Diese methogenetics große Menge von 3D Hepatosphären von menschlichen pluripotentStammzellen mit den feinen Materialien und Zellen der Montage. Der Hauptfortschritt dieser Technik ist, dass es die Kontrolle der Größe der 3D-Leberkugeln, Begrenzung der Bildung von nekrotischen Zentren und Verlust von Phänotyp ermöglicht. Demonstriert das Verfahren mit mir wird Yu Wang, ein Post-Doktorat in unserem Labor sein.
Bereiten Sie sich darauf vor, Agaroseformen zu präsentieren, indem Sie zwei Gramm Niedrigschmelztemperatur-Agarose in 100 Milliliter sterilisiertes destilliertes Wasser auflösen. Die Mischung vorsichtig in der Mikrowelle mit Intervallschütteln erhitzen, um die Agarose vollständig aufzulösen. 520 Mikroliter der geschmolzenen Agarose zu einer 256-gut formatierten Form geben und erstarren lassen.
Dann übertragen Sie jede Agarose-Mikroplatte in einen einzigen Brunnen einer 12-Well-Platte. Fügen Sie 1,5 Milliliter DPBS mit Kalzium und Magnesium zu jedem Brunnen und Pipette nach oben und unten, um Blasen zu entfernen. Um die Zellsuspension vorzubereiten, beginnen Sie mit der Ansaugung des Mediums aus einer undifferenzierten Kultur menschlicher pluripotenter Stammzellen oder HPSCs.
Spülen Sie die Zellen, indem Sie fünf Milliliter Raumtemperatur DPBS, Kalzium oder Magnesium frei hinzufügen, und entfernen Sie dann den Puffer. Fügen Sie den Zellen fünf Milliliter Zelldissoziationsreagenz hinzu und brüten sie sechs bis acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Beobachten Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop und verlängern Sie die Inkubation bei Bedarf um weitere ein bis zwei Minuten.
Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie das Zelldissoziationsreagenz entfernen und fünf Milliliter frisches MT hinzufügen, das einem Medium serviert wird, das mit 10 mikromolarem Gesteinsinhibitor, Y27632, ergänzt wird. Pipette auf und ab mehrmals, um Zellen zu dissoziieren. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit dem Hämozytometer und Trypanblaufärbung, um die Gesamtzahl der benötigten Zellen zu berechnen.
Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen in ein steriles 15- oder 50-Milliliter-Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 200-fachem G für fünf Minuten, um die Zellen zu pellet. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in MT mit 10 mikromolaren Gesteinsinhibitoren für eine Endkonzentration von 2,1 Millionen Zellen pro Milliliter. Als nächstes retten Sie die Zellen, indem Sie 190 Mikroliter vorbereitete Zellsuspension pro Agarose Mikrobrunnen hinzufügen und die Agarose-Mikroplatten bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid für zwei Stunden inkubieren.
Nach der Inkubation je einen Milliliter frisches, warmes T-Serve-Medium mit Gesteinsinhibitor zu jedem Brunnen geben. Bringen Sie die Platten zum Inkubator zurück und lassen Sie sie dort für 24 Stunden. Am nächsten Tag die Sphäre der Bildung untersuchen.
Bereiten Sie Poly-zwei Hydroxyethylmethacrylat oder Poly-Hema-beschichtete Brunnen vor, indem Sie zwei Gramm Poly-Hema in 100 Milliliter 95%Ethanol auflösen und die Lösung über Nacht auf einer 55 Grad Celsius-Heißplatte rühren. Am nächsten Tag 250 Mikroliter der Lösung zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzufügen und die Platte über Nacht in einem 60 Grad Celsius Ofen trocknen. Initiieren Sie die Hepatozytendifferenzierung, indem Sie das MT sorgfältig aus den zuvor gesäten Zellen entfernen und durch einen Milliliter frisches Endoderm-Differenzierungsmedium ersetzen.
Für menschliche embryonale Stammzellen, erfrischen Medium alle 24 Stunden für drei Tage. Es ist wichtig, Hepatozytendifferenzierung 24 Stunden nach der Aussaat zu initiieren, um eine spontane Zelldifferenzierung zu vermeiden. Nach der endgültigen Endoderm-Induktion das Medium für fünf Tage auf Hepatoblast-Differenzierungsmedium umstellen.
Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage und führen Sie die letzte Änderung am letzten Tag der Hepatoblast-Spezifikation durch. Um die Hepatosphären in die vorbereiteten poly-hemabeschichteten Brunnen zu übertragen, waschen Sie die Zellen mit Hepatozytenreifungsmedium und fügen Sie dann einen Milliliter des Mediums hinzu, ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter HGF und 20 Nanogramm pro Milliliter OSM. Pipette die Lösung auf und ab mehrmals, um die Hepatosphären von der Agarose Mikroplatte zu heben und sie auf einen Poly-Hema beschichtet enthoben Brunnen übertragen.
Waschen Sie die Agarose-Mikroplatte mit einem Milliliter des ergänzten Hepatozytenreifungsmediums und übertragen Sie das Medium gut auf das Poly-Hema beschichtet. Mit einer P-100 Pipette, vorsichtig aspirieren überschüssiges Medium ohne Entfernung Hepatosphären, bis es etwa ein Milliliter Medium im Brunnen links. Erfrischen Sie das Medium alle 48 Stunden für 12 Tage.
Wenn Sie mit embryonalen Stammzellen arbeiten, schalten Sie das Medium auf Hepatozyten-Erhaltungsmedium an Tag 20, indem Sie das Reifungsmedium entfernen, die Zellen mit Pflegemedium waschen und dann einen Milliliter zusätzliches Pflegemedium hinzufügen. Danach alle 48 Stunden medienaktualisieren. Sofortige Änderungen müssen sorgfältig durchgeführt werden, um ernsthafte Belastungen und Verzerrungen dieser sphärischen Struktur zu vermeiden.
Die Färbung von Hepatozyten in mesenchymalen Markern schwelgt darin, dass die hepatosphärenförmig mit dieser Technik gebildeten Hepatosphären aus Hepatozyten-ähnlichen Zellen bestehen, die einen Kern mesenchymaler Zellen umgeben. Andere Proteine, die typischerweise in Hepatozyten exprimiert werden, finden sich ebenfalls auf der äußeren Schicht der Kugeln. Die funktionelle Analyse von Cytochrom-P450-Enzymen oder CYP in 30-tägigen Hepatosphärenkulturen zeigte, dass die 3D-Sphären im Vergleich zu menschlichen primären Hepatozyten respektable CYP-Aktivitätswerte aufweisen.
Darüber hinaus kann nachgewiesen werden, dass die Hepatosphären Leberproteine wie Albumin und Alfa-Fetoprotein absondern. Das Wichtigste, was man sich für dieses Protokoll merken sollte, ist, die Lösung mit 3D-Hepatosphären beim Übertragen in die polyhämabeschichtete Platte sanft nach oben und unten zu pipette. Dies hilft, sie nicht zu beschädigen.
Einmal gemeistert, ermöglicht diese Methode die Erzeugung von 3D-Leberkugeln, die über ein Jahr in-vitro mit mehreren Anwendungen in der Decease-Modellierung und dem Arzneimittelscreening funktionsfähig bleiben. Mit Blick auf die Zukunft könnte diese Technologie als Plattform zur Weiterentwicklung von entodermalen und mesenchymalen Geweben mit komplexen Architekturen eingesetzt werden.
