Diese Methode kann helfen, schlüsselwichtige Fragen auf dem Gebiet der Alzheimer-Krankheit Forschung zu beantworten, vor allem die frühen Ereignisse in Wachstumskegel kollabieren beteiligt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, es möglich zu machen, axonale Wachstumskegel unmittelbar nach der Amyloid-Beta-Behandlung zu visualisieren und zu analysieren. Beginnen Sie mit Mikroscheren, um frisch isolierte Hirnkortika von embryonalen Tag-14-Mäusen im Neuronenkulturmedium ohne Antibiotika zu hacken.
Sammeln Sie das Gewebe und Zentrifuge das Gewebe bei 87G für drei Minuten. Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand und fügen Sie dem Pellet zwei Milliliter 0,05% Trypsin hinzu. 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und alle fünf Minuten mischen.
Nach 15 Minuten vier Milliliter Medium A hinzufügen, um das Trypsin zu neutralisieren, und durch Tippen mischen. Dann zentrifugieren Sie das Gewebe bei 178 mal G für drei Minuten. Nach dem Entfernen des Überstandes, fügen Sie DNAse und Soja-Trypsin-Hemmer-Lösung und inkubieren für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius mit Mischen alle fünf Minuten wie zuvor.
Wenn die Inkubationszeit verstrichen ist, fügen Sie wie bisher vier Milliliter mittlerer A.Mix und Zentrifuge hinzu. Nach dem Entfernen des Überstandes vier Milliliter Medium A hinzufügen und das Gewebe mit einer polierten Pasteurpipette trituieren, bis kein Schmutz beobachtet wird. Als nächstes filtern Sie die trituierten Gewebe mit 70-Mikron Poren-großen Netz.
Zählen Sie nach der Filtration die Zellen mit einem Hämozytometer und berechnen Sie die Zelldichte. Pipette 0,8 mal 10 zu den vierten Zellen im Medium A in jeden Brunnen einer Acht-Well-Kulturrutsche. Dann in einer befeuchteten Atmosphäre von 10% CO2 bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nach vier Stunden Kultivierung, ändern Sie die Kultur Medium zu Medium B.Die Reinheit der Neuronen mit dieser Methode ist etwa 75%Begin diesen Assay mindestens eine Woche im Voraus durch Öffnen einer frischen Durchstechflasche von kommerziell erhaltenen vollwertigen A beta 42 und Auflösung des Inhalts in sterilem, destilliertem Wasser in einer Konzentration von 0,5 Millimolar. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius für sieben Tage, um Aggregation und Toxizität zu induzieren. Bereiten Sie Aliquots der aggregierten A Beta 1-42 vor und speichern Sie bei minus 80 Grad Celsius bis zum Gebrauch.
Behandeln Sie die Brunnen am vierten Tag der neuronalen Kultur eine Stunde lang mit 100 Mikrolitern 0,5 Mikromolar aggregiert A beta 1-42 oder Fahrzeuglösung in Medium B, wie zuvor gezeigt. Nach Ablauf der Stunde entfernen Sie das Kulturmedium und fixieren Sie die Neuronen sofort mit 4% Paraformaldehyd, das 4%Saccharose in PBS enthält, für eine Stunde bei 37 Grad Celsius auf einer Kochplatte. Fixierung ist am wichtigsten, da die Aufrechterhaltung der Form von Wachstumskegeln für dieses Protokoll entscheidend ist.
Nach der Fixierung die Neuronen dreimal mit PBS waschen. Dann nach dem Entfernen der Kammer, montieren Sie die Neuronen mit einem wässrigen Montagemedium. Trocknen Sie das Montagemedium bei vier Grad Celsius für zwei bis vier Tage.
Erfassen Sie den gesamten Bereich jedes Brunnens mit einer 20-fachen trockenen Objektivlinse auf einem invertierten Mikroskop. Die Erfassung und Analyse des gesamten Bereichs in jedem Brunnen ist wichtig, um Subjektivität zu vermeiden. Klassifizieren Sie die längsten Neuriten jedes Neurons im Stadium 3 oder 4 als Axone.
Axonale Wachstumskegel ohne Lamellipodie oder mit weniger als drei Filopodia gelten als kollabierte Wachstumskegel. Eine Beta 1-42 Oligomere, hier vor der Inkubation gezeigt, aggregieren nach sieben Tagen Inkubation bei 37 Grad Celsius. Nach der Behandlung mit aggregierten A beta 1-42 zeigt die Immunfärbung mit einem Antikörper für das toxische Oligomer von A beta eine positive Färbung in Rot auf A beta 1-42 behandelten Neuronen, aber nicht mit Fahrzeugen behandelte Neuronen.
Die frühen Phänomene, die durch eine Beta-1-42-Behandlung induziert wurden, wurden nach vier Tagen in der Kultur analysiert. Identifizierte Axone wurden als solche durch positive Immunfärbung für den axonalen Marker Tau-1 bestätigt, der in roter und negativer Immunostainierung für den dendritischen Marker MAP-2, grün dargestellt ist, gezeigt wurde. Nach einer Stunde Fahrzeugbehandlung hatten Wachstumskegel Lamellipodie und mehrere Filopodia ausgebreitet.
Diese wurden als gesunde Wachstumskegel identifiziert. Umgekehrt führte eine Stunde A Beta 1-42 Behandlung zu geschrumpften Wachstumskegeln, die keine Lamellipodie oder Filopodia entwickelten. Diese wurden als zusammengebrochene Wachstumskegel identifiziert.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen mit 4%PFA und 4%Saccharose bei 37 Grad Celsius zu fixieren, um dieses Fixierungsprotokoll am besten zu machen. Nach diesem Protokoll können andere Methoden wie Live-Zell-Bildgebung und Gentransfektion durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie das Wann und wie die Axon-Wachstumskegel zusammenbrechen und wie die zusammengebrochenen Wachstumskegel zurückgewonnen werden.
