Descriviamo qui per la prima volta un metodo che consente lo screening farmacologico ad alta produttività per i composti senoterapici che si sono dimostrati benefici nelle malattie legate all'invecchiamento. In effetti, diversi studi clinici con farmaci testati in questa essenza sono attualmente in corso. Il principale vantaggio di questa tecnica è distinguere tra due tipi di farmaci senoterapici, senolitici e senomorfi, utilizzando il ben consolidato rilevamento della SA-beta-Galattosidasi nelle cellule senescenti.
Questa tecnica è un importante strumento di screening per nuovi composti senoterapici. In effetti, diversi composti che sono stati identificati con l'aiuto di questo schermo sono presenti in varie pubblicazioni di alto profilo e sono attualmente in sperimentazione clinica. Questa tecnica è estremamente versatile e può essere adattata a diversi schermi ad alta produttività.
In effetti, è possibile schermi multiplex e schermo per composti che sopprimono la senescenza attraverso l'attivazione o l'inibizione di una delle diverse vie. Tritare ogni embrione in pezzi di un millimetro e condirlo su e giù più volte. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di mezzo di crescita ai tessuti di ogni embrione.
Placcarli in un piatto di coltura di 10 centimetri e incubarli a 37 gradi Celsius in ossigeno al 3% e 5% di anidride carbonica per due o tre giorni. E incubare il resto di ogni embrione con una miscela EDTA allo 0,25% di tripsideina per 10 minuti. Per tripinare le cellule, in primo luogo, rimuovere con cura il mezzo di crescita e lavare le cellule con 10 millilitri di 1X PBS due volte.
Quindi, aggiungere due millilitri di una soluzione EDTA di 025 tripina alle cellule e incubarli a 37 gradi Celsius per due o tre minuti. Quindi, ispezionare le cellule al microscopio per assicurarsi che le cellule siano staccate dalla superficie. Aggiungere la stessa quantità di mezzo di crescita per terminare la digestione della tripina e trasferire le cellule in un tubo conico.
Quindi, centrifugare le cellule a 200 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e aggiungere un nuovo mezzo di crescita per sospendere di nuovo le celle. Quindi, contare le cellule e seminarle in nuove piastre alla densità cellulare proiettata.
Per la subcoltivazione non senescente, in primo luogo, dividere le cellule confluenti con un rapporto uno-a-quattro. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius in 3% di ossigeno e 5% di anidride carbonica per estendersi per un altro passaggio. Successivamente, per indurre la senescenza cellulare, i semi dividono le cellule confluenti dal passaggio uno a un rapporto da uno a quattro e le incubano a 37 gradi Celsius nel 20% di ossigeno e al 5% di ambiente di anidride carbonica per tre giorni.
Per monitorare la senescenza cellulare, con un avanzato sistema Coulter Cell Counter, misurare il graduale aumento del diametro cellulare e del volume cellulare durante ogni fase di tripsicinazione. Per iniziare il test di screening beta-Gal, seminare 5.000 cellule senescenti o 3.000 cellule non senescenti per pozzo in 96 piastre di pozzo. Quindi, aggiungere 100 microlitri di mezzo di crescita a ciascun pozzo e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 20% di ossigeno e 5% di anidride carbonica per sei ore.
Successivamente, aggiungere diluizioni di farmaci alle cellule MEF e incubare le cellule a 37 gradi Celsius nel 20% di ossigeno e 5% di anidride carbonica per 24-48 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione farmacologica e lavare le cellule con 100 microlitri di 1X PBS. Per indurre l'alcalinizzazione lisosomiale, pre-trattare le cellule con 90 microlitri di soluzione di bafilomicina A1, diluite in mezzo di coltura cellulare fresca ad una concentrazione finale di 100 nanomolari.
Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius nel 20% di ossigeno e nel 5% di anidride carbonica per un'ora. Per l'analisi a fluorescenza dell'attività SA-beta-Gal, creare una nuova soluzione di lavoro di C12FDG diluito nel mezzo di crescita, ad una concentrazione finale di 100 micromolare. Quindi, aggiungere 10 microlitri della soluzione di lavoro al mezzo di coltura a una concentrazione finale di 10 micromolari e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in ossigeno al 20% e 5% di anidride carbonica per due ore.
Lavare le celle con 100 microlitri di 1X PBS. Successivamente, aggiungere due microlitri di un colorante Hoechst 33342 da 100 microgrammi per millilitro ad una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 20% ossigeno e 5% di anidride carbonica per 20 minuti.
Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto, aggiungere 100 microlitri di mezzo di crescita fresco e procedere all'imaging. In questo studio, una piattaforma di acquisizione e analisi di immagini fluorescenti ad alto contenuto ha permesso l'identificazione di farmaci senolitici, come 17-DMAG, che hanno ridotto le attività complessive sa-beta-Gal nelle colture cellulari di fibroblasti embrionali murini contenenti cellule senescenti nel passaggio cinque. Le analisi quantitative generate dal software di miscele di cellule senescenti e non senescenti consentono la chiara dimostrazione di effetti specifici delle cellule senescenti e l'eliminazione dell'attività beta-galattosidasi di fondo da parte della bafilomicina A.Assicurarsi che siano inclusi tutti i controlli cellulari necessari, in particolare le cellule senescenti non trattate e le cellule senescenti trattate con un controllo positivo.
Questo saggio include il lavoro con le cellule primarie sotto stress ossidativo, che può portare a variazioni che devono essere monitorate. Questa procedura è il primo passo nell'individuazione dei farmaci senoterapici. Ulteriori saggi di vitalità cellulare e senescenti cellulari devono essere eseguiti per confermare i risultati dello screening.
Diversi nuovi farmaci senolitici sono stati rilevati utilizzando questo saggio, tra cui la prima combinazione di farmaci senolitici dasatinib quercetina, inibitori della proteina shock termico 90, inibitori della famiglia Bcl-2 e il polifenolo fisetina.
