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Ein. Bau Lentivirale Luciferase Reporter Ein Säuger zirkadianen Reporterkonstrukt enthält üblicherweise eine Expressionskassette in dem eine circadiane Promotor mit dem Luciferase-Gen fusioniert ist. Sowohl Ligations-und Rekombinations-basierte Strategien werden üblicherweise für DNA-Klonierung verwendet. Als ein Beispiel beschreiben wir hier eine Rekombination basierende Gateway-Klonen Verfahren zur Erzeugung eines P (Per2)-d Luc-Reporter lentiviralen, in der die destabilisierte Luciferase (Luc d) unter Kontrolle des Maus Per2 Promotor. <ol><li> Klonierung Per2 Promotor. Verwenden, um die PCR Per2 Promotor DNA-Fragment von 526 bp amplifizieren, stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle aus einer Maus Per2 BAC-Klon 9-13, unter Verwendung eines Vorwärtsprimers (5&#39;-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 &#39;) und einen Rückwärts-Primer (5&#39; -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 &#39;) und Klon in pENTR5&#39;-TOPO-Vektor (Invitrogen) zu erzeugenpENTR5&#39;-P (Per2). </li><li> Klonierung von d Luc. Der d Luc enthält das Leuchtkäfer-Luciferase-Gen und eine C-terminale Sequenz für die schnelle PEST Proteinabbau, wie zuvor beschrieben 21. Verwenden, um die PCR-DNA-Fragment d Luc und Klon in pENTR / D-TOPO-Vektor (Invitrogen) zu amplifizieren pENTR / Dd Luc erzeugen. </li><li> Bau-Reporter-Vektor. Mischen Sie die beiden pENTR Plasmide, pENTR5&#39;-P (Per2) und pENTR / Dd Luc, mit dem lentiviralen Zielvektor pLV7-BSD (BSD, Blasticidin Resistenzgen), und führen Sie die Rekombination mit Clonase eine pLV7-BSD-P erzeugen (Per2)-d Luc Reporter (Abbildung 1). pLV7-BSD ist eine modifizierte Version (made in unserem Labor) der pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen), in dem die woodchuck Hepatitis-Virus post-Transkriptionsregulatorelements (WPRE) Sequenzen 22 wurden sofort nach dem Ausdruck ca eingesetzt<html> ssette die Genexpression zu erhöhen. </li></ol> 2. Produktion von Lentivirale Partikel Ein. Seed 293T-Zellen (Tag 1) <ol><li> Wachsen menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T-Zellen zu 90-100% Konfluenz in regelmäßigen DMEM mit 10% FBS und 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PSG) auf 10 cm Zellkulturschalen ergänzt. (Schnell wachsende Zellen mit niedrigen Durchgang Nummer sind entscheidend für die effiziente Transfektion.) </li><li> Vor dem Aussäen der Zellen für Transfektion Mantel 6-well Kulturplatten durch Zugabe von 1 ml 0,001% Poly-L-Lysin in PBS in jede Vertiefung und Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min. Absaugen und spülen einmal mit 1x PBS vor der Verwendung. </li><li> Dissoziieren 293T-Zellen mit Trypsin und Saatgut 0,75 x 10 6 Zellen auf jede Vertiefung der vorbeschichteten Platten mit 2 ml DMEM regelmäßigen. Swirl die Platten gründlich, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in jeder Vertiefung erhalten. Wachsen die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C über Nacht. </li></ol>tep &quot;&gt; 2. Transiente Transfektion Via Capo 4 / DNA Niederschlag (Tag 2) <ol><li> Beachten Sie die ausgesäten Zellen von Tag 1. Zelle erreichen sollte Zusammenfluss von 80-90%. </li><li> Bereiten Plasmidtransfektion Mischung in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 2 ug eines lentiviralen Reporter Plasmid-DNA (zB pLV7-P (Per2)-d Luc; Liu lab) und die 3 Verpackungsvektoren (1,3 pg Gag / Pol, 0,5 ug Rev und 0,7 ug VSVG; Invitrogen). Als Kontrolle für sowohl Transfektion und nachfolgende Infektion, wir normalerweise einen zusätzlichen gut in Transfektion für einen lentiviralen GFP-Expressionsvektor, pLV156-CMV-EGFP (Abbildung 1A), beherbergt, Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) unter der Kontrolle des CMV-Promotors wie zuvor beschrieben 20. </li><li> Fügen Sie 100 ul von 0,25 M CaCl 2 (verdünnt mit DNase / RNase-free ddH 2 O von 2,5 M Lager) mit dem Plasmid Mischung in Schritt 2 und gründlich mischen. Dann fügen Sie 100 ul 2x BBS-Lösung (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 6,95) und mischen Sie vorsichtig, aber gründlich. Inkubieren des DNA-Mischung bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Während des Wartens, absaugen Medium aus 293T-Zellen und wechseln Sie in 2 ml frisches Medium. Bringen Sie die Platte in den Inkubator für mindestens 10 min bis mittlere pH vor der Transfektion äquilibrieren. </li><li> Fügen Transfektion Mischung aus Schritt 3 bis 293T-Zellen Tropfen für Tropfen. Schwenken Sie die Platte vorsichtig und beobachten Partikelbildung unter dem Mikroskop. Inkubation bei 5% CO 2, 37 ° C über Nacht. (Fine Partikelbildung von CaPO 4 / DNA-Präzipitat ist entscheidend für eine effiziente Transfektion.) </li></ol> 3. Ernte Viruspartikel (Tage 3-4) <ol><li> Etwa 16 Stunden nach der Transfektion (Tag 3) Zu diesem Zeitpunkt Zellen sollten bis zu 100% Konfluenz absaugen Medium von Zellen und ersetzen mit 2 ml frischem regelmäßigen DMEM. Bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Am Tag 4 zu beurteilen Transfektionseffizienz durch Beobachtung EGFP-Expression in transfection Kontrollzellen (Transfektionseffizienz von 90-100% mit hoher EGFP-Expression ist ein zuverlässiger Indikator für eine gute virale prep.) </li><li> Sammeln des Mediums enthaltend sekretiert, infektiöse Viruspartikel. Zentrifuge bei&gt; 2.000 xg für 5 min, um das restliche 293T Zellen zu entfernen und sammeln das Virus enthaltende Überstand. Alternativ kann das Medium mit einer 0,45 um Membranfilter gelöscht. Die viralen Partikel sind bereit für den Einsatz in Infektion. </li></ol> 3. Infektion von Zellen 3T3 Ein. Seed 3T3-Zellen (Tag 3) Split und Saatgut entsprechende Anzahl (~ 12.000) von 3T3-Zellen auf einer 12-Well-Platte auf 20-30% Konfluenz am nächsten Tag erhalten. Bei 37 ° C über Nacht. 2. Infect 3T3-Zellen (Tag 4) <ol><li> Beachten Sie die ausgesäten Zellen. Konfluenz von 20-30% (unter 50%) ist für die Infektion gewünscht. </li><li> Hinzufügen Polybren in einer Endkonzentration von 5 pg / ml zu dem gesammelten Medium mit viralenTeilchen. Gut mischen durch Pipettieren. </li><li> Absaugen Medium von 3T3-Zellen und 1 ml der oben viralen Mischung pro Vertiefung. Bei 37 ° C über Nacht. (Polybrene verwendet wird, um Infektionen Effizienz zu verbessern, ist aber nicht unbedingt erforderlich. Wie es zu toxisch sein einigen Zellen wird vorheriger Prüfung empfohlen.) </li></ol> 3. Wählen infizierten Zellen (Tag 5 und höher) <ol><li> Vierundzwanzig Stunden nach der Infektion, absaugen Medium mit Virus-und Polybren aus infizierten Zellen, einmal zu waschen mit 1x PBS, und wechseln Sie in frischem Medium. Bei 37 ° C über Nacht zur Verwertung und Wachstum. </li><li> Wenn konfluent (in der Regel 1-2 Tage später), teilen die Zellen und bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Am folgenden Tag absaugen Medium von Zellen (&lt;50% Konfluenz gewünscht) und ersetzen Sie sie durch frisches Medium mit 10 ug / ml Blasticidin für stabil wählen transduzierten Zellen. (Blasticidin kill-Kurve muss empirisch für eine bestimmte Zelllinie bestimmt werden.) </li><li&gt;, um frisches Medium, welches Blasticidin alle 2-3 Tage für die kontinuierliche Auswahl der Antibiotika-resistenten Zellen Uhr Reporter (in der Regel 4-6 Tage insgesamt) ändern. </li></ol> 4. Biolumineszenz Aufzeichnung von Reporter Cells Ein. Seed-Reporter-Zellen Propagieren Blasticidin-resistente Reporter Zellen und aufgeteilt auf 35-mm-Kulturschalen. Bei 37 ° C bis zur Konfluenz. Wir in der Regel bereiten ≥ 3 Gerichte für jeden Reporter-Zelllinie unter jeder Bedingung für die circadiane Phänotypisierung. 2. Synchronisation und Änderung Aufzeichnungsträger <ol><li> Absaugen Medium von konfluenten Reporter Zellen, einmal zu waschen mit PBS, und ersetzen Sie sie durch DMEM mit 10 uM Forskolin (oder 200 nM Dexamethason). Bei 37 ° C für 1 Stunde, um die Zellen zu synchronisieren. (Alternativ können Zellen durch Temperaturzyklen 23 oder Serum Schock 24 synchronisiert.) </li><li> Während des Wartens, bereiten Rekordten Weg für 3T3-Zellen wie folgt: 1x DMEM (HyClone), das 10% FBS, 1x Pen / Strep / Gln, 1 pM Forskolin, 1 mM Luciferin, 25 mM HEPES, pH 7,4. Serum und Forskolin-Konzentration kann empirisch ermittelt werden. Für sehr dunklen Zellen kann Phenolrot-freies Medium verwendet werden. </li><li> Am Ende der Forskolin Behandlung absaugen Medium und ersetzen mit frisch zubereiteten Speichermedium. </li></ol> 3. Aufzeichnung der Biolumineszenz Reporterzellen <ol><li> Nach Mediumwechsel decken Kulturschalen mit 40 mm sterile Deckgläser und Dichtung an Ort und Stelle mit Vakuumfett um Verdunstung zu verhindern. </li><li> Legen Sie die Speisen auf den LumiCycle Luminometer, die innerhalb eines eingestellten Brutschrank bei 36 ° C ohne H 2 O oder CO 2 gehalten. </li><li> Starten Sie real-time Biolumineszenz Aufnahme. Wir in der Regel erfassen Rhythmen für 1 Woche, gefolgt von mittleren Wandel und kontinuierliche Aufzeichnung für eine zweite Woche (siehe Savelyev et al. Für Details) 25. (Für die Aufnahme von 96-wirll Platten, Synergy SL2 wurde als Aufnahmegerät verwendet, siehe Diskussion 1.1 für Details). </li></ol> 5. Datenanalyse und Präsentation Reporter Zellen zu erleichtern hochauflösende quantitative Lumineszenz Aufnahme von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung phänotypischen Auswirkungen auf circadiane Uhr-Funktion. Um circadianen Parameter einschließlich Phase Periodenlänge, Rhythmus Amplitude und Dämpfungsrate zu erhalten, verwenden wir die LumiCycle Analyse-Programm (Actimetrics) zu analysieren Biolumineszenz Daten 5,14. Kurz gesagt sind Rohdaten Basislinie taillierter ersten und Baseline-subtrahierten Daten werden an eine Sinuswelle, aus denen die Parameter bestimmt werden angebracht. Für Proben, die persistent Rhythmen, die Güte der Passung von&gt; 90% wird in der Regel erreicht zu zeigen. Aufgrund der hohen transienten Biolumineszenz nach Medium ändern, wir in der Regel auszuschließen den ersten Zyklus von Daten aus der Analyse. Für Präsentationen, wir in der Regel zeichnen Rohdaten (Biolumineszenz, counts / sec) gegen time (Tage). Wenn nötig, kann basisliniengetrennten subtrahierten Daten aufgetragen, um Amplitude und Phase zu vergleichen. 6. Repräsentative Ergebnisse Ein. Phase-spezifische circadiane Reporter Die circadiane Uhr auf einer biochemischen negativen Feedback-Mechanismus 1 basiert. Der Kern besteht aus Rückkopplungsschleife Transkriptionsaktivatoren BMAL1 und CLOCK, und Repressoren PERs und CRYS, die auf den zirkadianen E / E&#39;-Box Enhancerelemente wirken, um rhythmische Genexpression (mit Morgen Phase, z. B. Rev-erb α) zu erzeugen. Der Kern Schleife regelt und integriert mindestens zwei anderen zirkadianen cis-Elemente, die DBP/E4BP4 Bindeelements (D-Box, für Tage Phase, z. B. Per3) und dem ROR / REV-ERB Bindeelements (RRE; für Nachtphase, zB BMAL1) 17. Kombinatorische Regulierung von mehreren circadianen Elementen erzeugen können neuartige Zwischenphasen. Beispielsweise Cry1 Transkriptiontion wird von allen drei zirkadianen Elemente (dh E / E&#39;-Box und D-Kastenelemente im Promotor und RRES im ersten Intron des Gens Cry1), was zu dem unterscheidbaren Cry1 Abend-Zeitphase 13 vermittelt. Basierend auf diesen Mechanismen der Genregulation, erzeugten wir vier verschiedenen Reporter-Konstrukte: P (Per2)-d Luc und P (Cry1)-d Luc-Reporter, die sowohl E / E&#39;-Box und D-Boxenelemente in der regulatorischen Region 17, 26,27; P (Cry1) - Intron-d Luc darstellt kombinatorischen Regulierung durch alle drei Elemente (dh E / E&#39;-Box, D-Box, und RRE) 13,17; und P (BMAL1)-d Luc geregelten ausschließlich durch RRE 9,17,19,21. Wir führten diese Reportern in 3T3-Zellen, die zu erwartenden unterschiedlichen Phasen der Reporterexpression (Abbildung 2) zu erzeugen. 2. Gene knockdown mittels RNAi und pharmakologisch aktiviertve Verbindungen Wenn Transfektionseffizienz hoch ist, können synthetische siRNA transient in Zellen transfiziert werden, um knock down Genexpression. Wenn Transfektion technisch schwierig ist, kann ein Expressionsvektor sein shRNA stabil transduzierten in Zellen über lentiviralen Infektion, so daß shRNA von der Zelle produziert wird, um siRNA zur Gen Knockdown (KD) verarbeitet. Hier findet KD Wirkungen Cry1 und Cry2 Gene mittels siRNA in U2OS Zellen (3A) und shRNA in 3T3 Zellen unter Verwendung eines Gateway-pLL3.7 Expressionsvektor 9 (Abbildung 3B). Neben 3T3-Zellen wurde die U2OS Modell zu einem weiteren Takt herausragende zellulären Modell zuletzt deswegen, weil die wesentlichen Anforderungen für das Hochdurchsatz-Screening von kommerziell erhältlichen humanen siRNA-Bibliotheken (zB menschlichen Ursprungs, geeignet zur Erzeugung robuste zirkadiane Rhythmen, validiert Funktion erfüllt alle bekannten Uhren-Gene und zugänglich hocheffiziente Transfektion undquantitative Lumineszenz-Aufnahme). In beiden Zelltypen führte RNAi-vermittelte KD in clock Phänotypen konsistent mit früheren Maus-Knockout (KO) und zellulären KD Studien 5,10,11,28. Zum Beispiel, Cry1 KD verkürzt Periodenlänge und reduziert Rhythmus Persistenz, während Cry2 KD verlängert Zeitraum. Zusätzlich können ausgewählte kleine Moleküle zu pharmakologisch Target und perturb Proteinfunktion (3C) eingesetzt werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig1.jpg" /> Abbildung 1. Das Lentivirus-vermittelte Genliefersystem. (A) Schematische Darstellung von zwei lentiviralen P (Per2)-d Luc Reporter Vektoren und einer CMV-EGFP konstruieren. Nur der Bereich für die Integration in das Genom der Wirtszelle gezeigt ist. In beiden Reporter-Konstrukte, die Transkription von d Luc unter direkter Kontrolle des Per2 Promotor. In der pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc Vektor (reKombination-Klonen), erleichtert ein coexprimierten Blasticidin-Resistenzgen (BSD) Auswahl der infizierten Zellen. Im pLV156-P (Per2)-d Luc-Vektors (ligation-Klonen), wird EGFP Übersetzung durch eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) stromabwärts d Luc vermittelt, so dass für eine visuelle Beobachtung und FACS-Sortierung von infizierten Zellen. Zusätzlich ist ein SV40-Promotor / Terminator (P / T) als ein Isolator (siehe Diskussion 1.3) verwendet. In der CMV-EGFP Kontrollvektor ist EGFP-Expression unter der Kontrolle eines starken CMV-Promotors. (B) Fluoreszierende Bilder der transfizierten und infizierten GFP-exprimierenden Zellen. Normalerweise erreichen wir eine hohe Effizienz sowohl im transienten Transfektion von 293T-Zellen und in lentivirale Infektion von Zelllinien unseres Interesses, wie GFP-Expression in diesen Zellen angezeigt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src = &quot;/ files/ftp_upload/4234/4234fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2. Phase-spezifische Expression von Biolumineszenz Reportern in 3T3-Zellen Die lentiviralen Reportervektoren in diesem Experiment verwendet werden pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc, P (Cry1)-d Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, und P (BMAL1)-d Luc. Jedes Reporterkügelchen durch einen deutlichen Phase der Oszillation, wie durch die Pfeile angedeutet. Während die Per2 und Cry1 Promotoren Laufwerk peak Biolumineszenz am Morgen-Tag Phasen und der BMAL1 Promotors in der Nacht Phase kombinatorischen Regulierung durch die P (Cry1) - Intron beherbergen E-Box, verleiht D-Box und RRE Elementen Abend Phase peak Biolumineszenz . <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig3.jpg" /> Abbildung 3. Genetische und pharmakologische Störung des zirkadianen Biolumineszenz Rhythmen Reporter Zellen. (A) Auswirkungen von Cry1 und Cry2 knockdown von siRNAs auf zelluläre Rhythmen U2OS Reporter Zellen. Die LumiCycle Luminometer wurde für Biolumineszenz Aufnahme von Zellen in 35 mm-Schalen verwendet. Abbildung angepasst ist von Referenz Nr. 10, mit Genehmigung von Elsevier (2009). (B) Auswirkungen von Cry2 knockdown von shRNAs auf zelluläre Rhythmen 3T3 Reporter Zellen. A pLL3.7 Gateway-Vektor, der ein U6-shRNA-Kassette wurde für Cry2 Gen knockdown verwendet. shRNA2 hat einen besseren Wirkungsgrad als Knockdown shRNA1 wie durch Western-Blot-Analyse (Daten nicht gezeigt) bestimmt. Eine Synergie Luminometer wurde für Biolumineszenz Aufnahme von Zellen in einer 96-Well-Platte verwendet. Die Einstellungen für die Aufnahme sind wie folgt:. Inkubatortemperatur, 33 ° C; Integrationszeit, 15 sec; Intervallzeit, 30 min (C) Wirkung von Kleinmolekül-Inhibitoren auf celzellulären Rhythmen U2OS Reporter Zellen. Chir99021 und Roscovitin sind Inhibitoren gegen GSK-3 und CDK gerichtet sind. Die ViewLux System (Chir99021 Assay) und eine Tecan Luminometer (Roscovitine Assay) wurden für Biolumineszenz-Aufnahmen von Zellen in 384-Well-Platten verwendet. Abbildung von Referenz # 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, USA) angepasst. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Ein. Änderungen Aktuelle Protocol 1,1 Aufnahmegeräte und Durchsatz Überlegungen Wegen seiner kommerziellen Verfügbarkeit hat die LumiCycle (Actimetrics) werden die am häufigsten verwendeten automatisierten Luminometer Vorrichtung zur Echtzeit-Aufzeichnung 4,5,9,19,29-31. Die LumiCycle beschäftigt Photomultiplier (PMT) als Licht-Detektoren, die extrem hohe Empfindlichkeit und geringe Geräuschentwicklung 14 bereitzustellen, und deshalb ist b...

<table border="1"><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> HyClone </td><td> SH30243FS </td><td> Für regelmäßige Zellwachstum </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td> Für Luminometrie </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep / Gln (100x) </td><td> HyClone </td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Millipore </td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td> Forskolin </td><td> Sigma </td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td> Alle anderen Chemikalien </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Gewebekultur-Inkubator </td><td></td><td></td><td> 5% CO2 bei 37 ° C </td></tr><tr><td> Gewebekultur Haube </td><td></td><td></td><td> BSL-2 zertifiziert </td></tr><tr><td> Light &amp; Fluoreszenzmikroskop </td><td></td><td></td><td> Phasenkontrast optional </td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters

Bei Säugetieren sind viele Aspekte des Verhaltens und der Physiologie wie Schlaf-Wach-Zyklen und Leberstoffwechsel durch endogene circadiane Uhren (bewertet 1,2) geregelt. Die circadiane zeithaltenden System ist eine hierarchische Multi-Oszillator-Netzwerk, mit dem zentralen Takt im suprachiasmatischen Nukleus (SCN) zu synchronisieren und koordinieren extra-SCN und peripheren Uhren anderswo 1,2 liegt. Zellen sind die einzelnen Funktionseinheiten für die Erzeugung und Aufrechterhaltung der zirkadianen Rhythmen 3,4 und dieser Oszillatoren verschiedener Gewebetypen im Organismus teilen eine bemerkenswert ähnliche biochemische negativen Rückkopplungsmechanismus. Jedoch aufgrund von Wechselwirkungen an der neuronalen Netzwerk-Ebene im SCN und durch rhythmische, systemischer Cues am organismal Ebene werden Tagesrhythmus am organismal Ebene nicht notwendigerweise zellautonome 5-7. Im Vergleich zu herkömmlichen Studien der lokomotorischen Aktivität in vivo und ex vivo SCN Explantate, cell-basierte in vitro-Assays ermöglichen Entdeckung der Zell-autonome circadiane Mängeln 5,8. Strategisch sind zell-basierte Modelle mehr experimentell handhabbar zur phänotypischen Charakterisierung und schnelle Entdeckung der Grundtakt Mechanismen 5,8-13. Da zirkadianen Rhythmen dynamisch sind, sind Längs-Messungen mit hoher zeitlicher Auflösung benötigt, um Uhrfunktion beurteilen. In den letzten Jahren hat Echtzeit Biolumineszenz Aufnahme mit Leuchtkäfer-Luciferase als Reporter zu einer gebräuchlichen Methode zur Untersuchung Tagesrhythmus in Säugetieren 14,15, wie es für die Prüfung des Persistenz und Dynamik molekularer Rhythmen ermöglicht. Um Zell-autonome circadiane Rhythmen der Genexpression überwachen, können Luciferase Reporter in Zellen durch transiente Transfektion 13,16,17 oder stabile Transduktion 5,10,18,19 eingeführt werden. Hier beschreiben wir eine stabile Transduktion Protokoll unter Verwendung Lentivirus-vermittelte Gentransfer. Ter Lentivirales Vektorsystem ist den herkömmlichen Methoden wie transiente Transfektion und Keimbahntransmission wegen ihrer Effizienz und Vielseitigkeit: er ermöglicht die effiziente Bereitstellung und stabile Integration in das Wirtsgenom von beiden Teilen und nicht teilende Zellen 20. Sobald ein Reporter-Zelllinie hergestellt ist, kann die Dynamik der Uhr-Funktion durch Biolumineszenz-Aufnahme untersucht werden. Wir beschreiben zunächst die Erzeugung von P (Per2)-d Luc Reporter Linien, und dann vorliegenden Daten aus diesem und anderen circadianen Reportern. In diesen Assays werden 3T3 Mausfibroblasten und U2OS humanen Osteosarkomzellen als zelluläre Modelle verwendet. Wir diskutieren auch verschiedene Möglichkeiten der Verwendung dieser Uhrenmodelle in zirkadianen Studien. Hier beschriebenen Methoden können zu einer Vielzahl von Zelltypen, die zellulären und molekularen Grundlagen von circadianen Uhren studieren angewendet werden, und es kann nützlich sein bei der Bewältigung von Problemen in anderen biologischen Systemen.

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Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Circadiane Uhren funktionieren innerhalb einzelner Zellen, dh sie sind zellautonome. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Zell-autonome Uhrenmodelle mit nicht-invasiven, Luciferase-basierte Echtzeit-Biolumineszenz-Technologie. Reporter Zellen bereitzustellen gefügig, funktionales Modell für das Studium zirkadianen Biologie.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

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Biology

22.1K Aufrufe.  The University of Memphis. Circadiane Uhren funktionieren innerhalb einzelner Zellen, dh sie sind zellautonome. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Zell-autonome Uhrenmodelle mit nicht-invasiven, Luciferase-basierte Echtzeit-Biolumineszenz-Technologie. Reporter Zellen bereitzustellen gefügig, funktionales Modell für das Studium zirkadianen Biologie.

Serie: Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...