Unser Multiparameter-Durchflusszytometrie-Protokoll ermöglicht einen schnellen und verbesserten Nachweis der therapieinduzierten Seneszenz in Tumorzellen, die eine Bedingung für laufende Studien in der Krebsbiologie und -therapie ist. Unser Durchflusszytometrie-Seneszenz-Assay ist schneller als bestehende mikroskopiebasierte Assays. Wir verwenden zwei Marker anstelle von nur einem, um alternde Zellen zu identifizieren und die Zuverlässigkeit des Assays zu verbessern.
Zellen können mit fluoreszierenden Antikörpern co-gefärbt werden, um zusätzliche Ziele von Interesse zu erkennen. Die Durchflusszytometrie-Sortierung kann verwendet werden, um Populationen von seneszenten Zellen für die nachgeschaltete Analyse anzureichern. Der Assay kann alternde Zellen in kultivierten Krebszelllinien oder in ganzen Tumorproben nach sanfter Dissoziation nachweisen.
Bevor Sie diese Technik ausprobieren, ist es wichtig, mit den allgemeinen Betriebsabläufen des verwendeten Durchflusszytometers vertraut zu sein. Bitte konsultieren Sie den Text für empfohlene Durchflusszytometer-Spezifikationen. Einen Tag vor der Seneszenzinduktion durch Medikamente ernten Sie die Krebszelllinienkultur mit 0,25% Trypsin EDTA.
Platzieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um Trypsin zu aktivieren, und lösen Sie die Zellmonoschicht. Wenn sich die Monoschicht sichtbar gelöst hat, neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie ein gleiches Volumen des vollständigen Kulturmediums hinzufügen. Die Zellsuspension wird in ein steriles konisches Röhrchen überführt.
Zählen Sie die Zellen mit der Standard-Hämozytometermethode und zeichnen Sie die Zellen pro Milliliter auf. Plattenzellen einmal 10 bis 10 mal 10 bis dritte Zellen pro Quadratzentimeter in einer Standard-Sechs-Well-Kunststoffkulturplatte. Die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und Feuchtigkeit inkubieren.
Am nächsten Tag behandeln Sie die Zellen mit dem Seneszenz-induzierenden Mittel von Interesse, wie Etoposid. Dann für vier Tage inkubieren, um den Beginn der Seneszenz zu ermöglichen. Untersuchen Sie die Zellen täglich unter einem Lichtmikroskop auf erwartete morphologische Veränderungen.
Nach Beginn der Seneszenz ernten Sie die Zellen durch Zugabe von Trypsin EDTA für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Wenn die Zellen in Suspension dissoziiert sind, neutralisieren Sie Trypsin mit einem gleichen Volumen des vollständigen Mediums. Jede Vertiefung der Zellsuspension wird in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Zählen Sie die Zellen erneut und aliquot eine gleiche Anzahl von Zellen pro Probe in einen neuen Satz Röhrchen. Die Röhrchen fünf Minuten lang bei 1.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand entfernen. Zuerst wird der lysosomale pH-Wert kultivierter Zellproben eingestellt, indem eine Lösung von einem mikromolaren Bafilomycin A in DMEM in einer Konzentration von einmal 10 bis sechster Zellen pro Milliliter zum Zellpellet gegeben und zum Mischen pipettiert wird.
30 Minuten bei 37 Grad Celsius auf einem Rotator mit langsamer Geschwindigkeit inkubieren. Um dann für Seneszenz-assoziierte Beta-Galactosidase zu färben, geben Sie DDAOG Stammlösung mit 10 Mikrogramm pro Milliliter zu den Proben ohne Waschen. Für 60 Minuten vor direktem Licht geschützt auf einen Rotator stellen.
Wie zuvor zentrifugieren Sie die Röhrchen, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter eiskaltem 0,5% BSA in PBS. Dann fügen Sie 300 Mikroliter verdünnte Calcein Violet 450 AM Lösung zu den gewaschenen Zellpellets hinzu. 15 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubieren.
Die Zellproben werden in durchflusszytometrische Instrumenten-kompatible Röhrchen überführt. Öffnen Sie in der Datenerfassungssoftware ein Violettkanalhistogramm und ein Punktdiagramm für einen weit roten Kanal im Vergleich zu einem grünen Kanal. Starten Sie die Zytometerdatenerfassung bei niedriger Aufnahmegeschwindigkeit und legen Sie die mit DDAOG gefärbten positiven Kontrollproben auf die Ansaugöffnung.
Beginnen Sie mit der Erfassung von Beispieldaten. Passen Sie die Kanalspannungen so an, dass mehr als 90% der Ereignisse in jedem Diagramm enthalten sind. Wenn alle Einstellungen optimal sind, zeichnen Sie 10.000 Ereignisse pro Stichprobe auf.
Legen Sie die mit DDAOG befleckten Fahrzeugkontrollproben auf die Ansaugöffnung. Starten Sie die Datenerfassung und zeichnen Sie 10.000 Ereignisse pro Stichprobe auf. Suchen Sie nach einem Anstieg der Autofluoreszenz oder AF und des DDAO-Galactosid-Signals im Vergleich zur Positivkontrolle.
Speichern Sie die Probendaten im fcs-Dateiformat und exportieren Sie die Dateien auf einen Arbeitsplatzrechner, der mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware ausgestattet ist. Laden Sie mithilfe der Zytometrie-Datenanalysesoftware die FCS-Datendateien für alle erfassten Proben. Um lebensfähige Zellen zu gattern, doppelklicken Sie zunächst auf die Beispieldaten für die reine Fahrzeugsteuerung, um ihr Datenfenster zu öffnen.
Visualisieren Sie die Daten als Violettkanalhistogramm. Die lebensfähigen Zellen, die mit CV 450 gefärbt wurden, basieren auf ihrer helleren Fluoreszenz als die toten Zellen. Zeichnen Sie ein Tor mit dem Einzeltorhistogramm-Werkzeug, um nur lebensfähige Zellen einzuschließen.
Nennen Sie das Tor Viable. Ziehen Sie dann das Viable Gate aus dem Probenlayoutfenster auf die anderen Zellproben, um das Gate gleichmäßig anzuwenden. Öffnen Sie das Fenster Layout.
Visualisieren Sie im Fenster Layout alle Samples als Violettkanalhistogramme. Stellen Sie sicher, dass Viable Cell Gating für alle Proben geeignet ist. Wenn nicht, passen Sie es nach Bedarf an.
Um alternde Zellen zu gattern, doppelklicken Sie auf die Gated Viable Cell-Daten, damit die Nur-Fahrzeug-Steuerung ihr Datenfenster öffnet. Visualisieren Sie dann die Daten als Punktdiagramm für den fernroten Kanal im Vergleich zum grünen Kanal. Zeichnen Sie ein Tor mit dem Rechteck-Gating-Werkzeug, um weniger als 5 % der DDAO-positiven und AF-positiven Zellen aus dem oberen rechten Quadranten einzubeziehen.
Visualisieren Sie alle lebensfähigen Proben als Far-Rot- versus Grünkanal-Punktdiagramme und beobachten Sie die Ergebnisse. Stellen Sie sicher, dass das Seneszenz-Gate auf allen Parzellen sichtbar ist und dass das Gate für die reinen Fahrzeugkontrollen weniger als 5% seneszente Zellen aufweist. Die Analyse ist nun abgeschlossen.
Daten können nun beliebig in Grafik- und Tabellenform exportiert werden. Im Vergleich zu unbehandelten Zellen zeigten seneszente B16-F10-Melanomzellen, die durch Etoposid induziert wurden, eine vergrößerte Morphologie und blaue Färbung aufgrund der Spaltung von X-gal durch erhöhte Seneszenz-assoziierte Beta-Galaktosidase. Die Färbung von mit Etoposid behandelten Zellen mit fluoreszierendem C12FDG oder DDAOG zeigte vergleichbare Färbemuster und Intensitätsvariationen wie X-gal.
Es wurde jedoch gezeigt, dass sich zelluläre Autofluoreszenz, die sich mit grüner C12FDG-Emission überlappt, in nicht gefärbten alternden Zellen ansammelt. Im Gegensatz dazu war die Autofluoreszenz im fernroten Emissionsbereich von DDAOG typischerweise vernachlässigbar. Der Aufbau von Durchflusszytometer-Datenerfassungen für Streudiagramme, kommerzielle Fünf-Peak-Regenbogenfluoreszenz-Kalibrierungsmikrosphären und Einkanal-Fluoreszenzdaten von gefärbten Zellen werden hier gezeigt.
DDAOG-Durchflusszytometer-Seneszenz-Assay-Daten für B16-F10-Melanomzellen zeigten, dass therapieinduzierte Seneszenz (TIS), induziert durch Etoposid, in 35% der lebensfähigen Zellen auftrat und das senolytische Mittel ABT-263 TIS-Zellen fast eliminierte. In A549-Lungenkrebszellen reduzierte Bleomycin-induziertes TIS in 66% der lebensfähigen Zellen und ABT-263 den Prozentsatz auf 15. ABT-263 allein war für unbehandelte proliferierende Zellen nicht toxisch.
In einem Antikörper-Co-Färbe-Assay zeigte ein Histogramm der PE-Kanaldaten, dass 42% der mit Etoposid behandelten Zellen positiv für den Seneszenzmarker DPPP4-positiv waren. Darüber hinaus zeigte die Visualisierung mit zweidimensionalen Punktdiagrammen, dass 44% der mit Etoposid behandelten Zellen doppelt positiv für DDAOG und DPP4 waren, verglichen mit 4% der reinen Vehikelzellen. Als nächstes wurde die Fixierung von DDAOG gefärbten Zellen untersucht.
Im Vergleich zu unfixierten Kontrollproben zeigten fixierte Proben einen etwas höheren Hintergrund in unbehandelten Zellen mit einem höheren Prozentsatz von Zellen, die in BLM-behandelten Zellen als seneszent bewertet wurden. Dieser Effekt wurde auch in festen Proben beobachtet, die über Nacht und eine Woche lang bei vier Grad Celsius gelagert wurden. Durchflusszytometrische Sortierung und Validierung von angereicherten seneszenten Zellpopulationen durch Morphologie und Proliferationsmarker werden gezeigt.
Sortierte seneszente Zellen zeigten wie erwartet eine vergrößerte Morphologie, visualisiert durch Färbung von Aktin mit fluoreszierendem Phalloidin. Eine Verringerung des Signals für den Proliferationsmarker Ki67 wurde auch durch Immunfluoreszenzfärbung beobachtet. Schließlich wurde die Quantifizierung der Seneszenz bei Tumoren, die mit Chemotherapeutika behandelt wurden, bewertet.
Die X-gal-Färbung in Geweben war relativ schwach, aber die blaue Färbung zeigte sich bei Tumoren, die mit Doxorubicin oder pegyliertem liposomalem Doxorubicin behandelt wurden, insbesondere bei Tumoren, die auch durch DDAO-Galactosid-Flow-Assay positiv für die Seneszenz bewertet wurden. Wie erwartet, zeigten reine Kochsalzlösungstumoren eine vernachlässigbare Seneszenz. Hier sollten, wie bei jedem Lebendzelltest, die Protokollschritte effizient, aber schonend durchgeführt werden.
Längere Färbevorgänge oder Inkubationen über die genannten Zeiten hinaus sollten vermieden werden. Wenn seneszente Zellen durchflusszytometrisch sortiert werden, können sie für Immunoassays wieder in Kultur gebracht oder lysiert und für die Omics-Analyse, einschließlich Transkriptomik oder Proteomik, verarbeitet werden. Diese Technik hat es unserem Labor und anderen ermöglicht, neue Merkmale von alternden Tumorzellen zu identifizieren, einschließlich der Quantifizierung von DNA-Schäden, Proteinexpression und Veränderungen im Stoffwechsel.
