 의해 표를 붙인 세포질 단백질 마커를 표현 하는 셀에 측정 되었다 이전 취득된 형광 프로필에서 얻은 것입니다. 원형질 막 신호의 회절을 설명 하는 두 번째 함수는 FM 4-64의 형광에서 파생 됩니다. 이 신호는 점 광원의 빛 회절의 대략적인 모델링에 사용 되는 가우스 함수에 의해 첫째로 직선 근사 줄. 둘째,이 모델, 빨간 FM 4-64 방출에 유효 수학적으로 원형질 막에 대 한 관심의 주변 관련 단백질의 태그에 사용 되는 발 색 단의 방출 파장에 대 한 관련 된 형식으로 변환 됩니다. 두 함수 모두 최대 강도 및 FM 4-64 신호 및 세포질 단백질 신호에 대 한 가장 높은 값의 10%에서 평균 각각 정규화 됩니다. 이 신호 분해 (비-선형 최소 평방 피팅 방법), 원형질 막의 비율과 시험된 단백질의 세포질 분수 수 수 추정 쉽고 정확 하 게. 분할 계수 계산된의 실제 물리적 차원은 세포질 볼륨 농도 표면 농도 플라즈마 멤브레인에 비해 마이크로미터의 범위입니다. 같은 양의 단백질은 원형질 막의 인접 한 지역에서 지역화 된 세포질에 플라즈마 막에서 거리를 정의 합니다. 이 값은 분할 계수 K2 도입 이전5. 방법은 매우 빠르고, 일상적인 confocal 레이저 스캐닝 현미경를 사용 하 여 인수만 단일 confocal 단면도 요구 하 고 그것은 계산 요구 하지. 분석 핵심 휴대용 R 패키지에 구현 된 고 추가 ImageJ 매크로에서 직관적인 대화 상자는 분석을 실행 하려면 그래픽 사용자 인터페이스를 제공 하기 위해 작성 되었습니다. 소프트웨어 및 방법의 자세한 설명 (이전 출판6) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/에서 찾을 수 있습니다.
방법은 절연된 셀, protoplasts, 및 조직에 대 한 적합 한 개별 세포의 원형질 막 명확 하 게 구별할 수 어디에, 주변에 관련 된 단백질 검사의 붙일 태그 구문 표현. 발 색 단 호환 FM 4-64 얼룩을 사용 해야 합니다. FM 4-64에서 빨간 형광; 따라서, 검사 단백질 파란색, 녹색, 또는 황색 방출 (예를 들어, GFP, CFP, YFP)와 형광 단백질에 의해 태그가 될 수 있습니다. 생물학 물자의 안정적인 변화 단백질 분포의 덜 인공 하 고 쉽게 재현 가능한 관측을 수 있기 때문에 것이 좋습니다. 그것은 시험된 단백질 상대적으로 균질 세포질 배포 필요입니다. 바인딩과 그물 또는 다른 세포내 막 구획에 있는 단백질의 지 방화는 인공 결과 생성할 수 있습니다.
또한, 동일한 생물학 물자 세포질 마커를 표현 비교에 사용 해야 합니다. 셀 폐지 막 바인딩 용량 무료 chomophore (같은 사용 되는 태그, 예를 들어, 무료 GFP 주변 단백질)에 의해 또는 관심사의 태그 단백질에 의해 변환할 수 있습니다. 막 바인딩 용량 수 수 폐지, 예를 들어 막 바인딩 도메인의 트리밍 또는 주요 아미노산 잔류물 (예를 들어, 사이트에 대 한 N-myristoylation, S-acylation, 또는 prenylation, 등)의 사이트 감독 mutagenesis.
공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 법, 대 한 세포 FM 4-64 염료 처럼 막 마커로 표시 해야 합니다. FM (때문에 간섭 autofluorescence, 불 쌍 한 염료 침투 등) 공부 자료에 적합 하지 않으면 4-64 얼룩, 원형질 막 수 표시, 예를 들어 적절 한 chomophore (태그 통합 플라즈마 막 단백질에 의해 mCherry, RFP, 등). 마커 세포내 막 구획 (endomembranes)에서 무시할 현지화가 필수적 이다.
고정된 샘플 및 항 체를 사용 하는 경우 고칠 수 아날로그 FM 4-64FX 또는 플라즈마 멤브레인 라벨 적절 한 대상에 대 한 항 체에 의해 사용할 수 있습니다. 이 경우에, 고정 절차 단백질의 선택적 손실 세포질과 원형질 막에서 이어질 수 있기 때문에 매우 신중 하 게 결과 평가에 필수적 이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:944px;" width="944">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">FM 4-64</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:384px;">T13320</td>
			<td style="width:184px;">Plasma membrane dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:384px;">D4540 Sigma</td>
			<td style="width:184px;">Dye solvent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:184px;">Equipment for cell labelling and microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:384px;"></td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Ordinary computer</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:384px;"></td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of plasma membrane partitioning for peripherally-associated proteins

이 메서드는 원형질 막 어떤 붙일 태그가 주변 관련 단백질의 원형질 막에 걸쳐 형광 강도의 프로필을 사용 하 여 분할의 결정에 대 한 빠른 접근을 제공 합니다. 측정 된 형광 프로필 셀 주변에 수직으로 적용 하는 선 따라 막과 세포질 형광 분배 모델에 적합 하다. 이 모델은 FM 4 64 표시 된 원형질 막과 세포질 붙일 태그 마커를 표현 하는 참조 셀의 형광 강도 값에서 생성 됩니다. 다양 한 세포 유형 및 유기 체; 메서드를 적용할 수 있습니다. 그러나, 비 이웃 세포의 플라즈마 막만 평가할 수 있습니다. 이 빠른 현미경-기반 방법은 실험, 플라즈마 멤브레인 관련 마커의 미묘 하 고 동적 변화가 예상 된다 고 양이 정해질 필요가, 예를 들어, 억제제 치료 단백질의 돌연변이 체 버전의 분석에 적합 그리고 신호 변환 관측. 메서드는 사용자 친화적인 인터페이스 역할 ImageJ 매크로와 결합 된 멀티 플랫폼 R 패키지에 구현 됩니다.

DREPP10 식물 관련 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질 N-myristoylation와 phosphatidylinositol 인산 염11, 와 정전기 상호 작용을 통해 플라즈마 막으로 연결 되는 12. DREPP으로 식물 세포에서 칼슘 신호 기계 구성 요소 설명 했다 그리고 또한 골격13,14와 상호 작용. 제시 실험에서 ?...

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Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

여기, 선물이 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 원형질 막 협회의 레벨의 정량 분석을 수행 하는 프로토콜. 방법은 막의 전산 분해와 세포 원형질 막 형광 표식으로 표시에서 관찰 된 신호의 세포질 구성 요소를 기반으로 합니다.

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K 조회수.  Faculty of Science, Charles University. 여기, 선물이 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 원형질 막 협회의 레벨의 정량 분석을 수행 하는 프로토콜. 방법은 막의 전산 분해와 세포 원형질 막 형광 표식으로 표시에서 관찰 된 신호의 세포질 구성 요소를 기반으로 합니다.

비디오: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

연구

생물학

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

K-공간 이미지의 상관 관계 분광학을 사용하여 EGFP-태그 플라즈마 막 단백질의 확산 계수의 간편한 측정

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...