Die Studie wurde gefördert (F-q ausgezeichnet. Z.) von NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), Craig H. Neilsen Foundation und der BrightFocus-Stiftung.

Alle Tierversuche wurden gemäß dem tierischen Protokoll durch die Johns Hopkins institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt durchgeführt.
(1) Materialien und Reagenzien
<ol><li>
Tiere
	<ol>
<li>Verwenden Sie sechs Wochen alten weiblichen CF1 Mäuse mit einem Gewicht von 30 – 35 g für die Experimente. Hinweis: Die Mäuse waren Gruppe untergebracht (5 Mäusen pro Käfig) in individuell belüfteten sterilisierte Käfigen mit 1/4" Corn Cob Betten und 2" quadratischen Nestlets für den Nestbau. Die Käfige wurden in einem kontrollierten 12-h-Hell-Dunkel-Zyklus beibehalten und die Raumtemperatur war zwischen 19,4 ° C und 25 ° C. Die Mäuse wurden mit globale Nagetier Diät Wasser und automatische Lieferung System eingespeist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Instrumente
	<ol>
<li>Folgende chirurgische Instrumente nutzen, um effizient die Operation durchführen: Einwegspritzen (27 G, 1,0 mL) für die intraperitoneale Injektion, Pelz, Clipper, Stereo-Dissektion Mikroskop, Mikro-Chirurgie-Zange, Schere Mikro-Chirurgie und kleine Knochen Rongeurs und sterilisierte Vlies Schwämme. Hinweis: Alle Instrumente und Materialien sind vor der Operation autoklaviert oder vorsterilisierten von den Herstellern. Während der Operation werden die Instrumente mit 75 % Alkohol weiterhin die Sterilisation besprüht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Betäubende Lösungen
	<ol>
<li>Verwenden Sie Betäubungsmittel Lösung #1 zu induzieren die Narkose und Anästhesie Lösung #2 vor DRG Injektion verwenden, um die Narkose aufrechtzuerhalten.<ol>
<li>Um Betäubungsmittel Lösung #1 zu machen, Ketamin und Xylazin in steriler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 10 mg/mL und 1,2 mg/mL zu verdünnen.</li>
			<li>Um Betäubungsmittel Lösung #2, verdünnen Sie avertin in steriler Kochsalzlösung in einer Endkonzentration von 20 mg/mL.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmid DNA und RNS Oligos
	<ol>
<li>Bereiten Sie die Plasmide mit dem kommerziellen Kit des Herstellers Protokolle entsprechend nach. Verdünnen Sie das Plasmid DNA in sterilen deionisiertes Wasser auf die Konzentration von 2,0 µg/µL.</li>
		<li>Fügen Sie schnell grüne Farbstofflösung zur Erreichung eine Endkonzentration von 0,005-0,01 % (V/V) zur besseren Visualisierung der DRG Gliederung beim Einspritzen.</li>
		<li>Auflösen der SiRNA oder MicroRNA Oligos in entsprechenden Puffer zur Verfügung gestellt von Herstellern, eine Endkonzentration an 50 µM zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mikro-Injektion Pipette
	<ol>
<li>Ziehen Sie die Kapillare Glas Mikropipette Puller und schneiden Sie die Spitze der Kapillare gezogenem Glaspipette mit Mikrochirurgie Schere, eine Öffnung mit einem ungefähren Außendurchmesser 50 µm zu generieren. Dann Sterilisieren Sie die Glaspipette unter UV-Licht auf einer sauberen Werkbank für 20 – 30 min. ca..</li>
		<li>Berg der sterilisierten Glaspipette auf die Pipette Halter mit einer intrazellulären Mikroinjektion verbunden verzichten System. Legen Sie die Parameter des Systems der Mikroinjektion 30 PSI Druck und 8 ms Dauer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroporation System
	<ol>
<li>Schließen Sie die Elektroden an das Rechtecksignal Elektroporation System und legen Sie die folgenden Parameter: 15 ms Impulse bei 35 V mit 950 ms-Takt für in Vivo Elektroporation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Perfusion und Befestigung Lösung
	<ol>
<li>Lösen Sie das Paraformaldehyd (PFA) Pulver in 1 X PBS in einer Konzentration von 4 % (w/V). Die PFA-Lösung bei 4 ° c Lagern</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) experimentelle Verfahren
<ol><li>
Chirurgische Exposition von L4 und L5 DRGs
	<ol>
<li>Betäuben Sie die Maus über eine intraperitoneale Injektion von Betäubungsmittel Lösung #1 zuvor (mit Ketamin 100 mg/kg Körpergewicht und Xylazin 12 mg/kg Körpergewicht) zubereitet.</li>
		<li>Der OP-Bereich mit Fell Clipper zu rasieren. Hinweis: Da gibt es eine weitere Operation für linken Ischiasnerv Crush, kann das Fell am linken hinteren Oberschenkel gleichzeitig rasiert.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf die beheizte Decke (35,0 ° C) und überwachen Sie die rektale Temperatur mit einem Temperaturfühler.</li>
		<li>Um die Narkose zu testen, drücken Sie die Zehen und Tail der Maus und beobachten Sie die Verhaltensreaktionen.</li>
		<li>Kleben Sie die vier Gliedmaßen der Maus auf die Pinnwand.</li>
		<li>Wischen Sie den OP-Bereich mit jodophor Lösung und dann mit 75 % Alkohol, die jodophor vor dem Schneiden der Haut zu entfernen.</li>
		<li>Tragen Sie ophthalmologischen Salbe auf Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.</li>
		<li>Vor dem Schnitt markieren Sie beide Seiten der Beckenkamm Wappen mit einem feinen Filzstift. Zeichnen Sie eine Linie zwischen zwei Punkten der Beckenkamm Wappen zu erleichtern, die Positionen der L5 DRGs zu identifizieren.</li>
		<li>Machen Sie einen 3 cm Schnitt entlang der Mittellinie des unteren Rücken mit Mikro-Schere. Darüber hinaus lösen Sie die Paraspinous Muskeln, wie der Musculus Multiﬁdus und der Musculus Longissimus Lumborum von L3 bis S1 Dornfortsätze und setzen Sie der Facettengelenke der L4-5 und L5-6 aus.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Mikro-Rongeur, um der Facettengelenke der L4-5 und L5-6 zu entfernen. Darüber hinaus entfernen Sie Links neuralen Bogens von L4 und L5, die dorsale Seite der DRGs verfügbar zu machen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DRG-Injektion
	<ol>
<li>Injektion von Betäubungsmittel Lösung #2 (mit avertin 200 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal weiterhin die Betäubung vor der DRG-Injektion.</li>
		<li>Die Kapillare Glaspipette Plasmid DNA oder RNS Oligos (1 µL pro DRG) bestücken.</li>
		<li>Die Kapillare Glas PIPETTENSPITZE vorsichtig in die DRG einführen.</li>
		<li>1,0 µL Lösung von DNA Plasmide allmählich zu injizieren oder RNS Oligos in die DRG mit der intrazellulären Mikroinjektion verzichten Systeme (30 Psi, 8 ms). Hinweis: Die Dauer der Injektion sollte nicht weniger als 5 Minuten dauern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elektroporation
	<ol>
<li>Fallen Sie PBS auf Tipps der Elektroden.</li>
		<li>Bereinigen Sie die Blutung mit sterilisierten quadratische Baumwoll Gaze.</li>
		<li>Das Ziel DRG mit den Elektroden sanft Kneifen und 5 quadratische elektrische Impulse mit dem Elektroporation-System anwenden.</li>
		<li>Schließen Sie die Muskel und Haut Schichten jeweils mit 5: 0-Nylon-Fäden.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf einer beheizten Decke (35,0 ° C) unter Beachtung der engen, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen vollständig wiedererlangt hat. Die Maus zu Hause Käfig zurück, nachdem es vollständig von der Narkose erholt hat. Hinweis: Es dauert ca. 60 min. für die Maus aus der Narkose auf 37 ° C Decke vollständig erholen. Lösen Sie eine Tablette (200 mg) Ibuprofen in 1.000 ml Wasser (0,2 mg/ml) für die tägliche Fütterung um postoperative Schmerzen zu lindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ischiasnerv Crush
	<ol>
<li>Betäuben Sie zwei oder drei Tage (abhängig von den Versuchsplan) nach der DRG-Elektroporation, die Maus intraperitoneal mit Narkose Lösung #2 (mit avertin 400 mg/kg Körpergewicht).</li>
		<li>Kleben Sie die vier Gliedmaßen der Maus auf die Pinnwand.</li>
		<li>Machen Sie einen 1 cm Schnitt 0,5 cm auf der linken Seite entlang der Mittellinie. Geschnitten Sie die Muskeln, wie Musculus Muskel und Piriformis Muskel Längsrichtung. Setzen Sie das Segment des Nervus ischiadicus zwischen größeren sciatic Foramen und sciatic Kerbe.</li>
		<li>Crush der Nerv mit Mikrochirurgie Zangen für 12 s und Mark die Crush-Website mit einer 10-0 Nylon Epineural Naht. Machen Sie einen Knoten auf der duralen Membran anlässlich die Crush-Website.</li>
		<li>Schließen Sie die Muskel und Haut Schichten mit 5: 0-Nylon-Naht.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf einer beheizten Decke (35,0 ° C) mit großer Aufmerksamkeit, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen vollständig wiedererlangt hat. Die Maus zu Hause Käfig zurück, nachdem es vollständig von der Narkose erholt hat. Hinweis: Es dauert ca. 60 min. für die Maus aus der Narkose auf 37 ° C Decke vollständig erholen. Lösen Sie eine Tablette (200 mg) Ibuprofen in 1.000 ml Wasser (0,2 mg/ml) für die tägliche Fütterung um postoperative Schmerzen zu lindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maus-Perfusion, DRG und Ischiasnerv Ernte
	<ol>
<li>Zwei oder drei Tage nach der Ischiasnerv crush (abhängig von den experimentellen Design), die Maus intraperitoneal mit Narkose Lösung #2 zu betäuben.</li>
		<li>Durchspülen der Maus-Transcardially mit PBS (pH 7,4) gefolgt von eiskalten 4 % Paraformaldehyd (PFA) (pH 7,5) mit PBS-Puffer.</li>
		<li>Nach Perfusion trennen die DRGs zusammen mit den Nervenwurzeln und Ischiasnerv vor das Knie vorsichtig mit Mikro-Schere und Mikro-Pinzetten unter dem Mikroskop Dissektion. Legen Sie den Ischiasnerv direkt in 4 % PFA über Nacht bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imaging und Messung der Fluoreszenz-markierten sensorische Axone
	<ol>
<li>Die beigefügten Gewebe und Membran auf den festen Ischiasnerv mit Mikro-Schere und Mikro-Pinzetten sorgfältig unter dem Mikroskop Dissektion abzustreifen. Dann tauschen die 4 % PFA mit PBS und Waschen der Nerv drei Mal.</li>
		<li>Legen Sie den Ischiasnerv auf einer Folie und halten Sie gerade. Fügen Sie 80 µL antifade Lösung um den Nerv, dann legen Sie einem deckgläschen auf. Glätten Sie das ganze montierte Gewebe mit Druck.</li>
		<li>Das invertierte Epiﬂuorescent Mikroskop ausgestattet mit Zubehör für Mosaik-Akquisition und Bildverarbeitung legen Sie plattgewalzt Gewebe auf. Hinweis: Die Anregung und Emission Längen sind 488 nm und 509 nm. Es ist auch möglich, mehrere überlappende Bilder manuell und Nähen Sie die Bilder zusammen mit ImageJ mit dem Mosaik-Plug-in.</li>
		<li>Bei der Messung der Länge des regenerierten Axone verfolgen Sie alle identiﬁzierbare mit der Bezeichnung von ﬂuorescently Axone in den Ischiasnerv von der Crush-Website (gekennzeichnet mit dem 10-0-Epineural-Naht) an den distalen Axon enden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Saijilafu, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K-GSK3+signalling+regulates+mammalian+axon+regeneration+by+inducing+the+expression+of+Smad1.">PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1.</a> Nature Communications. 4, 2690 (2013).</li><li>Zhang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt-independent+GSK3+inactivation+downstream+of+PI3K+signaling+regulates+mammalian+axon+regeneration.">Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).</li><li>Jiang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+supports+mammalian+axon+regeneration+in+vivo+by+suppressing+GSK3beta+expression.">MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1865 (2015).</li><li>Krames, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+dorsal+root+ganglion+in+the+development+of+neuropathic+pain.">The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain.</a> Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).</li><li>Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+transfection+methods+optimized+for+gene+delivery+to+a+lung+cancer+cell+line.">Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).</li><li>Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-138+and+SIRT1+form+a+mutual+negative+feedback+loop+to+regulate+mammalian+axon+regeneration.">MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterolateral+intertransverse+lumbar+fusion+in+a+mouse+model:+surgical+anatomy+and+operative+technique.">Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique.</a> Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).</li><li>Dommisse, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+supply+of+the+spinal+cord.+A+critical+vascular+zone+in+spinal+surgery.">The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).</li><li>Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Systemic+Delivery+of+Synthetic+siRNAs+in+Adult+Mice.">Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mehrere chirurgische Schritte erfordern besondere Aufmerksamkeit. Die L4 und L5 DRGs (Lage des Somas), die den Ischiasnerv zu beherrschen, müssen korrekt erkannt und mit Genkonstrukte injiziert werden. Andernfalls werden die GFP-Kennzeichnung fehlt im Ischiasnerv Axone. Der Beckenkamm Wappen können als nützliche anatomischen Landmarken, L4 und L5 DRGs ermitteln angesehen werden. Bei den meisten Mäusen ist die Facette gemeinsame zwischen L5 und L6 Wirbeln proximate Beckenkamm Wappen12. Alternat...

Verletzungen des Nervensystems verursacht durch neuronale Trauma oder verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen führen in der Regel Mängel in motorischen, sensorischen und kognitiven Funktionen. Vor kurzem wurde viel Aufwand regenerative Potenz Wiedereinsetzung in den vorigen in Erwachsenen Neuronen zur Wiederherstellung der physiologischen Functionsof verletzte Nervenzellen1,2,3gewidmet. Sensorische Neuronen in der DRG sind eine Ansammlung von Nervenzellen, die verschiedene sensorische Reize wie Schmerz, Temperatur, Touch oder Körperhaltung, an das Gehirn vermitteln. Jedes dieser Neuronen ist Pseudo-unipolar und enthält ein einziges Axon, das mit einer Erweiterung in Richtung der Peripherie und der andere Zweig in Richtung Rückenmark4gabelt. Die Erwachsenen sensorischen Neuronen in DRGs gehören ein paar Reifen Säugetier-Neuronen bekannt, deren Axone aktiv nach Verletzungen zu regenerieren. Daher sind Verletzungen von sensorischen Axonen ausgiebig als entscheidende Modell eingesetzt worden, um die Mechanismen der axonalen Regeneration in Vivozu studieren.
In Vivo gen Transfection Techniken, die in der Regel weniger zeitaufwendig, einrichten und flexibler als die Verwendung von transgenen Tieren sind, spielen wichtige Rollen im Studium der Funktionen der Gene und Signalwege im Nervensystem. Die wichtigsten Techniken können kategorisiert werden, in zwei Ansätze: Instrument und Virus-basierte5. Viral-basierte in-Vivo -gen Lieferung in Erwachsenen Neuronen bieten präzise raumzeitlichen Manipulation der Gen-Expression-6. Arbeitsintensive Prozesse sind jedoch im viral-basierte Methoden wie die Produktion und Reinigung der Viruspartikel enthält das gewünschte gen beteiligt. Darüber hinaus könnten viele virale Vektoren das Immunsystem des Wirtes, aktivieren, die stören der Datenerfassung, Datenanalyse und die Interpretation der experimentellen Ergebnisse möglicherweise in die Irre führen kann. Elektroporation, ein typisches Instrument-basierte Transfektion Ansatz nutzt einen elektrischen Impuls erhöhen die Durchlässigkeit der Zell- und Kernmembran vorübergehend, der den Zustrom von Gen-Vektoren oder kleine RNS Oligos aus Raum außerhalb der Zellen7 begünstigt . In-vitro- Elektroporation ist weithin anerkannt als eine vorübergehende aber höchst effiziente Strategie für die Manipulation gezielt Genexpression in vielen Zelltypen. Obwohl nur mit geringer transfecting Effizienz im Vergleich zu viralen Vektoren in Vivo Elektroporation zu transiente Genexpression führt, hat verschiedene Vorteile gegenüber viralen Ansätzen. Zum Beispiel kann es auf fast allen Geweben und Zellen7,8,9angewendet werden. Darüber hinaus entweder Plasmide Kodierung Gene-of-Interest oder kleine RNS Oligos (z. B. SiRNAs, Micro-RNAs) gegen bestimmte Protokolle können direkt in das Zielgewebe injiziert und dann elektrisch gepulst, die machen des Verfahrens weniger Arbeit - und Zeit - Konsum. Darüber hinaus ist es möglich, mehrere Plasmide und RNS Oligos gleichzeitig mit einzelnen Electroporation transfecting.
Wir haben eine in Vivo Elektroporation Ansatz zur Genexpression in Erwachsenen Maus sensorischen Neuronen zu manipulieren und erfolgreich im Einsatz und Validierung solcher Ansatz in zahlreichen Pionier Studien1,2,3 ,8,10. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll um die Nutzung dieses Ansatzes für zukünftige Studien der Säugetier-Axon Regeneration zu erleichtern.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Square wave electroporation system</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; electroporation</td></tr><tr><td>Tweezertrodes electrodes</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0524</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; electroporation, 1 mm flat</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Instrumentation</td><td>1096</td><td>Intracellular Microinjection Dispense Systems</td></tr><tr><td>Glass Capillary Puller</td><td>NARISHIGE</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1902328</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Dissection Microscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgery Rongeur</td><td>F.S.T</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgery Forceps</td><td>FST by DUMONT, Switzerland</td><td>11255-20</td><td>Only for sciatic nerve crush</td></tr><tr><td>Glass Capillary</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-4</td><td>10 cm, standard wall</td></tr><tr><td>Tape</td><td>Fisherbrand</td><td>15-901-30</td><td>For fixing the mouse on the corkboard</td></tr><tr><td>2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin stock solution</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Avertin stock solution</td></tr><tr><td>siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIC003</td><td>Non-target siRNA with fluorescence</td></tr><tr><td>microRNA Mimic Transfection Control with Dy547</td><td>Dharmacon</td><td>CP-004500-01-05</td><td>Non-target microRNA with fluorescence</td></tr><tr><td>Plasmids preparation kit</td><td>Invitrogen Purelink</td><td>K210016</td><td>GFP-coding plasmid preparation</td></tr><tr><td>Fast Green Dye</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F7252</td><td>For better visualization of the DRG outline during injection</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-731-51</td><td>Anesthesia induction</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Anesthesia induction</td></tr><tr><td>Acetaminophen</td><td>McNeil Consumer Healthcare</td><td>NDC 50580-449-36</td><td>Post-surgical pain relief</td></tr></tbody></table>

investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion

Elektroporation ist eine wesentliche nicht-viralen Gen Transfektion Annäherung an DNA Plasmide oder kleinen RNA-Molekülen in Zellen bringen. Eine sensorische Neuron im Dorsal Root Ganglion (DRGs) erstreckt sich ein einziges Axon mit zwei Niederlassungen. Ein Zweig geht an die peripheren Nerven (periphere Zweig) und der andere Zweig tritt das Rückenmark durch den Dorsal Root (zentrale Niederlassung). Nach der neuronalen Verletzung regeneriert der peripheren Zweig robust während der zentralen Zweig nicht regenerieren. Aufgrund der hohen Regenerationsfähigkeit hat sensorische Axon Regeneration als Modellsystem verbreitet Säugetier-Axon Regeneration im peripheren Nervensystem (PNS) und das zentrale Nervensystem (ZNS) zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll über vorher festgelegten Ansatz zur Genexpression in Reife sensorischen Neuronen in Vivo über Elektroporation zu manipulieren. Basierend auf Transfektion mit Plasmide oder kleine RNS Oligos (SiRNAs oder Micro-RNAs), ermöglicht der Ansatz sowohl Verlust und Gewinn-of-Function-Experimente, die Rolle der Gene-of-Interests oder Micro-RNAs in Regulation der Axon Regeneration in Vivozu studieren. Darüber hinaus kann die Manipulation der Gene Expression in Vivo innerhalb einer relativ kurzen zeitlichen Verlauf sowohl räumlich als auch zeitlich gesteuert werden. Dieses Modellsystem bietet ein einzigartiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen mit denen Säugetier-Axon Regeneration regulierten in Vivoist.

Zur Quantifizierung der Zytotoxizität des aktuellen Protokolls und zu validieren, dass Transfektion in Vivo DRG Elektroporation ist hoch genug, wir injiziert und elektroporiert eindringmittel getaggt MicroRNA oder SiRNA in L4 und L5 DRGs. Die freistehende DRGs wurden durch Cryo-schneiden und Immunohistochemistry (Abbildung 1A-B) verarbeitet. Wenn die Zelle Überlebensrate nach Injektion und Elektroporation schätzen, waren die intak...

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Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Elektroporation ist eine effektive Annäherung an Genen Interessen in Zellen zu liefern. Durch die Anwendung dieses Ansatzes in Vivo auf die Neuronen des Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion (DRG), beschreiben wir ein Modell um Axon Regeneration in Vivozu untersuchen.

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

investigating-mammalian-axon-regeneration-vivo-electroporation-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

8.2K Aufrufe.  Johns Hopkins University School of Medicine. Elektroporation ist eine effektive Annäherung an Genen Interessen in Zellen zu liefern. Durch die Anwendung dieses Ansatzes in Vivo auf die Neuronen des Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion (DRG), beschreiben wir ein Modell um Axon Regeneration in Vivozu untersuchen.

Serie: Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medizin

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cokultur von Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons mit olfactory Ensheathing Glia, als In-Vitro-Modell der erwachsenen axonalen Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, neurons and Schwann cells engage in a complex interaction to control the myelination of axons. Disturbances of this interaction and breakdown of the myelin sheath are hallmarks of inflammatory neuropathies and occur secondarily in neurodegenerative disorders. Here, we present a coculture model of dorsal root ganglion explants and Schwann cells, which develops a robust myelination of peripheral axons to investigate the process of myelination in the peripheral nervous system, study axon-Schwann cell interactions, and evaluate the potential effects of therapeutic agents on each cell type separately. Methodologically, dorsal root ganglions of embryonic rats (E13.5) were harvested, dissociated from their surrounding tissue, and cultured as whole explants for 3 days. Schwann cells were isolated from 3-week-old adult rats, and sciatic nerves were enzymatically digested. The resulting Schwann cells were purified by magnetic-activated cell sorting and cultured under neuregulin and forskolin-enriched conditions. After 3 days of dorsal root ganglion explant culture, 30,000 Schwann cells were added to one dorsal root ganglion explant in a medium containing ascorbic acid. The first signs of myelination were detected on day 10 of coculture, through scattered signals for myelin basic protein in immunocytochemical staining. From day 14 onward, myelin sheaths were formed and propagated along the axons. Myelination can be quantified by myelin basic protein staining as a ratio of the myelination area and axon area, to account for the differences in axonal density. This model provides experimental opportunities to study various aspects of peripheral myelination in vitro, which is crucial for understanding the pathology of and possible treatment opportunities for demyelination and neurodegeneration in inflammatory and neurodegenerative diseases of the peripheral nervous system.

In the coculture system of dorsal root ganglia and Schwann cells, myelination of the peripheral nervous system can be studied. This model provides experimental opportunities to observe and quantify peripheral myelination and to study the effects of compounds of interest on the myelin sheath.

In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

Anreicherung von adulten Dorsalwurzelganglien-Neuronenkulturen der adulten Maus durch Immunpanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...