전 세계적으로, 폐 결핵 진단은 비 특정 임상 프리젠 테이션 및 진단 시험에 나쁜 성과 때문에 확인을 위한 외과 적 내정간섭을 필요로 하기 때문에 수시로 연기됩니다. 진균 결핵 항원에 대한 혈청 학적 진단 테스트를 개선하기 위해, 우리는 폐 결핵을 검출하기위한 슈퍼 파라마그네틱 철 산화 나노 프로브를 개발했습니다. TB-SPIO 나노 프로브는 자가 면역 반응을 유도하지 않고 파라자성 특성으로 인해 낮은 농도에서 정확한 자기 공명 이미지를 제공할 수 있습니다.
TB-SPIO 나노 프로브는 진균 결핵 감염의 표적화 및 검출을 가능하게 합니다. 그(것)들은 또한 그밖 질병의 검출을 위한 MRI 조영제로 적용될 수 있습니다. 실험의 각 부분이 특정 핵심 기술을 활용하기 때문에 프로토콜을 시도하기 전에 프로토콜을 신중하게 연구해야 합니다.
이 방법을 시각적으로 보여 주면 학생이 프로세스를 구현하는 방법, 특히 복잡한 실험의 일부를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. dextran 코팅 된 철 산화물 마그네틱 나노 입자를 준비하기 위해, 적극적으로 45 밀리그램 수성 철염화물 헥사 하이드레이트와 45 밀리그램 수성 철염화 육수화물과 32 밀리그램의 철염화물 테트라 하이드레이트 솔루션과 dextran T40의 5 밀리리터를 실온에서 결합합니다. 수산화 암모늄 10 밀리리터를 빠르게 추가하고 교반 바를 사용하여 실온에서 1 시간 동안 검은 색 서스펜션을 저어줍니다.
교반 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리 하고 응고를 제거합니다. 최종 SPIO 제품을 언바운드 dextran T40과 분리하려면 전체 5밀리리터 반응 혼합물을 2.5~33센티미터 젤 여과 크로마토그래피 컬로 로드하고 아세테이트 나트륨0.1-mlar및 0.15-대구식 염화나트륨 완충액으로 덱테넨을 엘로테니다. 이어서, 정제된 디엑스트라넨 코팅된 산화수소 자기 나노입자를 공극 부피에서 수집하고 표준 프로토콜에 따라 330 및 490 나노미터에서 철및 디엑스트라넨을 위한 컬럼을 용액한다.
SPIO-컨쥬게이드 진코박테리움 결핵 표면 항체를 만들기 위해, 먼저 SPIO-EDBE-succinic anhydride를 실온에서 24시간 동안 1그램의 간결한 수화와 SPIO-EBDE의 알칼리성 용액 10 밀리리터를 혼합하여 합성합니다. 다음 날, 12, 000 ~ 4, 000 분자 량 차단 분자 다공성 멤브레인 튜브를 사용하여 변화당 증류수 2리터의 26시간 변경으로 용액을 투석합니다. 마지막 변화 후, 결과 용액의 100 마이크로리터를 밀리리터 TB 표면 항체당 4.5밀리그램의 400 마이크로리터에 추가하고, 그 다음으로 1-하이드록시벤조트리아졸과 벤조트리아졸-1일옥시 삼피라졸-1일옥시 트리피라디노포스포늄 육각형 헥사플루오로포스파테미테를 24시간 동안 촉매로 첨가한다.
PBS를 완충제로 사용하여 젤 여과 크로마토그래피를 통해 언바운드 항체로부터 용액을 분리한다. 평균 입자 크기, 형태 및 크기 분포를 결정하기 위해 복합 분산을 200 메쉬 구리 그리드에 드롭 캐스트하고 100킬로볼트에서 이미징을 위한 전송 전자 현미경에 적재하기 전에 실온에서 시료를 공기 건조시 로크캐스팅합니다. 나노 프로브의 이완 시간 값을 측정하려면 20 메가 헤르츠와 섭씨 37도 플러스 또는 마이너스 1도에서 핵 자기 공명 이완계를 사용합니다.
나노 프로브 펄스 세포 이미징의 경우, 먼저 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 인간 THP-1 단핵구를 육성한다. 세포가 활성화의 적절한 단계에 도달하면, 1 시간 동안 Mycobacterium bovis BCG의 여섯 번째 식민지 형성 단위에 1회 10으로 일곱 단색세포에 1회 10을 미리 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 1 밀리리터 미세 원심 심분리기 튜브로 세포를 전송하고 SPIO 진균 결핵 표면 항체 - 공해 나노 프로브의 2 밀리머를 각 튜브에 37 섭씨 및 5 %의 이산화탄소에서 1 시간 배양에 추가합니다.
인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 신선한 매체의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단. 이어서, 3.0-T 자기 공명 영상을 통해 빠른 그라데이션 에코 펄스 서열을 이용하여 샘플을 스캔하여 나노프로브의 특이성과 민감성을 결정한다. M.bovis BCG로 실험 동물을 접종하기 위해 먼저 Sauton의 배지에서 lyophilized 백신 또는 세균 재고를 재구성하고 재구성 된 재고 용액을 식염수로 희석시 희석시.
다음으로, 100 마이크로리터의 용액을 동물당 1밀리리터 주사기에 적재하고 각 마우스의 왼쪽 또는 오른쪽 등갈 에 박테리아의 전체 부피를 부수어 보입니다. 살아있는 나노 프로브 주입 동물의 생체 내 자기 공명 이미징의 경우, 각 마취 실험 동물의 기준선 T2 가중 빠른 스핀 에코 이미지를 획득한 후 SPIO-TB 항체 프로브의 2나노몰라를 각 마우스의 꼬리 정맥에 200 마이크로리터로 주입합니다. 그런 다음, 주사 직후와 다음 30 분 동안 5 분마다 동물을 다시 이미지.
이미징 세션의 끝에서, M.결핵 과립종 센터와 과립 에 인접한 후근육의 비교 위치에 대한 관심의 정의된 영역의 측정으로서 신호 강도를 사용하여 모든 자기 공명 이미지를 정량적으로 분석한다. 이어서, 조영제의 주입 후 0~3시간 전에 신호 강도 측정을 사용하여 상대신호 향상을 계산한다. 접종 한 달 후, 각 동물의 상인말 접종 부위에서 조직을 수집하고 헤마톡시린과 에오신을 함유한 5~10마이크로미터 두께의 조직 샘플을 파랭에 고정한 파라핀을 염색하고, 산속이 빠른 박테리아를 위한 지엘-네센 얼룩, 그리고 페리 철을 위한 베를린 블루를 더럽힙시다.
SPIO-TB 표면 항체 나노 프로브의 전송 전자 현미경 이미징은 나노 프로브가 코어당 평균 크기 3.8 플러스 또는 마이너스 0.4 나노미터의 잘 분산된 외관을 나타낸다는 것을 알 수 있습니다. M.bovis BCG 및 산 빠른 세균균 균주는 Ziehl-Neelsen 염색을 통해 검출될 수 있습니다. 철분이 함유된 프로브로 격리되고 배양한 후, 박테리아는 베를린 블루 스테인링을 통해 확인할 수 있습니다.
SPIO-TB 표면 항체 나노프로브의 TB 표적화 정도는 농도 의존적인 방식으로 발생하는 나노프로브의 존재 시신호 강도의 감소로 나타난 바와 같이 T2 가중 자기 공명 영상을 통해 결정될 수 있다. 나노 프로브 주입 동물에서, M.tuberculosis 과립 영역에서 신호 감소의 T2 가중 향상은 대조군 사이트의 약 14 배 높은. 감염 후 한 달, 조직피성 과립종은 나노 프로브 주입 C57 블랙 6 마우스에서 관찰 될 수있다 새로운 혈액 혈관과 림프구및 상피 대식체 집계이러한 병변 내에서 지적.
양성 M.결핵 발현은 또한 병변 부위에서 양성으로 염색하는 산빠른 바실리를 가진 과립종 영역에서도 관찰된다. 베를린 블루, 철 양성 얼룩, 또한 결핵에 프로브의 감도를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 생체 내 자기 공명 영상의 경우, 나노프로브 주입동물들은 SPIO-TB 항체 프로브를 주입하기 전에 각 마취 실험 동물의 기준선 T2 가중치 빠른 스핀 에코 이미지를 획득한다. 이제 우리는 폐 결핵을 검출하기 위하여 SOP 기술을 설치했습니다, 이 항체는 특히 폐 결핵을 진단하기 위하여 이용될 수 있습니다.
