노화관련 질환에 유익한 것으로 나타난 세노테라피 화합물에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 허용하는 방법을 처음으로 설명하고 있습니다. 사실, 이 본질에서 시험된 약으로 몇몇 임상 시험은 현재 진행 중입니다. 이 기술의 주요 장점은 노화 세포에서 SA 베타-갈라콘토시다아제의 잘 확립된 검출을 사용하여 두 가지 유형의 혈청 치료 약물, 혈청술 및 분리제를 구별하는 것입니다.
이 기술은 새로운 senotherapeutic 화합물을 위한 중요한 검열 공구입니다. 사실, 이 화면의 도움으로 확인 된 여러 화합물은 다양 한 높은 프로필 간행물에 등장, 그리고 임상 시험에 현재. 이 기술은 매우 다재다능하며 여러 고처리량 화면에 적용 될 수 있습니다.
사실, 그것은 멀티 플렉스 스크린에 가능, 그리고 여러 경로 중 하나의 활성화 또는 억제를 통해 노화를 억제 하는 화합물에 대 한 화면. 각 배아를 1밀리미터 조각으로 다진 후 여러 번 위아래로 파이프를 넣습니다. 다음으로, 각 배아의 조직에 성장 매체의 10 밀리리터를 추가합니다.
10센티미터 배양 접시에 담아 2~3일 동안 37도의 산소와 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 그리고 10 분 동안 0.25 %의 트립신 EDTA 혼합물로 각 배아의 나머지 부분을 배양합니다. 세포를 트립시화하려면 먼저 성장 배지를 조심스럽게 제거하고 1X PBS의 10 밀리리터로 세포를 두 번 세척하십시오.
그런 다음 025 트립신 EDTA 용액의 2 밀리리터를 세포에 추가하고 섭씨 37도에서 2~3분 동안 배양합니다. 다음으로 현미경으로 세포를 검사하여 세포가 표면에서 분리되는지 확인합니다. 트립신 소화를 종료하고, 원추형 튜브로 세포를 전송하는 성장 배지의 동일한 양을 추가합니다.
그런 다음 세포를 3분 동안 200배 G로 원심분리합니다. 상체를 버리고 새로운 성장 배지를 추가하여 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 세포를 계산하고 투영된 세포 밀도에서 새 플레이트에 종자합니다.
비 노화 하위 재배를 위해, 첫째, 1 대 4 비율로 수렴 세포를 분할합니다. 그런 다음 3%의 산소와 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 세포를 배양하여 다른 통로를 확장합니다. 다음으로, 세포 노화를 유도하기 위하여는, 종자 분할 응수세포는 1-4의 비율로 통로에서 1에서 분할하고 3 일 동안 20%의 산소및 5% 이산화탄소 환경에서 섭씨 37도에서 배양합니다.
고급 쿨터 셀 카운터 시스템으로 세포 노화를 모니터링하려면 각 trypsinization 단계에서 세포 직경과 세포 부피가 점진적으로 증가하는 것을 측정합니다. 베타-갈 스크리닝 분석, 종자 5, 000 노화 세포 또는 3, 000 비 노화 세포당 96 웰 플레이트. 그런 다음 각 우물에 100 마이크로리터의 성장 배지를 추가하고 6시간 동안 섭씨 37도, 산소 20%, 이산화탄소 5%로 세포를 배양합니다.
다음으로, MEF 세포에 약물 희석을 추가하고 24~48시간 동안 20%의 산소와 5%의 이산화탄소로 37°C의 세포배양증을 한다. 인큐베이션 후, 1X PBS의 100 마이크로리터로 약물 용액을 제거하고 세포를 세척하십시오. 리소소피 알칼리화를 유도하기 위해, 100 나노몰라의 최종 농도에서 신선한 세포 배양 배지에서 희석된 90마이크로리터의 바필로마이신 A1 용액으로 세포를 미리 치료한다.
그런 다음, 세포가 섭씨 37도에서 산소 20% 및 이산화탄소 환경 5%에서 한 시간 동안 배양합니다. SA-베타-갈 활성의 형광 분석을 위해, 100 마이크로몰러의 최종 농도에서 성장 매체에서 희석된 C12FDG의 신선한 작업 용액을 만듭니다. 이어서, 10 마이크로몰라의 최종 농도에서 배양 배지에 10 마이크로리터를 추가하고, 2시간 동안 20%의 산소와 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 세포를 배양한다.
1X PBS의 100 마이크로리터로 셀을 세척합니다. 다음으로, 밀리리터 당 100 마이크로그램당 2개의 마이크로리터를 밀리리터당 2마이크로그램의 최종 농도에 첨가합니다. 세포는 섭씨 37도, 산소 20%, 이산화탄소 5%로 20분 간 배양합니다.
인큐베이션 후, 미디어를 제거하고, 신선한 성장 매체의 100 마이크로 리터를 추가하고, 이미징을 진행합니다. 본 연구에서는, 고함량 형광 화상 획득 및 분석 플랫폼은 17-DMAG와 같은 혈청약의 식별을 허용하여, 5번 통로에서 노화 세포를 포함하는 뮤린 배아 섬유아세포 배양에서 전체 SA-베타-갈 활동을 감소시켰습니다. 노쇠와 비 노화 세포의 혼합물의 소프트웨어 생성 정량 분석은 노화 세포 특이적 효과의 명확한 데모를 허용하고, bafilomycin A.에 의한 배경 베타 갈라토시다제 활성의 제거를 허용합니다.
이 에세이는 산화 스트레스하에서 1 차 세포와 함께 일하는 것을 포함하며, 이는 모니터링해야 하는 변이로 이어질 수 있습니다. 이 절차는 세노 치료제의 검출의 첫 번째 단계입니다. 추가 세포 생존력 및 세포 노화 에세이는 스크리닝 결과를 확인하기 위하여 능력을 발휘할 필요가 있습니다.
몇 가지 새로운 senolytic 약물이 에세이를 사용 하 여 검출 되었습니다., 첫 번째 senolytic 약물 조합 dasatinib quercetin를 포함 하 여, 열 충격 단백질 90 억제제, Bcl-2 가족 억제제, 그리고 폴리페놀 피세틴.
