Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten, den menschlichen Malariaparasiten, sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Diese Standardmethoden können helfen, wichtige Fragen im Bereich der Malariaforschung zu beantworten, wie eine phänotypische Analyse von Wildtyp- und transgenen Nagetier-Malariaarten durchgeführt werden kann. Demonstrieren die Verfahren werden Absolventen Gozde Deveci und Ilknur Yilmaz aus meinem Labor.
Beginnen Sie mit dem schnellen Auftauen von Kryo konservierten gefrorenen Parasitenbeständen und verwenden Sie sofort eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Meter-Nadel ausgestattet ist, um mindestens zwei Spendermäuse pro Genotyp intraperitoneal mit etwa 200 Mikroliter Na- zu injizieren. 24 Stunden nach der Injektion, verwenden Sie eine 24 oder 26 Messgerät Nadel, um den Schwanz der ersten Maus zu stechen und das Bluttröpfchen auf einem Mikroskop-Dia zu sammeln. Verwenden Sie die kurze Kante einer anderen Folie, um das Blut schnell über die erste Folie zu schmieren.
Wenn das Blut vollständig getrocknet ist, fixieren Sie die Dias in 100%Methanol für mindestens eine Minute. Die festen Proben in Giemsa 10 bis 15 Minuten lang färben, gefolgt von einer einzigen oder doppelt destillierten Wasserwäsche. Wenn die Dias getrocknet sind, sehen Sie sich die Proben unter einem 100-fachen Objektiv und Öl-Eintauchen auf einem Lichtmikroskop an, um die Gesamtzahl der infizierten Erythrozyten pro Gitter zu zählen.
Zwei bis drei Tage nach der Infektion, sichern Sie eine anästhesierte Maus, in der die Parasitenmie zwischen 0,1 und 1% in der Supine-Position erreicht hat, und verwenden Sie Zangen, um die Haut in der Nähe der Basis des Brustbeins zu heben, um die Bildung eines Hautschnitts zu erleichtern. Ziehen Sie die Haut an der Stelle des Einschnitts auseinander, um das Zwerchfell und die Oberseite der Bauchhöhle freizulegen, und verwenden Sie die Zange, um die Basis des Brustkorbs zu halten, während Sie durch das Zwerchfell schneiden, um in die Brusthöhle zu gelangen. Stecken Sie den Brustkorb zurück, um das Herz freizulegen, und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit mindestens 20 Mikroliter Heparin und ausgestattet mit einer 26-Meter-Nadel, um das Herzgewebe sanft zu punktieren.
Ziehen Sie den Kolben langsam zurück, um etwa einen Milliliter Blut zu sammeln und geben Sie das Blut in ein Mikrozentrifugenrohr. Wenn das gesamte Blut geerntet ist, erwärmen Sie die Empfängermäuse unter einer roten Wärmelampe und laden Sie eine Insulinspritze, die mit einer 27-Meter-Nadel pro Empfänger ausgestattet ist, mit der entsprechenden Dosis Parasiten. Dann legen Sie den ersten Empfänger in einen Retrainer und injizieren Sie eine volle Dosis infizierter Erythrozyten in eine erweiterte Schwanzvene.
Für die Mückenfütterung lassen Sie erwachsene vier- bis sieben Tage alte weibliche Anopheles stephensi oder A.gambiae-Mücken, die acht bis zwölf Stunden aushungerten, um mehr als 15 Minuten von anästhesisierten infizierten Mäusen mit der höchsten Exflagellationsrate zu ernähren. Um die Anzahl der Oozystensporozoiten pro Mücke zu bestimmen, einschläfern Sie 20 bis 30 Mücken im Gefrierschrank für nicht weniger als 10 Minuten und verwenden Sie einen binokulären Sezierbereich und zwei 26 oder 27 Gauge-Nadeln, um die Mittelguts von Mücken auf einer Glasrutsche zu sezieren, die die entsprechende Dissektionslösung enthält. Um das Mittelgut zu sezieren, halten Sie zuerst den unteren Teil des Bauches an Ort und Stelle mit einer Nadel und schieben Sie den Thorax vorsichtig sehr leicht an der Kreuzung zwischen Bauch und Thorax in eine aufwärts gerichtete Richtung, bis er den Thorax trennt und ein weiß gefärbtes Mittelgut vom Thorax abhängend ausgesetzt wird.
Schneiden Sie nun das Mittelgut vom Speiseröhrenende mit der gleichen Nadel, die verwendet wurde, um den Thorax nach oben zu schieben und so das Midgut zu trennen und auszubreiten. Heben Sie das sezierte Mittelgut mit einer Nadel aus dem Seziermedium und übertragen Sie es in ein Mitrohr, das mit 200 Mikrolitern RPMI gefüllt ist. Wenn alle Midguts seziert und geerntet wurden, legen Sie das Rohr mit den Midguts für eine Minute bei 700 mal g in die Zentrifuge.
Dann mahlen Sie das geerntete Gewebe mit einem Stößel zweimal. 12 Mikroliter der verdünnten Gewebelösung auf ein Hemacytometer übertragen und das Hemacytometer bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren, damit sich der Inhalt absetzen kann. Bestimmen Sie dann die durchschnittliche Anzahl der Oozystensporozoiten auf einem Lichtmikroskop unter Phasenkontrast und einer 40-fachen Vergrößerung.
Um die Anzahl der Speicheldrüsensporozoiten pro Mücke zu bestimmen, frieren Sie zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Fütterung 50 bis 100 weibliche Mücken ein, wie gezeigt, und verwenden Sie ein Sezieren des Mikroskops und die Seite einer 26 oder 27 Gauge Nadel, um die Speicheldrüsen zu isolieren. Um Speicheldrüsen zu sezieren, halten Sie zuerst den Oberbauch oder Thorax mit der abgeschrägten Seite einer Nadel an Ort und Stelle und drücken Sie vorsichtig den Kopf sehr leicht und sehr kurze Drücke an der Kreuzung zwischen Kopf und Thorax in eine aufwärts gerichtete Richtung. Drücken Sie, bis der Kopf sorgfältig vom Thorax getrennt ist, ohne die glasige Speicheldrüse zu zerreißen.
Verwenden Sie eine kurze Glas Pasteur Pipette, um die sezierte Speicheldrüse aus dem Seziermedium zu heben und in ein 1,5 Milliliter Rohr zu legen. Wenn alle Speicheldrüsen seziert und geerntet wurden, legen Sie das Rohr mit den Drüsen für eine Minute bei 700 mal g in die Zentrifuge. Das geerntete Gewebe zweimal mit einem Stößel mahlen.
Dann bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl der Speicheldrüsensporozoiten wie zuvor getan. Transgene Reporter Malaria Parasiten entwickelt, um EGFP unter der Kontrolle eines starken und konstitutiven Promoter auszudrücken zeigen das Fluoreszenzsignal in Blutstadien, Ookinete, junge Oozysten auf Anopheles stephensi midguts, und in Sporozoiten aus den Speicheldrüsen von Anopheles stephensi Weibchen isoliert. Die Prozentualen Werte der Durchflusszytometrieparasiten entsprechen direkt den geschätzten Parasitenprozentsätzen, die durch die Überwachung von Giemsa-gefärbten dünnen Blutabstrichen ermittelt wurden, wie die Sättigkeit der letztgenannten Quantifizierungsmethode bestätigt.
Darüber hinaus hängt die Schätzung der Prozentsätze der einzelnen asexuellen und sexuellen Stadien von der morphologischen Bewertung der Erythrozyten ab, die nicht durch Durchflusszytometrie beurteilt werden können. Ein Vergleich der intraperitonealen und intravenösen Infektionswege zeigt eine statistisch signifikante Abnahme des Anteils der IP-infizierten Gruppe parasitemia im Vergleich zum Prozentsatz der IV-infizierten Gruppenparasitenämie während der ersten vier Infektionstage, der zeigt, dass der IV-Infektionsweg ein quantitativ genauerer Weg für Assays mit den Malariaparasiten-Blutstadien ist. Bemerkenswert ist, dass die Behandlung von Phenylhydrazin die Anzahl der Gametozyten signifikant erhöht, was die Rate der männlichen Gametenbildung erhöht, was wiederum die Befruchtungsrate und die Anzahl aller nachfolgenden Mückenstadien erhöht.
Es gibt eine Knappheit an standardisierten Methoden für die phänotypische Analyse von Nagetier-Malaria-Blutstadiumparasiten und deren Übertragung auf den Mückenvektor. Diese Methoden werden dazu beitragen, standardisierte und vereinfachte Protokolle für die Untersuchung dieser Krankheitserreger und ihrer Lebenszyklusstadien bereitzustellen.
