Wir wollen danken Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) für seine Unterstützung beim Aufbau der selbst geschriebenen Skripts für den Teller-Leser. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die österreichische "Fonds Zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung" (FWF), PM (P24189) und das PhD-Programm "DK Molekulare Enzymologie" (W901) bis Uhr.

1. Entwurf, Erstellung und Ausdruck von Lux Operon in Escherichia coli
Hinweis: Weitere Informationen zu kommerziellen Kits, die in diesem Abschnitt verwendeten Tabelle der Materialien .
<ol><li>Wählen Sie für die Übertragung von Lux Operon in E. Coli einen standard Haustier Vektor mit entsprechenden Restriktionsschnittstellen und Antibiotikaresistenz-gen des Interesses (z. B. pET28a; NcoI, XhoI, Kanamycin).</li>
	<li>Die Fragmente zu entwerfen und überlappende Zündkapseln für Gibson Montage anhand der DNA-Sequenz des Photobacterium Mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).</li>
	<li>Einrichten einer standard PCR-Reaktion mit der gestalteten Grundierungen und die isolierte genomische DNA Photobacterium Mandapamensis 27561 als Vorlage (siehe Zusatzmaterial für Grundierungen und Bedingungen). Hinweis: Isolierung der genomischen DNA des jeweiligen Bakterienstamm erhöht PCR Wirksamkeit.</li>
	<li>Reinigen Sie das PCR-Produkt über Spin-Spalte Reinigung.</li>
	<li>Durchführen Sie eine Beschränkungsverdauung des isolierten pET28a Vektors mit NcoI und XhoI bei 37 ° C für 45 min..</li>
	<li>Reinigen des linearisierten Vektors und der PCR-Fragmente über Agarose gel Elektrophorese und anschließenden Spin-Spalte Reinigung.</li>
	<li>Bestimmen Sie die DNA-Konzentration von Fragment und der linearisierten Vektor und berechnen Sie die optimalen Mengen für die Montage entsprechend der Protokoll-20,-21. Hinweis: Wirksamkeit der Versammlung Fragmentgröße und Anzahl abhängig und muss gemäß des Herstellers Protokoll20,21angepasst werden.</li>
	<li>Brüten Sie nach Kombination alle Fragmente und der Puffer in einem PCR-Röhrchen die Montage-Mischung in einer PCR-Maschine bei 50 ° C für 1 h.</li>
	<li>Gefertigten Produktes Vektor nach standard Transformation Protokolle für E. Coli Bakterien Plasmid Umwandlung in einen entsprechenden E. Coli zu verwandeln-System für high-Yield-Plasmid-Replikation (z. B. E. Coli TOP10 (oder XL-1).</li>
	<li>Wählen Sie aus der Transformation Platte und Streifen auf neue Platten für die DNA-Isolierung Kolonien.</li>
	<li>Plasmid-DNA nach Standardprotokollen zu isolieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie die korrekte Montage des Plasmids einschließlich alle Fragmente, führen Sie zuerst eine Kolonie-PCR nach Standardprotokolle mit Primer spezifisch für jedes montierte Fragment.</li>
	<li>Zusätzlich zu der Kolonie PCR und nachfolgende Agarose-Gelelektrophorese, bereiten Sie alle isolierten Montage Vektoren für die DNA-Sequenzierung, die fachgerechte Montage und die korrekte DNA-Sequenzen zu überprüfen.</li>
	<li>Transformieren der verifizierte Plasmid gemäß standard Transformation Protokolle für E. Coli Bakterien Plasmid Umwandlung in einen entsprechenden E. Coli System für high-Yield-Protein-Produktion (e.g.,E. coli BL21). Hinweis: Fahren Sie direkt mit Ausdruck Protokoll unten. Bei längerer Lagerung empfiehlt sich die Erstellung einer Glycerin-Aktie.</li>
</ol>(2) Ausdruck der veränderten E. Coli -Stämme
<ol><li>Ausdruck eine Übernacht-Kultur (ONC) vorbereiten, durch Inokulation von einem entsprechenden Volumen der LB-Medium (z. B. 100 mL) mit dem vorbereiteten Glycerin bestand der E. Coli BL21 Zellen umgewandelt mit dem montierten Plasmid oder direkt von einem Transformation-Platte. Hinzufügen von 100 µL Kanamycin (50 mg/mL; Antibiotikaresistenz-gen des pET28a) und inkubieren Sie ONC bei 37 ° C und 120 u/min in einem Inkubator-Shaker über Nacht.</li>
	<li>Die wichtigsten Ausdruck Kultur (z. B. 800 mL LB-Medium) mit 8 mL ONC impfen und 800 µL Kanamycin (50 mg/mL) hinzufügen.</li>
	<li>Die wichtigste Kultur bei 37 ° C und 120 u/min in einem Inkubator-Shaker inkubieren, bis die Zelldichte eine OD600 von 0,6 erreicht - 0,8 (ca. 2,5 h).</li>
	<li>Reduzieren Sie die Inkubationstemperatur auf 28 ° C.</li>
	<li>Proteinexpression durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,1 mM zu induzieren. Hinweis: Empirische Tests zeigten, dass die Reduzierung der Temperatur auf 28 ° C die höchste Lichtstärke gab.</li>
	<li>Zellen zu beobachten, bis sie anfangen zu leuchten (ca. 1 h). Hinweis: Je nach Zweck des Ausdrucks, die Zellen werden bis zum nächsten Tag angebaut und dann geerntet werden, oder die Zellen können gehalten, schütteln, solange sie (max. 48 h) Leuchten. Ernte der Zellen und Reinigung Proteine kann nach Standardverfahren erfolgen.</li>
</ol>3. Ausdruck der Biolumineszenz Bakterienstämme
Hinweis: Biolumineszenz Bakterienstämme erfordern spezifische Medium/künstliche Meer Wasser Wachstumsmedium für Wachstum und leichte Produktion.
<ol><li>Künstlicher See Wasser Medium, bestehend aus zwei separat bereit mittelkomponenten vorzubereiten. Hinweis: Die Vorbereitung des Mediums künstliche Meer Wasser wurde aus dem ursprünglichen Protokoll22angepasst. Folgende Beträge sind für flüssige Medium 1 L oder 1 L Agar Medium.<ol>
<li>Für künstliche Meer Wasser Medium, wiegen die folgenden Salze: 28,13 g NaCl, 0,77 g KCl, 1,60 g CaCl2 · 2H2O, 4,80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 g Nahco33und 3,50 g MgSO4 · 7H2O.</li>
		<li>1 L destilliertes Wasser hinzufügen und alle Komponenten auflösen.</li>
		<li>Für LB-Medium, wiegen die folgenden Zutaten: 10 g Hefe-Extrakt, 10 g Pepton und für eine zusätzliche 20 g Agar Agarplatten.</li>
		<li>Fügen Sie 250 mL Leitungswasser und lösen Sie Komponenten auf.</li>
		<li>Autoklaven beide Medien separat bei 121 ° C für 20 min vorbereitet.</li>
		<li>Kombinieren Sie für Agarplatten 250 mL LB-Medium mit 750 mL künstliche Meer Wasser Medium direkt nach dem Autoklavieren und bereiten Sie Platten vor.</li>
		<li>Kombinieren Sie für flüssige Medium 250 mL LB-Medium mit 750 mL künstliche Meer Wasser Medium direkt nach dem Autoklavieren oder wenn abgekühlt. Hinweis: Das künstliche Meer Wasser Medium kann trübe durch Salz Niederschlag erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Streifen die Biolumineszenz Bakterienstämme auf künstliche Meer Wasser mittlerer Agarplatten und Inkubation über Nacht bei 24-30 ° C. Hinweis: Lange Lagerung von Bakterienstämmen wird normalerweise durch Einfrieren Glycerin Bestände der bakteriellen Kultur erreicht. Stämme sollten immer auf Agarplatten zuerst auf einheitliche Ausgangsbedingungen für alle Stämme, vor dem Gebrauch für flüssige Kulturen aufgrund einer Verzögerung Phase im Wachstum nach dem Auftauen versichern gestreift.</li>
	<li>Bereiten Sie eine ONC durch impfen 100 mL künstliche Meer Wasser Medium mit einer einzigen Kolonie von der Platte. Inkubieren Sie ONC bei 24-30 ° C und 120 u/min in einem Inkubator-Shaker über Nacht.</li>
	<li>800 mL künstliche Meer Wasser Medium mit 8 mL ONC zu impfen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Bakterienzellen bei 24-30 ° C und 120 u/min in einem Inkubator-Shaker. Hinweis: Die Lichtintensität Profil von biolumineszenten Bakterien variiert stark mit der Temperatur. Abhängig von der Regulationsmechanismen der leichten Produktion von den jeweiligen Bakterienstamm kann Lichtemission nach ca. 1-6 h gestartet.</li>
	<li>Bakterienzelle Kultur zu beobachten, bis sie anfangen zu leuchten (ca. 1-6 h). Hinweis: Je nach Zweck des Ausdrucks, die Zellen werden bis zum nächsten Tag angebaut und dann geerntet werden, oder die Zellen können gehalten, schütteln, solange sie Leuchten. Ernte der Zellen und Reinigung Proteine kann nach Standardverfahren erfolgen.</li>
</ol>4. in Vivo Aktivität Assay für die Biolumineszenz Bakterienstämme und veränderten E. Coli -Stämme
Hinweis: Lange Lagerung der Stämme ist normalerweise Acieved durch Einfrieren Glycerin Bestände an die Bakterienkultur. Stämme sollten immer auf Agarplatten zuerst auf einheitliche Ausgangsbedingungen für alle Stämme, vor dem Gebrauch für flüssige Kulturen aufgrund einer Verzögerung Phase im Wachstum nach dem Auftauen versichern gestreift.
<ol><li>Streifen der gewünschten Biolumineszenz Bakterienstamm oder veränderte E. Coli auf einer nährbodenplatte belasten und über Nacht bei 28 ° C inkubieren. Hinweis: Die Inkubationstemperatur kann variieren von Stamm zu Stamm und muss empirisch geprüft werden. Biolumineszenz Bakterienstämme zu vergleichen und veränderten müssen E. Coli -Stämme, Wachstumsbedingungen identisch sein.</li>
	<li>3 mL des Mediums mit dem jeweiligen Stamm mit einer einzigen Kolonie von einer nährbodenplatte zu impfen und die Zellen bei 28 ° C und 180 u/min in einem Inkubator Shaker für ca. 1-2 h inkubieren.</li>
	<li>Messen Sie die Zelldichte von einem 01:10 Verdünnung der Flüssigkultur bei 650 nm. Berechnen Sie das Verhältnis und Volumen für 1 mL Kultur mit einem OD-650 von 0,05. Hinweis: Die nachfolgenden Platte Leser Assay bestimmt die Zelldichte bei 650 nm zur Vermeidung von Interferenzen durch die Lichtabstrahlung der Stämme.</li>
	<li>Pipette das berechnete Volumen der Kultur und Medium in einer 24-Well-Platte schwarz Einwandig mit Glasboden. Für die veränderten E. Coli Stamm, die Proben 1 µL Kanamycin (Antibiotika-Resistenz der pET28a Vektor) und 1 µL IPTG (Induktion der Genexpression) hinzugefügt werden. Deckel auf die Platte, um die Verdunstung während der Messungen zu vermeiden. Hinweis: Um sicherzustellen, dass der pET28a-Vektor, enthält das gesamte Lux Operon durch die E. Coli -Kultur nicht verloren geht, muss Kanamycin Samples E. Coli in den Vertiefungen der Platte und zu versichern, dass Licht die Produktion des E. Coli hinzugefügt werden Zellen können gemessen werden, muss der Genexpression mit IPTG induziert werden. Um Übersprechen und Messung Störungen zu vermeiden, schwarz-von Mauern umgebene well-Platten mit Glasboden und transparenten Deckel zeigten die besten Ergebnisse. Dennoch, Übersprechen beobachtet werden und auch Positionen müssen sorgfältig ausgewählt werden.</li>
	<li>Starten Sie die Messung in einem Teller-Reader. Hinweis: Die Platte Leser Protokoll basiert auf einem Skript, speziell entwickelt für diese Probe (siehe Zusatzmaterial), zwei Messungen, Absorption und Biolumineszenz verbindet. Datenpunkte gesammelt werden alle 10 Minuten mit ständigen schütteln zwischen den Messungen und eine Konstante Temperatur von 28 ° C.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der Bau einer expressionsplasmid mit vier Fragmente komponieren das gesamte Lux-Rippe -Operon von p. Mandapamensis 27561 wurde über Gibson Klonen erreicht. Dieses E. Coli basierte Lux Genexpression kann E. Coli Zellen Licht emittieren. Quorum-sensing-Regelung und nicht standardmäßige Wachstumsbedingungen zu vermeiden, sind wesentliche Vorteile dieses Systems.
Die Vorteile der Verwendung von Gibson Klonen Strategie sind die einfache Montage von mehreren linearen DNA-Fragmente, hohe Flexibilität und keine Notwendigkeit einer besonderen Beschränkung Seiten18,19,20. Diese Methode ermöglicht auf einfache Weise eine Lux Operon, mit Ausnahme einzelner Gene oder Gen-Cluster oder Einführung neuer Gene oder den Austausch von Genen aus einem Stamm mit einer anderen ändern. Voraussetzung für die Anwendung dieser Methode ist die Verfügbarkeit der jeweiligen Lux Operon Gensequenz. Nur für eine kleine Anzahl von biolumineszenten Bakterien ist die vollständige DNA-Sequenz des jeweiligen Lux Operon bekannt bzw. erhältlich. Viele dieser Sequenzen sind fragmentiert, weil sie mit Schrotflinte Sequenzierung generiert wurden. Bei den untersuchten p. Mandapamensis 27561 die vollständige DNA-Sequenz des Lux Operon ist bekannt und von der NCBI-Gen-Datenbank zur Verfügung (GenBank: DQ988878.2).
Ein entscheidender Schritt in das Protokoll der Versammlung Gibson ist die Berechnung der DNA-Konzentration der einzelnen Fragmente. In der Versammlung Protokoll des Herstellers es empfohlen wurde, 0,2 - 0,5 Pmols und einem Gesamtvolumen von 20 µL für 4-6 Fragmente20,21. In unserem Fall, wo der LuxCDABFEG-RibEBH aus 4 Fragmente besteht, waren die Konzentrationen und Gesamtmengen 0.1 Pmol und 45 µL bzw., je nach den Ertrag der PCR-Produkte. Auf der einen Seite die Konzentration reduziert werden musste und auf der anderen Seite musste die Lautstärke erhöht werden. Dennoch die Montage funktionierte sehr gut und DNA-Sequenzierung bestätigt das korrekte einfügen auf Anhieb. Diese Feststellung bestätigt Gibson Assembly als eine robuste und geeignete Methode für unsere Untersuchungen, die leicht modifizierte18,19,20.
Die neu gegründete Teller-Leser-Assay ist ein einfach zu bedienendes Methode. Es ermöglicht eine einfache primäre Analyse der neu oder (UN-) bekannte Biolumineszenz Bakterienstämme und gibt bereits einen ersten Hinweis auf den regulatorischen Mechanismus der light-Production (z. B. verzögerten Lumineszenz bei niedrigen Zelldichten). Darüber hinaus können Wachstumsbedingungen in Kombination mit leichten Produktion leicht ausgewertet werden, indem einfach Wachstumsmedium oder Temperatur.
Die Messungen mit dem Teller-Leser wurden bei 28 ° C. Der Grund für diese ungewöhnliche Einstellung ist die Temperaturempfindlichkeit der Biolumineszenz Bakterienstämme, wo Temperaturen über 30 ° C zu weniger oder gar keine Wachstum und/oder Lichtemission führen. Beachten Sie, dass die Platte Leser eine definierte Temperatur im Laufe der Zeit mit der Einschränkung von einer fehlenden aktiven Kühlsystem zu halten vermag. Daher muss die Umgebungstemperatur unter die Temperatur der Messung.
Als ein Proof of Concept der Vergleich von E. Coli -Konstrukt mit der Biolumineszenz Belastung p. Mandapamensis (Abbildung 5) auf der einen Seite und die Referenzmessungen (Abbildung 4) auf der anderen Seite wurden durchgeführt und bestätigen die Zuverlässigkeit dieses neu geschaffenen Systems. Darüber hinaus versichert der Langzeitmessung die Langlebigkeit der Lichtemission (Abbildung 6). Aber man muss berücksichtigen, dass OD-Werte nicht zuverlässig über eine bestimmte optische Dichte, abhängig von den Eigenschaften des verwendeten Messgerät (ca. 15 h im vorliegenden Fall) wo eine entsprechende Verdünnung für eine Messung in bräuchte der linearen Bereich des Detektors. Diese hohe Abweichungen im OD-Werte machen diese lange Messungen nicht zuverlässig. Daher sind kürzere Messungen wie 10 h empfohlen, mit dem experimentellen Setup hier berichtet.
Grenzen der etablierten Platte Leser Assay ist in Abbildung 7ersichtlich. Die Schwierigkeit besteht darin, eine geeignete Einstellung der Messung zu finden. Die "Wertschöpfung" regelt die Empfindlichkeit der Foto-Multiplikator-Röhre (PMT). Der Gewinn ist die Verstärkung des Signals in der PMT, was bedeutet, dass das Signal zu ein höheren Gain-Faktor erhöhen wird. Wenn der Gewinn zu niedrig gesetzt ist, wird das Signal-Rausch-Verhältnis größer und Lichtintensitäten von "niedrig" leuchtendes biolumineszenten Bakterien lässt sich nicht mehr (Signale nahe Null, Daten nicht gezeigt) gemessen. Die Herausforderung in einem Biolumineszenz Assay soll die Verstärkung eingestellt, so dass die Messergebnisse für alle Bakterienstämme innerhalb des Bereichs des Instruments bleiben. Darüber hinaus hängt der Messbereich für Lumineszenz Intervall Messzeit (z. B. bis zu 2.000.000 für 1 s).
Der Gewinn wurde auf 2800, festgelegt, die empirisch geprüft und ausgewählt für den spezifischen Platte-Leser für die Einrichtung dieser Methode verwendet wurde. Die verwendeten Gain-Einstellung ermöglicht die Aufnahme von maximal abgestrahlten Lichts durch die Biolumineszenz E. Coli System, p. Mandapamensis 27561 und p. Mandapamensis S1 ohne Überlauf, aber für die Stämme p. Mandapamensis TH1 und V. Harveyi 14126 der Gewinn war zu hoch. Daher diese letzteren Stämme überschreiten die Nachweisgrenze und die reale maximale Lichtintensität nicht gemessen werden kann. Diese technische Einschränkung könnte den Vergleich von biolumineszenten Bakterien vermeiden, die hohe Temperaturschwankungen in der maximale Lichtemission zu zeigen, obwohl Wachstumsbedingungen und Zelldichten vergleichbar sein könnte.
Positionierung der analysierten Bakterienstämme innerhalb der verwendeten well-Platten muss empirisch geprüft werden. Obwohl schwarz-well-Platten mit Glas Böden verwendet wurden, wurde Übersprechen zwischen den Proben beobachtet. Die Lichtintensität des spezifischen Belastungen ist so hoch, dass alle benachbarten Brunnen falsche positive Lichtemissionen (z. B. leer) angezeigt werden. Daher ist es wichtig, zwei verschiedene Stämme entweder separat oder mit einer bestimmten räumlichen Trennung miteinander zu messen.
Es gibt bereits viele geändert E. Coli -Stämme bekannt, die Teile der Lux Operon enthalten und sind vor allem anwendungsorientierte15,16,17. Die hier beschriebenen Methoden darauf abzielen, Grundlagenforschung, zum Beispiel die Möglichkeit der Analyse jedes Lux gen getrennt. Obwohl Forschung der Biolumineszenz eine lange Geschichte hat, gibt es noch viele offene Fragen. Durch Ausschluss eingeschleuste Gene von Lux Operon, den Austausch der LuxAB Gene mit Genen aus einem anderen Stamm oder Analyse von Protein-komplexe, eingebettet in die einfache Handhabung von E. Coli System- und weiter der Platte Leser-Assay, kann es sein, weitere Informationen über regulatorische Prozesse und Funktionen des Lux -Gene zu gewinnen.

Die Emission von Licht durch lebende Organismen (Biolumineszenz) ist ein faszinierender Prozess, die in Bakterien, Pilze, Insekten, Nematoden, Fische und Tintenfische1gefunden. Biolumineszenten Lichtemission ergibt sich aus einem Chemolumineszenz Reaktion in die chemischer Energie in Lichtenergie ("kaltes Licht") (teilweise) umgewandelt wird. Bei biolumineszenten Bakterien katalysiert die heterodimerisierenden Enzym Luciferase Monooxygenation von langkettigen aliphatischen Aldehyde, wie z. B. Tetradecanal, um die entsprechenden Säuren begleitet von Lichtemission mit einem Maximum an 490 nm2, 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2.jpg"> Abbildung 1 : Allgemeine Reaktionsschema der bakterielle Luciferase. Die bakterielle Luciferase (LuxAB) katalysiert die Monooxygenation von langkettigen Aldehyden (CH3(CH2)nCHO) durch den Einsatz reduziert Flavin mononukleotid (FMNH2) und molekularer Sauerstoff (O2), wodurch die Produkte lange Kette Säuren (CH3(CH2)nCOOH), Flavin mononukleotid (FMN), Wasser (H2O) und die Emission von Licht zentriert auf 490 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Bei dieser Oxidation freiwerdende Energie bewirkt einen angeregten Zustand FMN-4a-Hydroxid, dient als die Licht emittierende Luciferin4. Die Proteine, die im bakteriellen Biolumineszenz, nämlich LuxCDABEG, von Lux Operon codiert sind und sind über verschiedene Bakterienstämme2,5hoch konserviert. Die Gene LuxA und LuxB kodieren für die Luciferase heterodimerisierenden; LuxC, LuxD desund LuxE Genprodukte sind Bestandteil einer Fettsäure-Reduktase Komplex; und LuxG kodiert für eine Flavin-Reduktase-6. Das zusätzliche LuxF Gen tragen eine Reihe von Biolumineszenz Photobacteria (e.g.,Photobacterium Mandapamensis 27561). Es wurde berichtet, dass LuxF ist ein Homodimeric Protein, das die ungewöhnliche Flavin Derivat 6-(3'-(R)-Myristyl bindet)-FMN (MyrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Weitere Gene identifiziert worden, die verantwortlich sind für die Synthese von Riboflavin (z. B. RibEBH) und außerdem regulatorische Gene berichtet worden, dass eine Rolle bei Quorum sensing Regelung der Biolumineszenz, vor allem für Vibrio Fischeri und Vibrio Harveyi6,13. Trotz der hoch konservierte gen Reihenfolge zeigen biolumineszente Bakterien hohe Temperaturschwankungen in Eigenschaften wie wuchsverhalten, Intensität der Lichtemission oder Regulierung der Biolumineszenz2,5,14 .
Mehrere Stämme oder Plasmide enthalten Teile geändert oder ganze Lux -Operons bekannt sind, nutzen Biolumineszenz als Reporter-Systeme. Verschiedene Anwendungen wie z. B. die Bestimmung promotoraktivität, Überwachung von bakterieller Kontaminationen in Umgebung oder Lebensmittelproben, Biolumineszenz Resonanz Energie Transfer (BRET), in-Vivo Bildgebung von Infektionen in Eukaryonten, pyrosequenzierung usw. waren etablierte15,16,17. Interessant ist, verwendeten die drei am häufigsten Biolumineszenz Reporter, die Systeme von der nordamerikanischen Firefly (Photinus Pyralis), der magensaftresistenten Erreger von Nematoden (Photorhabdus Luminescens) und das Meer Stiefmütterchen (Renilla abgeleitet werden Reniformis). Keines dieser Systeme hat einen bakteriellen Ursprungs, aber die Nutzung von Lux -Genen und Operons bakterieller Herkunft gewinnt mehr Interesse für angewandte Forschung16. Die weniger reichliche Anwendung der Biolumineszenz Proteine aus bakteriellen Quellen ist hauptsächlich auf geringere Stabilität und Langlebigkeit der Bakterien abgeleitet leuchtende Proteine bezogen auf ihre marinen Lebensräumen. Biolumineszente Bakterien mariner Lebensräume sind nicht unter standard Laborbedingungen kultivierbar. Diese Bakterien benötigen spezifische Wachstumsmedien und Bedingungen, wie künstliche Meer mittleren und unteren Wachstum/Inkubation Wassertemperaturen (z. B. 28 ° C).
Zur Vereinfachung der Vergleich von Lux Operon Merkmale oder einzelne Lux Gene einer Reihe von verschiedenen biolumineszenten Bakterienstämme, eine Methode, um Lux Operon Ausdruck und Analyse zu standardisieren ist Voraussetzung. So entstand die Idee das gesamte Lux-Rib -Operon in der Standard-Forschung-Bakterium Escherichia coli (E. Coli) zu integrieren. Zu diesem Zweck Gibson Montage erwies sich als ein nützliches Werkzeug, um mehrere lineare, überlappende Fragmente in einem Expressionsvektor ohne die Notwendigkeit einer spezifischen Restriktionsschnittstellen zu integrieren. Diese Methode ist auch geeignet, wenn DNA-Einsätze zu groß sind (e.g.,P. Mandapamensis 27561 LuxCDABFEG RibEBH; ~ -9 kb-Operon-Größe), über PCR verstärkt werden. Ein Lux Operon kann in mehrere überlappende Fragmente getrennt werden, dann in einem expressionsplasmid zusammengebaut werden und schließlich die Reihenfolge überprüft Montage Produkt kann direkt in eine entsprechende E. Coli umgewandelt werden-System für high-Yield Protein Ausdruck18,19,20. Neben der leicht zu handhaben E. Coli basierte Lux Genexpression blieb eine einfache Methode, die Aufnahme von Zellwachstum und biolumineszenten Lichtemission Kombination hergestellt werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die in Situ Messung und Korrelation der Zelldichte und Lichtemission von biolumineszenten Bakterien.
Die Analyse der Lux Gene und Lux Operon Ordnung und Regulation von verschiedenen biolumineszenten Bakterien mit, auf der einen Seite, eine künstliche Biolumineszenz E. Coli enthält das gesamte Lux-Rippe Operon von P. Mandapamensis 27561 und auf der anderen Seite, eine neu entwickelte Platte Leser Assay kombiniert die in Situ -Aufzeichnung der Zelldichte und Lichtemission, hilft, um weitere Informationen zu den verschiedenen bakteriellen Lux -Systemen zu gewinnen. Diese grundlegenden Charakterisierung und Vergleich von Luciferases und verwandte Enzyme führen zu Alternativen zu den bereits etablierten Reporter-Systemen mit verbesserter Stabilität und Aktivität.

<table><tbody><tr><td>NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>E2621S</td><td>for 10 rxn&lt;br/&gt; dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad</td></tr><tr><td>Phusion Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0721</td><td>for 50 rxn</td></tr><tr><td>Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI)</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3193S/R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>for 250 rxn</td></tr><tr><td>Monarch DNA Gel Extraction Kit&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>#T1020S</td><td>for 50 rxn</td></tr><tr><td>GeneJet Plasmid Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td>for 250 rxn</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>24-well black sensoplate with glass bottom</td><td>Greiner Bio One</td><td>662892</td><td></td></tr><tr><td>FLUOStar Omega plate reader&amp;nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMA/Mars Analysis Software</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Version 2.20</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2010</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard Incubator Shaker</td><td>Infors AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ measurement and correlation of cell density and light emission of bioluminescent bacteria

Es gibt eine beträchtliche Anzahl von Bakterienarten Licht emittieren. Sie alle teilen die gleiche gen-Cluster, nämlich die Lux Operon. Trotz dieser Ähnlichkeit zeigen diese Bakterien extreme Schwankungen in Eigenschaften wie wuchsverhalten, Intensität der Lichtemission oder Regulierung der Biolumineszenz. Die hier vorgestellte Methode ist ein neu entwickeltes Assay, der Aufnahme von Zellwachstum und biolumineszenten Lichtemission Intensität im Laufe der Zeit unter Verwendung eines Platte Lesers kombiniert. Die daraus resultierende Wachstum und Lichtemission Merkmale können auf wichtige Merkmale der jeweiligen Bakterienstamm, z. B. Quorum-sensing-Regelung verknüpft werden. Der Anbau einer Reihe von biolumineszenten Bakterien erfordert ein spezifisches Medium (z. B. künstliche Meer Wasser Medium) und definiert Temperaturen. Die einfach zu handhaben, nicht-biolumineszenten Standard-Forschung Bakterium Escherichia coli (E. Coli), können auf der anderen Seite kostengünstig in hohen Stückzahlen im Labormaßstab kultiviert werden. Nutzung von E. Coli durch die Einführung einer Plasmid enthält das gesamte Lux Operon Versuchsbedingungen zu vereinfachen und zusätzlich eröffnet viele Möglichkeiten für zukünftige Anwendungen. Der Ausdruck aller Lux Gene unter Verwendung einer E. Coli Ausdruck Belastung erzielte Bau ein expressionsplasmid über Gibson Klonen und Einfügung von vier Fragmente mit sieben Lux Gene und drei Rippe Gene die Lux-Rib -Operon in einen pET28a-Vektor. E. Coli basierte Lux Genexpression induziert und über Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) Addition führt Biolumineszenz E. Coli gesteuert werden kann Zellen. Die Vorteile dieses Systems sind zu vermeiden, Quorum-sensing-Verordnung Beschränkungen und komplexe mittlerer Kompositionen zusammen mit nicht standardmäßigen Wachstumsbedingungen, wie z. B. Temperaturen definiert. Dieses System ermöglicht die Analyse von Lux -Genen und deren Zusammenspiel, durch den Ausschluss des jeweiligen Gens aus der Lux Operon oder sogar Zugabe von neuartigen Genen, den Austausch der LuxAB Gene von einem Bakterienstamm durch ein anderes, oder Analyse von Protein-komplexe, z. B. LuxCDE.

Die Gen-Reihenfolge der Lux Operon - LuxCDABFEG - ist über verschiedene Stämme2,5,14hoch konserviert. Für die Gestaltung des Plasmids die sequenzinformation entstammt der Biolumineszenz Bakterienstamm Photobacterium Mandapamensis 27561 und seine gen-Reihenfolge blieb die gleiche, und Nichtkodierende Sequenzen zwischen einzelnen Genen wurden berücksichtigt. Ein schematischer Überblick über die angewandten Gibson Klonen Strategie ist in Abbildung 2dargestellt. Vier Fragmente insgesamt, LuxCDAB, LuxF, LuxEG, und RibEBH, mit 20-40 Basenpaare überlappende Sequenzen generiert wurden. Nach allen Schritten der Gibson Montage20, bestätigt DNA-Sequenzierung die korrekte Montage des Plasmids, einschließlich alle Fragmente. Die Vektorkarte von der Endmontage Produkt pET28a mit der Lux-Rib -Operon ist in Abbildung 3dargestellt. Ein wesentlicher Vorteil dieser modifizierten pET28a-Vektor ist die Nutzung von standardisierten E. Coli Wachstumsbedingungen und Induktion mit IPTG kontrolliert.
Zur Messung der Lichtemission von biolumineszenten Bakterien und die jeweiligen Zelldichte wurde eine Platte Leser basierte Methode entwickelt. Die Methode für die Platte Leser wurde generiert Einzelmessung Skripte für Intensität und Zelle Leuchtdichte kombiniert. Dieses neue Skript ermöglicht die Messung von OD650 und Lichtintensität alle 10 Minuten für einen Benutzer definierten Zeitrahmen, die hat die Generationszeit der Bakterien verwendet für die jeweilige Analyse (z. B. 10 h) angepasst werden. Die Messung der optischen Dichte erfolgte bei 650 nm zur Vermeidung von Interferenzen mit der Lichtemission. Als Beweis des Konzeptes und um die Gesundheit und die richtige wuchsverhalten der E. Coli Zellen zu gewährleisten wurden Referenzmessungen durchgeführt. In Abbildung 4 den Vergleich von E. Coli BL21 Zellen, E. Coli BL21 Zellen mit einem leeren pET28a-Vektor und E. Coli BL21 Zellen, in denen die pET28a-Vektor mit der Lux-Rib -Operon einfügen werden vorgestellt. Für die letztere Sorte wurde keine IPTG hinzugefügt, um die Lichtemission durch die Undichtigkeit des T7-Promotors zu analysieren. Alle drei Referenzmessungen zeigen eine sigmoidale Wachstumskurve mit drei Wachstumsphasen (Verzögerung, exponentielle und stationäre Phase). Nur die E. Coli BL21 Zellen der pET28a-Vektor mit dem Lux-Rippe Operon Insert Start Licht emittieren, aber im Gegensatz zu den Messungen mit dem Ausdruck durch Zugabe von IPTG und Licht induziert wird nach 30 min, die nicht induzierten Zellen emittiert erst nach ca. 5 h glänzen und zeigen eine viel niedrigere Lichtemission (ca. 4-fold) gegenüber dem induzierten System.
Abbildung 5 gibt einen Vergleich der Wachstumskurven und Lichtintensitäten von der Lux -Operon in E. Coli und der Biolumineszenz Bakterienstamm p. Mandapamensis 27561, entweder in LB-Medium oder in künstlichen See Wasser Medium zum Ausdruck gebracht, mit dem Roman hergestellt in Situ -Methode. Um diese Bakterien zu vergleichen, wurden die Messungen bei einer Inkubationstemperatur von 28 ° C. Diese Temperatur sinkt die Wachstumsrate des veränderten E. Coli Stamm in LB-Medium sowie künstliche Meer Wasser Medium, aber bei etwas niedrigeren Temperaturen Biolumineszenz Bakterienstämme sind von entscheidender Bedeutung. Dieser Temperatur-Abhängigkeit ist in Abbildung 5A, sichtbar, wie p. Mandapamensis 27561 eine viel höhere Zelldichte als E. Coli zeigt. Außerdem, während für E. Coli -Stämme, LB-Medium ermöglicht die Erzeugung von höhere Zelldichten für natürliche Biolumineszenz Bakterienstämme, künstlichen See Wasser Medium ist bevorzugte und wichtig für die Biolumineszenz. Die aufgezeichneten Zelldichten korrelieren mit der jeweiligen Lichtintensitäten, wie in Abbildung 5Bgezeigt. Bemerkenswert, die Biolumineszenz E. Coli Zellen erreichen ähnliche Licht Emission Maxima in beiden LB mittlere sowie künstliche Meer Wasser Medium, obwohl die höchsten Intensitäten zu unterschiedlichen Zeitpunkten aufgezeichnet wurden. Im Gegensatz zu dieser Beobachtung, p. Mandapamensis 27561 ist mit stark reduzierten Wachstumsraten in LB-Medium, aber die Bakterienzellen nicht emittieren Licht an alle (Abb. 5B). In künstlichen See Wasser Medium zeigt p. Mandapamensis 27561 maximal Lichtemission von ca. 1 x 104 zählt pro Sekunde, was fast ein Faktor von 200 niedriger als E. Coliist. Abbildung 5 C steht für relative leichte Einheiten, wo die Biolumineszenz durch die OD normalisiert ist. Diese Ergebnisse bestätigen, dass nicht nur die Einfügung von einem Plasmid Lux Operon in E. Coli erfolgreich und funktional enthält war, sondern auch, dass dies E. Coli geändert Stamm bildet eine interessante Alternative mit noch höheren Lichtaustritt Erträge und ohne Begrenzung der bakteriellen Biolumineszenz von Marina Bakterien, wie z. B. eine komplexe Meerwasser mittleren und niedrigeren Temperaturen.
Darüber hinaus wurde eine Langzeitmessung der E. Coli basierte Lux-Rippe Genexpression über 24 h durchgeführt, um die Langlebigkeit der Lichtemission (Abbildung 6) zu analysieren. Lichtemission für 19,5 h gedauert, viel länger als die Bakterienstämme (z. B. p. Mandapamensis 27561), wo eine allmähliche Abnahme wurde beobachtet, was zu sehr geringen Lichtabstrahlung nach 10 h.
Um die Einschränkungen des entwickelten Tests zu verdeutlichen, zeigt Abbildung 7 die Messergebnisse von drei Biolumineszenz Bakterienstämmen, nämlich Photobacterium Mandapamensis S1, Photobacterium Mandapamensis TH1 und Vibrio Harveyi 14126. Für die erste Sorte (S1) die Methode funktioniert sehr gut und zeigt eine maximale Biolumineszenz Intensität von fast 2 x 106. Für die anderen zwei Stämme (TH1 und 14126), die maximale Lichtstärke kann nicht bestimmt werden, da die Lichtintensität durch beide erzeugt die Nachweisgrenze des verwendeten Geräteeinstellungen überschritten. Der Gain-Wert definiert für die entwickelte Methode (Skript) für diese beiden Stämme war zu hoch eingestellt. Dennoch kann das Auftreten von Biolumineszenz Aktivität miteinander verglichen werden. P. Mandapamensis TH1 und p. Mandapamensis S1 starten scheint nach ca. 1 h und einem OD-650 -Wert von 0,1 - 0,2, beziehungsweise. Im Gegensatz dazu beginnt V. Harveyi 14126 emittieren Licht nach ca. 5,5 h bei einem OD-650 -Wert von 1,0. Die beobachteten Ausbruch der Lichtemission wird von einer exponentiellen Zunahme OD sowie Biolumineszenz begleitet. Es ist bekannt, dass Biolumineszenz von V. Harveyi 14126 Quorum-sensing-Regelung zu Grunde liegt und daher eine bestimmte Zelle Dichte ermöglicht die Aktivierung von Lux Operon, die in Abbildung 713deutlich zu beobachten ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass mit dieser neuartigen in Situ Platte-Leser-Test ist es möglich, schnell und einfach vergleichen biolumineszente Bakterien und auch grob definieren ein Regulationsmechanismus dieser Stämme durch die Bestimmung, ob ein Quorum-sensing-Regelung kann beobachtet oder nicht.
Abbildung 8 zeigt ein Beispiel für einen Ausdruck Kultur von E. Coli BL21 Zellen beherbergen die montierten pET28a Plasmid enthält die Lux Operon nach Induktion mit IPTG. Nach ca. 1 h nach Induktion beginnen die E. Coli -Zellen scheint mit einer blau-grünen Farbe. Abbildung 8 A zeigt dem E. Coli -Ausdruck Kultur in das Licht fotografiert und Abbildung 8B gibt die gleiche Kultur im Dunkeln. Abbildung 8 C zeigt eine Agarplatte der künstliche See Wasser Medium mit p. Mandapamensis S1 Glühen in der Dunkelheit in dem gleichen blau-grüne Farbe charakteristisch für bakteriellen Biolumineszenz.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig2v3.jpg"> Abbildung 2 : Schematische Darstellung der angewandten Gibson Klonen Strategie. Schritt (I): Überlappungen Primer (farbige Pfeile; ca. 20-40 Basenpaare überlappen) dienen. Überlappende Primer enthalten annealing Sequenzen bestehend aus der jeweiligen Region 5' und 3' ein Fragment und die jeweiligen 3' und 5' Region von dem angrenzenden Segment. Schritt (II): Die gestaltete Fragmente für die Montage werden über standard-PCR-Reaktionen erzeugt. Schritt (III): Der Ziel-Vektor wird durch Beschränkungsverdauung (z. B. NcoI, XhoI) linearisiert. Schritt (IV): Die DNA-Konzentrationen von alle Fragmente und der linearisierten Vektor müssen entschlossen, Konzentration für Gibson Montage (laut Protokoll des Herstellers) einzustellen. Schritt (V): Alle Fragmente und der linearisierten Vektor mit optimierten DNA-Konzentrationen mit der Gibson Montage master-Mix (T5 Exonuclease, DNA-Polymerase und DNA-Ligase) kombiniert werden und sind bei 50 ° C für 1 h inkubiert Schritt (VI): der Versammlung Produkt verwandelt Laut standard-Protokolle in eine geeignete E. Coli Stamm für die high-Yield-Plasmid-Replikation (z. B. E. Coli TOP10 oder XL-1). Schritt (VII): Überprüfen Sie die korrekte Montage des Plasmids, muss DNA-Sequenzierung des montierten Plasmids durchgeführt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig2v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig3v2.jpg"> Abbildung 3 : Vektorkarte von pET28a mit der Lux-Rippe Operon. Die Lux-Rib -Operon von p. Mandapamensis 27561 wird in die Site mit mehreren Klonen von pET28a in der ursprünglichen Reihenfolge gen (LuxCDABFEG-RibEBH) eingefügt. Restriktionsschnittstellen verwendet für das Klonen sind NcoI und XhoI. Fragmente für Gibson Versamlung der Operon verwendet werden LuxCDAB in Orange, LuxF grün, LuxEG in blau und RibEBH in Lavendel; Gene innerhalb eines Fragments werden als separates Feld angezeigt. Nichtkodierende Sequenzen zwischen jedes Gen die Operon gehören die angewandte Klonen Strategie. Die endgültige Plasmid Größe pET28a, enthält das gesamte Lux-Rib -Operon ist 14.625 Basenpaare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig4v2.jpg"> Abbildung 4 : Vergleich von Wachstumskurven und Lichtintensitäten Referenzstämme. Die OD bei 650 nm und die Biolumineszenz Intensität in zählt pro Sekunde gemessen wurden alle 10 min über 10 h bei 28 ° C. Alle Maße sind Mittelwerte von drei biologische Wiederholungen mit vier technischen repliziert. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. E. Coli BL21 Zellen (graue Quadrate), E. Coli BL21 Zellen mit einem leeren pET28a Vektor (graue Kreise) und E. Coli BL21 Zellen mit der pET28a-Vektor mit dem Lux-Rippe Operon Einsatz (Black Diamond) wurden analysiert, um korrektes Wachstum Verhalten unserer E. Coli -Zellen zu gewährleisten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig5v2.jpg"> Abbildung 5 : Vergleich der Wachstumskurven und Lichtintensitäten von Lux Operon ausgedrückt 27561 (Kreise) in LB-Medium (offene Symbole) oder künstliche Meer Wasser Medium (gefüllte Symbole) in E. Coli (Quadrate) und p. Mandapamensis . Alle Maße sind Mittelwerte von drei biologische Wiederholungen mit vier technischen repliziert. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. Alle Experimente wurden bei einer Inkubationstemperatur von 28 ° c durchgeführt. (A) optische Dichte (OD) Messungen bei 650 nm durchgeführt wurden alle 10 Minuten für 10 h. E. Coli Lux Operon Ausdruck (linken), p. Mandapamensis 27561 (Rechte Abbildung) in LB-Medium und künstlichen See Wasser Medium verglichen wird. Zelldichten richten sich bei 650 nm um Biolumineszenz-Störungen zu vermeiden. (B) Messung der Lichtintensität (Biolumineszenz [Grafen/s]) erfolgte alle 10 Minuten für 10 h. E. Coli Lux Operon Ausdruck (linken) p. Mandapamensis 27561 (Rechte Abbildung) in LB im Vergleich zu Mittel- und künstlichen See Wasser Medium. (C) Relative Licht-Intensität (RLU/OD) von der Lux -Operon in E. Coli (links) und p. Mandapamensis 27561 (Rechte Abbildung) ausgedrückt werden durch die Normalisierung der Biolumineszenz, Zelldichte bestimmt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig6v2.jpg"> Abbildung 6 : Vergleich der Wachstumskurven und Lichtintensitäten von E. Coli basierte Lux Genexpression für 24 h Die OD bei 650 nm und die Biolumineszenz Intensität in zählt pro Sekunde gemessen wurden alle 10 min über 24 h bei 28 ° C. Alle Maße sind Mittelwerte von drei biologische Wiederholungen mit vier technischen repliziert. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. Darüber hinaus sind die relative Lichtintensitäten (RLU/OD) wo Biolumineszenz von Zelldichte normalisiert ist vertreten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig7v2.jpg"> Abbildung 7 : Vergleich von biolumineszenten Bakterien, potenzielle Quorum-sensing-Regelung zu bewerten. Lichtaustritt und Zelldichte werden alle 10 Minuten für 10 h gemessen und stellen Mittelwerte von drei biologische Wiederholungen mit vier technischen repliziert. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. Messungen der Photobacterium Mandapamensis TH1 (schwarze Quadrate), Vibrio Harveyi 14126 (graue Kreise) und Photobacterium Mandapamensis S1 (graue Diamanten) waren im Vergleich zu anderen; (A) zeigt die optische Dichte (OD) bei 650 nm, (B) das Licht Intensität (Biolumineszenz [Grafen/s]) und (C) relative Lichtintensitäten (RLU/OD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig7v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig8.jpg"> Abbildung 8 : Biolumineszenz in flüssigen Medien und auf Agarplatten. (A) 5 L Flasche mit 2 L LB-Medium mit E. Coli BL21 Zellen mit dem Ausdruck der pET28a Lux Operon Plasmid in Licht fotografiert geimpft. (B) die gleiche Kultur wie in (A) im Dunkeln fotografiert. Bilder A und B wurden ca. 2 h nach Induktion der Expression. (C) künstliche Meer Wasser mittlerer Agarplatte mit gestreift Kultur von p. Mandapamensis S1 im Dunkeln fotografiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Biolumineszente Bakterien regulieren Licht Produktion durch eine Vielzahl von Mechanismen, wie z. B. Quorum sensing. Diese neuartige Methode ermöglicht die in Situ -Untersuchung von Biolumineszenz und die Korrelation der Lichtemission, Zelldichte. Eine künstliche Biolumineszenz Escherichia coli System ermöglicht die Charakterisierung des Lux -Operons, Lux Proteine und deren Zusammenspiel.

In Situ Messung und Korrelation der Zelldichte und Lichtemission von Biolumineszenten Bakterien

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

11.5K Aufrufe.  Graz University of Technology. Biolumineszente Bakterien regulieren Licht Produktion durch eine Vielzahl von Mechanismen, wie z. B. Quorum sensing. Diese neuartige Methode ermöglicht die in Situ -Untersuchung von Biolumineszenz und die Korrelation der Lichtemission, Zelldichte. Eine künstliche Biolumineszenz Escherichia coli System ermöglicht die Charakterisierung des Lux -Operons, Lux Proteine und deren Zusammenspiel.

Serie: In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Genetik

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminescent &#39;Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

Bioluminescent Bakterielle Imaging<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Biologie

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Autonom Bioluminescent Säugerzellen für die kontinuierliche und Echtzeit-Überwachung von Zytotoxizität

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Optimierung der menschlichen Darmenteroide für Studien zum zirkadianen Rhythmus

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

Autor im Rampenlicht: In vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

In Situ Messung und Korrelation der Zelldichte und Lichtemission von Biolumineszenten Bakterien

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

"Bioluminescent 'Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Bioluminescent Bakterielle Imaging

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Autonom Bioluminescent Säugerzellen für die kontinuierliche und Echtzeit-Überwachung von Zytotoxizität

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR)

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden