Weltweit verzögert sich die diagnosebedürftige Tuberkulose oft, da sie aufgrund einer unspezifischen klinischen Darstellung und einer schlechten Leistung bei diagnostischen Tests einen chirurgischen Eingriff zur Bestätigung erfordert. Um serologische diagnostische Tests für Mycobacterium tuberculosis Antigene zu verbessern, haben wir superparamagnetische Eisenoxid-Nanosonden zum Nachweis von extrapulmonaler Tuberkulose entwickelt. TB-SPIO-Nanosonden können aufgrund ihrer paramagnetischen Eigenschaften präzise Magnetresonanzbilder bei geringen Konzentrationen liefern, ohne eine Autoimmunreaktion zu induzieren.
TB-SPIO-Nanosonden ermöglichen die Ausrichtung und den Nachweis von Mycobacterium tuberculosis-Infektionen. Sie können auch als MRT-Kontrastmittel für die Erkennung anderer Krankheiten eingesetzt werden. Achten Sie darauf, das Protokoll sorgfältig zu studieren, bevor Sie das Protokoll versuchen, da jeder Teil des Experiments eine bestimmte Kerntechnologie verwendet.
Eine visuelle Veranschaulichung der Methode kann den Schülern helfen, zu verstehen, wie der Prozess implementiert werden kann, insbesondere bei einigen der komplizierteren Experimente. Zur Herstellung von dextranbeschichteten Eisenoxid-Magnet-Nanopartikeln kombinieren Sie kräftig fünf Milliliter Dextran T40 mit 45 Milligramm wässrigem Eisenchlorid-Hexahydrat und 32 Milligramm Eisenchlorid-Tetrahydratlösungen bei Raumtemperatur. Fügen Sie schnell 10 Milliliter Ammoniumhydroxid hinzu und verwenden Sie eine Rührstange, um die resultierende schwarze Suspension für eine Stunde bei Raumtemperatur zu rühren.
Zentrifugieren Sie am Ende der Rührinkubation die Lösung und entfernen Sie die Aggregate. Um die endgültigen SPIO-Produkte vom ungebundenen Dextran T40 zu trennen, laden Sie das gesamte Fünf-Milliliter-Reaktionsgemisch in eine 2,5 mal 33 Zentimeter große Gelfiltrationschromatographiesäule und legen sie den Dextran mit 0,1-Molaren Natriumacetat und 0,15-Molaren Natriumchlorid-Pufferlösung ab. Sammeln Sie dann die gereinigten dextranbeschichteten Eisenoxid-Magnet-Nanopartikel im Hohlraumvolumen und untersuchen die Säuleneluate für Eisen und Dextran bei 330 und 490 Nanometern nach Standardprotokollen.
Um SPIO-konjugierte Mycobacterium tuberculosis-Oberflächenantikörper zu erzeugen, synthetisieren Sie zunächst SPIO-EDBE-Succinic-Anhydrid, indem Sie 10 Milliliter einer alkalischen Lösung von SPIO-EBDE mit einem Gramm Bernsteinanhydrid für 24 Stunden bei Raumtemperatur mischen. Verwenden Sie am nächsten Tag 12.000 bis 4 000 Molekulargewichts-Cutoff-Molekularmembranschläuche, um die Lösung mit 26-stündigen Wechseln von zwei Litern destilliertem Wasser pro Wechsel zu dialysieren. Nach der letzten Änderung 100 Mikroliter der resultierenden Lösung zu 400 Mikrolitern von 4,5 Milligramm pro Milliliter TB Oberflächenantikörper hinzufügen, gefolgt von der Zugabe von 1-Hydroxybenzotriazol und Benzotriazol-1-yloxy tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphat als Katalysatoren bei Raumtemperatur für 24 Stunden unter Rühren.
Trennen Sie die Lösungen vom ungebundenen Antikörper durch Gelfiltrationschromatographie mit PBS als Puffer. Um die durchschnittliche Partikelgröße, Morphologie und Größenverteilung zu bestimmen, werfen Sie die zusammengesetzte Dispersion auf ein 200-Maschen-Kupfergitter und trocknen Sie die Probe bei Raumtemperatur, bevor Sie sie auf ein Transmissionselektronenmikroskop für die Bildgebung mit 100 Kilovolt laden. Um die Entspannungszeitwerte der Nanosonden zu messen, verwenden Sie ein Kernspinresonanz-Relaxometer bei 20 Megahertz und 37 Grad Celsius plus oder minus ein Grad.
Für die nanosondgepulste Zellbildgebung kultivieren sie zunächst menschliche THP-1-Monozyten nach Standard-Zellkulturprotokollen. Wenn die Zellen das entsprechende Stadium der Aktivierung erreicht haben, prokubieren Sie ein mal 10 zu den sieben Monozyten mit einem mal 10 bis zu den sechsten koloniebildenden Einheiten von Mycobacterium bovis BCG für eine Stunde. Am Ende der Inkubation übertragen Sie die Zellen in ein Milliliter-Mikrozentrifugenröhren und fügen Sie zwei Millimolar SPIO Mycobacterium tuberculosis Oberflächenantikörperkonjugatierte Nanosonden zu jeder Röhre für eine einstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid hinzu.
Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und die Pellets in 200 Mikroliter frischem Medium wieder aufsetzen. Scannen Sie dann die Proben mit einer schnellen Gradienten-Echopulssequenz durch 3,0-T-Magnetresonanztomographie, um die Spezifität und Empfindlichkeit der Nanosonden zu bestimmen. Um Versuchstiere mit M.bovis BCG zu impfen, rekonstituieren Sie zunächst den lyophilisierten Impfstoff oder den bakteriellen Bestand in Sautons Medium und verdünnen die rekonstituierte Stammlösung mit Salin.
Als nächstes 100 Mikroliter der Lösung in eine Ein-Milliliter-Spritze pro Tier laden und das gesamte Volumen der Bakterien in die linke oder rechte dorsale Skapulierhaut jeder Maus injizieren. Für die In-vivo-Magnetresonanztomographie von lebenden, mit Nanosonden injizierten Tieren aufnehmen Sie t2-gewichtete Schnelle-Spin-Echo-Bilder von jedem anästhesierten Versuchstier, bevor Sie zwei Nanomolar-SPIO-TB-Antikörpersonden in jizierten, die in 200 Mikroliter Saline in die Schwanzvene jeder Maus suspendiert sind. Dann stellen Sie die Tiere sofort nach der Injektion und alle fünf Minuten für die nächsten 30 Minuten wieder auf.
Am Ende der Bildgebungssitzung werden alle Magnetresonanzbilder quantitativ analysiert, indem die Signalintensität als Messung der definierten Interessenbereiche an vergleichbaren Stellen eines M.tuberculosis-Granulomomzentrums und des Ankerns neben einem Granulomatis-Bereich verwendet wird. Verwenden Sie dann die Formel, um die relativen Signalverbesserungen mithilfe der Signalintensitätsmessung vor und null bis drei Stunden nach der Injektion der Kontrastmittel zu berechnen. Einen Monat nach der Impfung das Gewebe von der intradermalen Impfstelle jedes Tieres sammeln und die formal infixierten paraffinfixierten fünf bis zehn Mikrometer dicken Gewebeproben mit Hämatoxylin und Eosin, Ziehl-Neelsen-Färbungen für säureschnelle Bakterien und Berlinblau für Eiseneisen färben.
Die Transmissionselektronenmikroskopie von SPIO-TB-Oberflächenantikörper-Nanosonden zeigt, dass die Nanosonden ein gut dispergiertes Erscheinungsbild mit einer durchschnittlichen Größe von 3,8 plus oder minus 0,4 Nanometern pro Kern aufweisen. M.bovis BCG und säurebeständiger Bakterienstamm können durch Ziehl-Neelsen-Färbung nachgewiesen werden. Nach Isolation und Kultur mit Sonden, die Eisen enthalten, können die Bakterien durch Berliner Blaufärbung identifiziert werden.
Der TB-Targeting-Grad von SPIO-TB-Oberflächenantikörper-Nanosonden kann durch T2-gewichtete Magnetresonanztomographie bestimmt werden, wie durch eine Abnahme der Signalintensität in Gegenwart der Nanosonden angezeigt wird, die in einer konzentrationsabhängigen Weise auftritt. Bei nanosonzinjizierten Tieren ist die T2-gewichtete Verbesserung der Signalreduktion in den M.tuberculosis granulomatis-Bereichen etwa 14-mal höher als die der Kontrollstellen. Einen Monat nach der Infektion kann ein organisiertes subkutanes Granulom bei nanosonzintinjizinjizierten C57 black 6 Mäusen mit neuer Blutvaskularisation und Lymphozyten- und Epithelioidenmakrophagenaggregaten beobachtet werden, die in diesen Läsionen festgestellt wurden.
Positive M.tuberculosis-Expression wird auch in den granulomatosen Bereichen mit säureschnellen Bacilli-Färbung positiv an der Läsionsstelle beobachtet. Berlin blue, ein eisenpositiver Fleck aus Eisen, kann auch verwendet werden, um die Empfindlichkeit der Sonden gegenüber TB zu bestimmen. Für das in vivo-Magnetresonanzbild des Lebens erhalten nanosonsoninjizierte Tiere ein T2-gewichtetes, schnelles Spin-Echo-Basisbild jedes anästhesierten Versuchstiers, bevor sie die SPIO-TB-Antikörpersonden injizieren. Nun, da wir die SOP-Technik zum Nachweis der extrapulmonalen Tuberkulose etabliert haben, können diese Antikörper zur gezielten Diagnose der extrapulmonalen Tuberkulose eingesetzt werden.
