Name: preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics at JoVE.com

Vielen Dank an die Indiana University Masse Spektroskopie Anlage und der University of Utah Metabolomik Core Facility für die Unterstützung bei der Optimierung dieses Protokolls. J.M.T. wird durch das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Preis Anzahl R35GM119557 unterstützt.

1. die Eizellentnahme
<ol><li>Ausgewachsene Männchen und jungfräulichen Weibchen der gewünschten Genotypen zu sammeln. Individuell Alter dieser Tiere in einer Lebensmittel Durchstechflasche mit Bloomington Standardmedien für 3 – 5 Tage.</li>
	<li>Die entsprechenden Paarungen durch die Übertragung von 50 jungfräulichen Frauen und 25 Männer zu einem neuen Lebensmittel-Fläschchen eingerichtet. Hinweis: Ein Minimum von sechs unabhängigen Verpaarungen sollten für jeden Genotyp eingerichtet werden. Nur eine Probe wird aus jeder Verpaarung (d. h. sechs Proben von sechs unabhängigen Paarungen) gesammelt werden.</li>
	<li>
Bereiten Sie Melasse eierlegende Kappen.
	<ol>
<li>Mischen Sie 115 mL Melasse und 29 g Agar mit 700 mL H2O in eine 2 L Flasche.</li>
		<li>Kochen Sie die Melasse Agar Mischung auf einer heißen Platte.</li>
		<li>Auf 70 ° c abkühlen lassen</li>
		<li>Fügen Sie 25 mL saure Mischung (20 mL 85 % Phosphorsäure und Propionsäure 209 mL in 1 L H2O; Store in einer braunen Flasche) und 10 mL 10 % p-hydroxy-Benzoesäure Acid Methylester in 95 % igem Ethanol.</li>
		<li>Gießen Sie die Melasse-Agar in Deckel und Boden Teil einer 35 x 10 mm2 Gewebekultur Schüssel. Hinweis: Vor dem Gießen Melasse Agarplatten, sicher sein, dass die Deckel und/oder Basis der 35 x 10 mm2 Platte Snuggly in den Mund einer Drosophila Lager Flasche passen (im Schritt 1.6 beschrieben). Je nach Marke von Platten verwendet könnte die Basis nicht verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frischen Hefe einfügen durch Zugabe von destilliertem Wasser zu aktivieren Trockenhefe (5 g Hefe/7 mL Wasser) bis die Mischung wird eine Paste, die auf einer festen Oberfläche (d. h., die Konsistenz der Erdnussbutter) leicht verbreitet werden kann.</li>
	<li>Ca. 1,5 g Hefe Paste auf der Oberfläche einer Melasse eierlegende Kappe zu verbreiten.</li>
	<li>Stecken Sie vier Luftlöcher in gegenüberliegenden Seiten aus einem Kunststoff 6 Unzen Drosophila Lager Flasche mit einer 22 G Nadel.</li>
	<li>Übertragen Sie die neu verknüpften fliegen aus der Lebensmittel Durchstechflasche in Kultur Flaschen. Hinweis: Fliegen können übertragen werden, indem Sie entweder mit CO2 als eine vorübergehende Betäubung oder von der Spitze der Ampulle in die Mündung der Flasche halten und scharf Tippen auf den Boden der Flasche gegen eine Benchtop.</li>
	<li>Setzen Sie schnell eine Melasse eierlegende Kappe mit Hefe-Paste auf der Oberfläche in den Mund einer Drosophila Lager Flasche. Verwenden Sie Labor Band um eierlegende GAP im Ort zu sichern. Hinweis: Wenn fliegen narkotisierten vor der Übertragung waren, sollte die Flasche horizontal der Benchtop auferlegt werden bis alle fliegen erholt haben. Einmal fliegen völlig mobil sind, stellen Sie die Flasche in einem Inkubator mit der Melasse eierlegende Kappe an der Unterseite der Kultur.</li>
	<li>Die Verschlusskappe Melasse eierlegende mindestens einmal täglich für die ersten beiden Tage durch Umkehrung der Lager Flasche, durch Tippen auf den Boden der Flasche gegen die Benchtop entfernen die alte Ei-Kappe und sofort eine neue Ei-Kappe in die Mündung der Flasche platzieren. Entsorgen Sie die alte eierlegende Kappe. Hinweis: Diese Schritt wird sichergestellt, dass die Weibchen ihre Eier nicht halten und ermöglicht die Sammlung von synchronisierten Populationen.</li>
	<li>Legen Sie eine neue eierlegende Kappe in die Lager Flasche nach Tag 3, ersetzen nach 2 h, und verwerfen. Entfernen Sie und ersetzen Sie die zweite Eiablage GAP nach vier Stunden. Beschriften Sie diese eierlegende Kappe mit Datum, Uhrzeit und Genotyp. Hinweis: Die Eier gesammelt während dieser 4 h-Fenster werden für die Analyse verwendet werden. Diese Synchronisierung Schritt ist wichtig für die Analyse von bestimmter Entwicklungsstadien. Eier können auf diese Weise für mehrere Tage gesammelt werden.</li>
	<li>Legen Sie die eierlegende Kappen in ein 60 x 15 mm2 Petri und Ort in einem Inkubator auf die gewünschte Temperatur und Luftfeuchtigkeit.</li>
	<li>Überprüfen Sie die eierlegende Kappen jeden Tag Probleme mit Hunger, Bevölkerungsdichte oder Kontamination. Hinweis: Die Larven müssen Zugang zu ausreichender Ernährung, kontinuierliche Entwicklung zu gewährleisten. Falls erforderlich, kann frische Hefe einfügen auf eierlegende Großbuchstaben verteilt werden, die im Experiment verwendet werden. Außerdem, wenn die Larven Bevölkerungsdichte zu hoch ist, startet Larven aus der Kultur-Platte zu Wandern. Diese Proben sollten nicht für Metabolomic Analyse benutzt werden, weil die hohe Bevölkerungsdichte und Fortgeschrittene Anfälle von Hunger erlebt beim Wandern zu inkonsistenten Daten führen werden. Eine Dichte von ca. 80 – 100 mittlere zweiten Instar Larven (L2) pro Platte oder 40 – 50 mittlere dritte Instar Larven (L3) pro Platte wird empfohlen. Proben, die sichtlich mit Bakterien oder Pilzen kontaminiert sind, müssen entsorgt werden.</li>
</ol>2. Larven Musterkollektion
<ol><li>Alter Larven bis die gewünschte Stufe. Wenn L3 Larven sammeln, resynchronize Proben bei der Häutung L2-L3. Resynchronisation wird häufig durch eine zuvor beschriebenen Methode, die die vorderen Atemlöcher als eine Entwicklungsstörung Meilenstein15 nutzterreicht. Alternativ können Mitte L3-Larven mit ein sgs3 Reporter-gen16synchronisiert werden. Hinweis: In diesem Zusammenhang finden wir Mitte L2 Larven (~ 60 h nach der Eiablage) eignen sich ideal für die meisten Analysen, weil Larvalentwicklung zu diesem Zeitpunkt noch relativ synchron ist, sorgfältig gesammelte Proben haben angemessene Nahrung, diese Timepoint zu entwickeln und die Anzahl der Tiere pro Probe ist überschaubar (siehe unten). Ein zusätzliche Synchronisation Schritt ist erforderlich für L3-Larven, weil die zahlreichen Ecdyson Impulse, die während der L3 Entwicklung auftreten dramatische Auswirkungen auf den Stoffwechsel haben und Artefakte in nicht synchronisierten Populationen erzeugt.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sezierenden Nadel um zu heben Sie vorsichtig die Hefe-Paste aus dem Agar. Legen Sie die Hefe auf eine neue Melasse-Agar-Kappe. Hinweis: Die meisten Larven fressen an der Schnittstelle zwischen der Melasse-Agar und die Hefe-Paste.</li>
	<li>Verwenden Sie einen kleinen Pinsel, um Larven von der abgebrochenen Oberfläche des Nährbodens Melasse zu sammeln. Legen Sie die Larven in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen auf Eis. Hinweis: Geeignete Stichprobengröße für jede Entwicklungsstufe sind wie folgt: zuerst instar 50 Larven (L1); 25 Mitte L2 Larven; 20 frühen L3-Larven; 15 Mitte L3 oder späten L3-Larven.</li>
	<li>Waschen Sie und frieren Sie Proben (Schritte 2,3 bis 2,8) in kleinen Chargen (vier bis sechs Proben ein) während einer großen Muster-Set zu sammeln. Proben müssen innerhalb von 20 min des Legens der Larven in Rohre eingefroren werden. Hinweis: Wir empfehlen Eppendorf 1,5 mL Flex Rohre verwenden, da andere Röhren Probentransfer bei Schritt 3 stören können. Proben müssen in Microfuge Röhren gesammelt werden. Sammeln Sie keine Proben in den Wulst Röhren im Schritt 3.1 beschrieben. Keramische Perlen behalten die NaCl Waschlösung, die führt zu ungenauen massenmessungen und Verunreinigungen in der Probe führt.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL eiskaltes 0,9 % NaCl in das Rohr, den Deckel schließen und vertikal spiegeln das Rohr gründlich um die Larven zu waschen.</li>
	<li>Setzen Sie den Schlauch wieder auf Eis für ~ 30 s. Während dieser Zeit Larven werden auf den Boden des Rohres sinken, aber Hefe bleibt in der Schwebe. Sobald alle Larven eine lose Pellets gebildet haben, entfernen Sie die NaCl-Lösung mit einer 1 mL-Pipette.</li>
	<li>2.4 und 2.5 Schritt zweimal wiederholen, oder bis der letzte Waschlösung ist klar. Hinweis: Zusätzliche waschen Schritte möglicherweise erforderlich, wenn die gesammelten Probe eine übermäßige Menge an Hefe enthält.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.000 × g für 1 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie alle verbleibenden Lösung mit einer Pipette 200 µL.</li>
	<li>Sofort frieren Sie die Probe in flüssigem Stickstoff ein. Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Proben können bis zu 3 Monate bei-80 ° c gelagert werden</li>
</ol>3. Übertragung der Proben auf Bead Tubes
<ol><li>Jede Larven Probe muss auf eine 2 mL-Schraubverschluss-Röhrchen mit 1,4 mm Keramik Perlen aus der 1,5 mL Microfuge Tube übertragen werden. Verwenden Sie in Vorbereitung auf diesen Transfer Schritt einen Ethanol-Beweis-Marker an die Seite einer 2 mL Schraubverschluss Wulst Röhre beschriften (Markierungen auf dem Deckel werden bei Schritt 4.4 zerstört).</li>
	<li>Tara die Masse der beschrifteten Bead Tube mit einer Analysenwaage genau messen 0,01 mg.</li>
	<li>Wenn Larven Proben bei-80 ° C gelagert wurden, legen Sie Probenröhrchen in flüssigem Stickstoff vor der Übertragung.</li>
	<li>Lange Pinzette verwenden, um das 1,5 mL Probenröhrchen von flüssigem Stickstoff entfernen Dewar.</li>
	<li>Nitrilhandschuhe, greifen die gefrorenen Rohr, umkehren und scharf Pfund den Schlauch Deckel gegen die Tischplatte, die gefrorene Kugel zu verdrängen. Sofort Gießen Sie das Pellet in eine vorher tarierten 2 mL Schraubverschluss Bead Tube. Wenn die Pellets nicht zu verdrängen, das Rohr zu flüssigem Stickstoff zurück und wiederholen. Hinweis: Larven Pellets werden nicht von allen Microfuge Röhren vertreiben. Wenn einen Schlauch als dem empfohlenen verwenden, festzustellen Sie, ob Larven Pellets vor dem Sammeln von Proben für die Analyse verdrängt werden können.</li>
	<li>Die kombinierte Masse der Larven Pellet und Bead Tube schnell zu messen. Legen Sie das Probenröhrchen sofort in flüssigem Stickstoff. Die Larven Pellet Masse wird verwendet, um die Metabolomic Daten zu normalisieren. Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Proben können bis zu 3 Monate bei-80 ° c gelagert werden</li>
</ol>4. Probe Extraktion
<ol><li>Legen Sie die Probenröhrchen in einem Benchtop-20 ° C kühler.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 0,8 mL prechilled (-20 ° C) 90 % Methanol mit 2 µg/mL Bernsteinsäure-d4 Säure in jedes Rohr. Zurück die Probe der Benchtop-20 ° C kühler. Hinweis: Die Bernsteinsäure-d4-Säure dient als interner Standard. Verwenden Sie nur HPLC Klasse H2O und Methanol. Da Methanol und anderen organischen Lösungsmitteln flüchtige und schwierig, genau zu messen, mit Luft Hubraum Pipetten sind, empfehlen wir Positive Verschiebung Pipetten für diesen Schritt und alle folgenden Schritte.</li>
	<li>Richten Sie eine Negativkontrolle durch Zugabe von 0,8 mL prechilled (-20 ° C) 90 % Methanol mit 2 µg/mL Bernsteinsäure-d4 Säure in eine leere Bead Tube.</li>
	<li>Homogenisieren von Proben für 30 Sekunden bei 6,45 m/s mit einer Wulst Mühle Homogenisator befindet sich in einem Kontrollraum 4 ° C Temperatur. Hinweis: Die Nichtbeachtung der Larven Pellet rasch und vollständig zu homogenisieren ist eine Sourceschaltung der Variabilität der Metabolomik Analyse. Verwenden Sie nur Homogenisatoren, die zerstören, gefrorene Larven Gewebe innerhalb von 30 s.</li>
	<li>Zurückkehren Sie die homogenisierte Proben-Röhrchen zu-20 ° C Benchtop Kühler und inkubieren sie in einem Gefrierschrank-20 ° C für mindestens 1 h.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre mit 20.000 × g oder maximale Geschwindigkeit für 5 min bei 4 ° C um die daraus resultierenden Niederschlags zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie 600 µL des Überstands zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Stören Sie den Niederschlag nicht. Wenn das voreilige Pellet, beim pipettieren des Überstands verdrängt wird alle überstand in das Röhrchen zurück und wiederholen Sie Schritt 4.6.</li>
	<li>Legen Sie die Probenröhrchen in einer Vakuum-Zentrifuge. Achten Sie darauf, dass alle Röhren geöffnet sind, vor dem Versiegeln der Zentrifuge. Die Proben bei Raumtemperatur trocknen, bis alle Lösungsmittel entfernt ist (dieser Schritt dauert in der Regel ~ 16 h in Anspruch). Hinweis: Falls erforderlich, kann das Protokoll an dieser Stelle angehalten werden. Getrocknete Probe kann bei-80 ° c gelagert werden</li>
</ol>(5) chemische Derivatisierung
<ol><li>Wenn die getrockneten Proben bei-80 ° C gelagert wurden, ungeöffnete Probenröhrchen in einer Vakuum-Zentrifuge und für 30 min trocknen. Dieser Schritt muss ausgeführt werden, vor dem Öffnen des probenröhrchens. Hinweis: Diese Schritt entfernt das Kondenswasser, das an der Außenseite des Microfuge Rohres Entnahme aus der Tiefkühltruhe sammelt. Dieser Teil des Protokolls ist extrem empfindlich gegenüber H2O und zusätzliche Vorsichtsmaßnahme getroffen werden, um alle Reagenzien so trocken wie möglich zu halten.</li>
	<li>
Bereiten Sie eine Lösung von 40 mg/mL Methoxylamine Hydrochlorid (MOX) in wasserfreiem Pyridin. Verwenden Sie nur wasserfreies Pyridin. Speichern von MOX und Pyridin in den Exsikkator gestellt und bereiten Sie täglich die MOX-Lösung. Achtung: MOX und Pyridin sind giftig. Bereiten Sie diese Lösung in der Dunstabzugshaube.<ol>
<li>Verwenden einer Heißluftpistole eine 1 mL Spritze mit Glas zu trocknen.</li>
		<li>Stechen Sie die Nadel der Spritze in die Flasche von wasserfreiem Pyridin. 1 mL Pyridin zu entfernen und Hinzufügen einer Microfuge Röhre mit 40 mg von MOX.</li>
		<li>Spülen Sie die Flasche von wasserfreiem Pyridin mit Argon. Verschließen Sie die Flasche und in den Exsikkator zurück.</li>
		<li>Lösen Sie MOX in die Pyridin durch das Rohr in einem thermischen Mischer bei 35 ° C für 10 min bei 600 u/min Inkubation auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die getrocknete Probe 40 µL von 40 mg/mL MOX in wasserfreiem Pyridin Projektmappe hinzufügen.</li>
	<li>Wirbel für 10 s und kurz Zentrifuge (10.000 X g für 20 s).</li>
	<li>Inkubation bei 30 ° C für 1 h bei 600 u/min in einem thermischen Mischer.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 20.000 × g oder maximale Geschwindigkeit für 5 min um den Feinstaub zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie 25 µL des Überstands in einem Autosampler Fläschchen mit einem Glaseinsatz Microvolume 250 µL deaktiviert.</li>
	<li>Hinzufügen von 40 µL des N- Methyl -N- Trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) mit 1 % TMCS. Achtung: MSTFA ist giftig. Führen Sie diesen Schritt in der Dunstabzugshaube. Hinweis: Falls vorhanden, kann dieser Schritt durch eine Gerstel-Autosampler ausgeführt werden.</li>
	<li>Setzen Sie eine Kappe auf dem Autosampler Fläschchen und Dichtung mit einem Crimper Tool.</li>
	<li>1 Stunde mit schütteln (250 u/min) inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C.</li>
	<li>Fatty Acid Methyl Ester (Kamera) Standardlösung als zuvor Desceribed3vorbereiten. Der Autosampler Durchstechflasche mit einem Roboter Autosampler unmittelbar vor der Injektion fügen Sie 3 µL FAMES hinzu. Hinweis: FAMEs dienen zur Retention Time-Shift zu kalibrieren und prüfen die Geräteleistung. Wenn keine Roboter Autosampler verfügbar ist, können Berühmtheiten während Schritt 5.8 hinzugefügt werden.</li>
</ol>6. GC-MS-Detektion
Hinweis: In den meisten Fällen wird der Benutzer mit Hilfe einer Massenspektroskopie Core Facility diesen Schritt durchführen. Dieses Protokoll soll mit einem 30 m, GC-Säulen mit einer Vorsäule 5 m verwendet werden.
<ol><li>Zufällig die Probe bestellen.</li>
	<li>
Bereiten Sie das GC-MS.
	<ol>
<li>Die Helium-Träger-Gas-Durchfluss bis 1 mL/min eingestellt.</li>
		<li>Legen Sie die Vorlauftemperatur bis 250 ° C.</li>
		<li>Programmieren der GC der folgenden Temperaturgradient ausführen:<ol>
<li>Anfängliche Temperatur 95 ° c mit einen Einfluß von 1 min.</li>
			<li>Erhöhen Sie die Temperatur auf 110 ° C mit einer Rate von 40 ° C/min einen Halt von 2 min.</li>
			<li>Bis 5° C/min Rampe auf 250 ° C ansteigen.</li>
			<li>Bis 330 ° C mit einer Rate von 25 ° C/min einen letzten Halt von 4 min erhöhen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Solvent Verzögerung auf 3,5 min einstellen Hinweis: Die Zeit kann nach dem GC-MS-System geändert werden. Dieser Schritt soll MSTFA und MOX verhindern Beschädigungen des Detektors.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren Sie 1 µL der derivatisierte Probe in das GC-MS (split-Verhältnis von 10:1). Hinweis: Spritzen Sie 2 µL der Probe, wenn die Intensität der Peaks zu niedrig ist. Die Injektion Reihenfolge der Proben sollte randomisiert werden.</li>
	<li>Das Massenspektrometer in full-Scan-Modus zu betreiben, über einen Massenbereich von 50 – 500 m/Z.</li>
</ol>7. die Datenanalyse
<ol><li>Metabolomic Datenanalyse verwenden entweder eine gezielte oder ungezielte Ansatz. Gezielte Analyse konzentriert sich auf die Messung der Fülle an einen definierten Satz von Metaboliten, wie z. B. die Laktat-Messungen, denen wir weiter unten beschreiben. Im Gegensatz dazu verwendet ungezielte Analyse eine unvoreingenommene Herangehensweise, um jede metabolische Funktion zu identifizieren, die zwischen den zwei Sample-Sets erheblich geändert wird. Hinweis: Unser Labor verwendet in erster Linie die kostenlose Programme MetAlign17 und MetaboAnalyst18,19 für die Datenanalyse. Da eine angemessene Beschreibung der Qualitätskontrolle, Normalisierung, sowohl die Datenverarbeitung Schritte gehen über den Rahmen dieser Handschrift, verweisen wir den Benutzer auf ausführlichere Protokolle, die Datenverarbeitung20,21gewidmet sind, 22. Darüber hinaus kann ein Flussdiagramm beschreibt die Schritte für diese Analyse an anderer Stelle8gefunden.</li>
</ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development.">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Metabolomik bietet eine einmalige Gelegenheit die Stoffwechselreaktionen vermessen, die intermediären Stoffwechsel zu komponieren. Die Empfindlichkeit dieser Technologie macht jedoch Daten anfällig für genetische Hintergrund, Entwicklungsstörungen Cues und eine Vielzahl von Umweltbelastungen, einschließlich Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Bevölkerungsdichte und nährstoffverfügbarkeit. Daher eine hohe Qualität und reproduzierbare Metabolomik Analyse erfordert, dass Proben unter sehr kontrollierten Bedingungen gesam...

Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster ist entstanden, als ein ideales System für das Studium des molekularen Mechanismus, der intermediären Stoffwechsel regulieren. Nicht nur sind die meisten Stoffwechselwege konserviert zwischen Mensch und Drosophila , aber wichtigen Nährstoff Sensoren und Wachstumsregulatoren, wie Insulin, Tor und Myc, sind auch aktiv in die Fliege1,2. Drosophila ist dadurch lässt sich die metabolische Grundlagen menschlicher Erkrankungen, Diabetes und Adipositas bis hin zu Neurodegeneration und Krebs zu erforschen. In diesem Zusammenhang bietet Drosophila Larvalentwicklung den idealen Rahmen, um eine metabolische Studiengang als aerobe Glykolyse oder der Warburg-Effekt bekannt. So wie viele Tumoren aerobe Glykolyse Biomasse aus Kohlenhydraten zu generieren, aktivieren Sie also dazu Drosophila Larven aerobe Glykolyse zur Förderung der entwicklungspolitischen Wachstum3,4,5. Diese Ähnlichkeiten zwischen Larven und Tumor-Stoffwechsel Drosophila als ein Modell für das Verständnis wie aerobe etablieren Glykolyse ist geregelt in Vivo.
Trotz der Tatsache, die die Fliege als ein beliebtes Modell für Stoffwechsel entstanden ist, setzen die meisten Drosophila Studien auf Methoden, die entworfen sind, um die einzelnen Metaboliten3, wie Trehalose, Triglyceride oder ATP zu messen. Da ein bestimmtes Protokoll erforderlich ist, um jede Metaboliten zu messen, sind Assay-basierten Studien arbeitsintensiv, teuer und voreingenommen gegenüber dieser Verbindungen, die mit kommerziellen Kits gemessen werden kann. Eine Lösung für diese Einschränkungen entstanden aus dem Bereich der Metabolomik, sorgt für eine effizientere und unvoreingenommene Mittel der Drosophila Stoffwechsel. Im Gegensatz zu einem Assay-basierten Studie kann eine einzelne Metabolomic Analyse gleichzeitig Hunderte von niedermolekularer Metaboliten zu messen und bieten ein umfassendes Verständnis von einem Organismus Stoffwechsellage6,7. Diese Technik hat die Drosophila metabolische Studien deutlich erweitert und repräsentiert die Zukunft dieser aufstrebenden Feld8.
Metabolomic sind in erster Linie Studien mit drei Technologien: (i) Kernspinresonanz (NMR), (Ii) flüssige Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und (Iii) Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)9. Jeder Ansatz bietet deutliche Vorteile und Nachteile, und alle diese Technologien wurden verwendet, um erfolgreich studieren Drosophila Stoffwechsel. Da die Forschung in unserem Labor auf kleine, polaren Metaboliten gerichtet ist, beschäftigen wir in erster Linie eine GC-MS-basierte Methode. GC-MS bietet dem Anwender eine Reihe von Vorteilen, einschließlich hohe Reproduzierbarkeit, Peak Auflösung, Empfindlichkeit, und die Verfügbarkeit einer standard Elektron Auswirkungen (EI) spektrale Bibliothek, ermöglicht eine schnelle Bestimmung entdeckt metabolische Funktionen10,11. Die Vorbereitung der Proben für GC-MS, jedoch ist etwas komplex und erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit zum Detail. Proben müssen gesammelt, gewaschen, gewogen und in einer Weise, die schnell Stoffwechselreaktionen stillt eingefroren. Darüber hinaus fliegende Karkasse ist resistent gegen standard Homogenisierung Protokolle und erfordert eine Rührwerksmühle um optimale Metabolit Extraktion zu gewährleisten. Zu guter Letzt müssen Proben von GC-MS analysiert chemische Derivatisierung vor Erkennung12unterzogen werden. Während zuvor veröffentlichte Methoden alle diese Schritte3,13,14 beschreiben, ist eine visuelle Protokoll, die den unerfahrenen Benutzer reproduzierbar hochwertige Daten generieren lassen würde noch benötigt. Hier zeigen wir wie Drosophila Larven Proben für Metabolomik GC-MS-basierte Analyse vorzubereiten. Dieses Protokoll ermöglicht dem Benutzer, reproduzierbar Messen viele der kleinen polaren Metaboliten, die zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel zu komponieren.

<table><tbody><tr><td>Unsulfured blackstrap molasses</td><td>Good Food, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyamine hydrocholoride (MOX)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA with 1% trimethylchlorosilane</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>Fleischmann&amp;rsquo;s Active dry yeast</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6oz Drosophila stock bottle</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)&amp;nbsp;</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-627</td><td></td></tr><tr><td>Vial insert, 250 &amp;micro;L deactivated glass with polymer feet</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-Phosphoric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxy benzoic acid methyl ester</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>GC column</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics

Die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der Metabolomik haben der Taufliege Drosophila Melanogaster als ein leistungsfähiges genetischen Modell für tierischen Stoffwechsel etabliert. Durch die Kombination von der Vielzahl der Drosophila genetische Werkzeuge mit der Fähigkeit, große Schwaden des intermediären Stoffwechsels Umfrage, kann ein Metabolomik Ansatz komplexe Wechselwirkungen zwischen Ernährung, Genotyp, Lebensgeschichte Veranstaltungen und ökologische Hinweise offenbaren. Darüber hinaus können Metabolomik Studien entdecken Sie neuartige enzymatische Mechanismen und bisher unbekannte Verbindungen zwischen scheinbar disparaten Stoffwechselwege zu entdecken. Um eine breitere Nutzung dieser Technologie unter den Drosophila -Community zu erleichtern, bieten wir hier ein detailliertes Protokoll, der beschreibt, wie Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) vorbereiten- Metabolomic Analyse basiert. Unser Protokoll enthält Beschreibungen der Larven Musterkollektion, Metabolit Extraktion, chemische Derivatisierung und GC-MS-Analyse. Erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls ermöglicht es Benutzern, die relative Häufigkeit von kleinen polaren Metaboliten, darunter Aminosäuren, Zucker und organischen Säuren beteiligt in Glykolyse und der TCA-Zyklen zu messen.

Laktat-Dehydrogenase (dLDH) Mutanten, die dLDH Aktivität4und genetisch passenden Steuerelemente fehlen wurden als Mitte-L2 Larven gesammelt und nach oben beschriebenen Protokoll verarbeitet. Im Vergleich zu Kontrollen zeigen mutierte Larven signifikante Veränderungen in Laktat, Pyruvat und L-2-Hydroxyglutarate-4. Spektren wurden mit einem Agilent GC6890-5973i MS-System erworben. Ein Beispiel für die GC-MS Spektren erzeugen mit un...

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Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Dieses Protokoll beschreibt die Drosophila Larven für GC-MS-basierte Metabolomic Analyse vorzubereiten.

Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

preparation-drosophila-larval-samples-for-gas-chromatography-mass

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

11.0K Aufrufe.  Indiana University. Dieses Protokoll beschreibt die Drosophila Larven für GC-MS-basierte Metabolomic Analyse vorzubereiten.

Serie: Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Genetik

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Mittelmaßnahme Vorbereitung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoextrakte für Proteomversuche

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

Biochemie

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Neurowissenschaften

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Biologie

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

Überwachung des Metabolitentransports im Gehirn in Drosophila mit FRET-Sensoren

Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors

The high energy requirements of brains due to electrical activity are one of their most distinguishing features. These requirements are met by the production of ATP from glucose and its metabolites, such as the monocarboxylates lactate and pyruvate. It is still unclear how this process is regulated or who the key players are, particularly in Drosophila.
Using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors, we present a simple method for measuring the transport of monocarboxylates and glucose in glial cells and neurons in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation. The protocol describes how to dissect and adhere a larval brain expressing one of the sensors to a glass coverslip. 
We present the results of an entire experiment in which lactate transport was measured in larval brains by knocking down previously identified monocarboxylate transporters in glial cells. Furthermore, we demonstrate how to rapidly increase neuronal activity and track metabolite changes in the active brain. The described method, which provides all necessary information, can be used to analyze other Drosophila living tissues.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte in der Forschung zum Energiestoffwechsel des Gehirns mit dem Drosophila-Modell

Here we present a protocol to visualize the transport of monocarboxylates, glucose, and ATP in glial cells and neurons using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation.

Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik

Zusammenfassung

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Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Mittelmaßnahme Vorbereitung von

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus

Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven

Visualisierung von Monocarboxylaten und anderen relevanten Metaboliten im ex vivo Drosophila-Larvengehirn mit genetisch kodierten Sensoren

Visualisierung von Monocarboxylaten und anderen relevanten Metaboliten im ex vivo Drosophila-Larvengehirn mit genetisch kodierten Sensoren

Visualisierung von Monocarboxylaten und anderen relevanten Metaboliten im ex vivo Drosophila-Larvengehirn mit genetisch kodierten Sensoren