MUB40 ist ein neuartiger Neutrophiler Marker, der an Lactoferrin bindet und einen spezifischen Nachweis in menschlichen und allen bisher getesteten Säugetiergewebeproben ermöglicht. Die Etikettierung von Neutrophilen mit MUB40 ist einfach, schnell und spezifisch. Es ist jetzt weit verbreitet in unserem Labor verwendet und die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Diagnose von entzündlichen Erkrankungen.
Um zu beginnen, bereiten Sie Lösungen eins, zwei und drei nach dem Textprotokoll, und legen Sie sie in einem anoxischen Schrank über Nacht. Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen des gesammelten Blutes bei 650 g für 20 Minuten, um die Zellen von der Plasmafraktion zu trennen. Ohne das abgetrennte Blut zu stören, übertragen Sie die Röhrchen in den anoxischen Schrank und übertragen Sie die Plasmafraktionen in eine 50 Milliliter konische Röhre.
Danach entfernen Sie die Plasmaröhre aus dem anoxischen Schrank und zentrieren Sie sie 20 Minuten lang bei 2900 g. Achten Sie darauf, die pelletierten Blutplättchen nicht zu stören, übertragen Sie das Rohr in den anoxischen Schrank und Pipette der Thrombozyten arme Plasma in eine frische 50 Milliliter Rohr. Kombinieren Sie die roten Blutkörperchen mit den Blutentnahmeröhrchen in einer konischen 50-Milliliter-Röhre.
Dann fügen Sie 0,9% Natriumchlorid-Lösung, bis das Gesamtvolumen erreicht 44 Milliliter, und fügen Sie sechs Milliliter von 6%dextran. Invertieren Sie die Röhre 10 bis 20 Mal, um das Blut und die Dextran-Mischung sanft zu mischen, und lassen Sie das Rohr für mindestens 30 Minuten sedimentieren. Während die Rohrsedimente, bereiten Sie einen Percoll-Gradienten, indem Sie 4,2 Milliliter Percoll-Lösung zu 5,8 Milliliter Plasma hinzufügen, und invertieren Sie die Röhre zu mischen.
Als nächstes sammeln Sie die Neutrophilen mit topem Bruch des Dextrans, wobei Sie darauf achten, keine roten Blutkörperchen zu pipette. Ziehen Sie den Schraubverschluss fest, entfernen Sie das Dextran-Rohr aus dem Anoxic-Schrank, und zentrieren Sie das Rohr bei 300 g für 10 Minuten. Achten Sie darauf, die pelletierten Zellen nicht zu stören, legen Sie das Rohr wieder in den anoxischen Schrank.
Entfernen Sie dann die Flüssigkeit durch Pipettieren. Das Pellet vorsichtig in einem Milliliter Plasma wieder aufhängen. Fügen Sie die resuspendierten Zellen langsam an die Oberkörper der Percoll-Lösung an.
Entfernen Sie das Percoll-Lösungsrohr vorsichtig aus dem anoxischen Schrank und zentrifugieren Sie es 20 Minuten lang bei 800 g, um PBMCs von Neutrophilen zu trennen. Als nächstes bereiten Sie 14 Milliliter Waschpufferlösung nach dem Textprotokoll vor. Legen Sie dann das Percoll-Rohr in den anoxischen Schrank.
Verwenden Sie eine Pipette, um die Percoll- und PBMCs zu entfernen und das neutrophil haltige Pellet in einem Milliliter Waschpufferlösung wieder aufzuhängen. Als nächstes fügen Sie den resuspendierten Zellen 200 Mikroliter Magnetperlen hinzu. Die Zellen und Perlen mindestens 15 Minuten lang sanft mischen und bebrüten.
Danach eine Trennsäule zweimal mit zwei MilliliterWaschpuffer waschen. Während Sie eine neue, 15 Milliliter konische Röhre unter der Säule halten, pipetten Sie langsam die neutrophile rote Blutkörperchenmischung durch die Säule. Der Durchfluss aus der Säule sollte trüb sein und seine rote Farbe verlieren, was die vollständige Trennung von Neutrophilen von den verbleibenden roten Blutkörperchen bestätigt.
Fügen Sie zwei Milliliter Waschpuffer an den oberen Rand der Säule und sammeln Sie den Durchfluss in der gleichen Röhre. Am Ende dieser Wäsche sollte der Durchfluss klar sein. Mischen Sie das Sammelrohr vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Neutrophilen gleichmäßig verteilt sind.
Dann sammelten 10 Mikroliter des Durchflusses aus der Zellzählung. Danach entfernen Sie das Neutrophilenrohr aus dem anoxischen Schrank und zentrieren Sie das Rohr bei 300 g für 20 Minuten. Legen Sie die sedimentierten Neutrophilen wieder in den anoxischen Schrank und entfernen Sie den Waschpuffer durch Pipetten.
Setzen Sie dann das Pellet im Plasma wieder aus. Fügen Sie einen Mikroliter RI-MUB40-Cy5 zu einem Milliliter RPMI-1640 Medium ohne Phenolrot hinzu und mischen Sie sie über Pipettieren. Fügen Sie dann einen Mikroliter FMLP-Lösung und Pipette zum Mischen hinzu.
Übertragen Sie die Mischung auf eine Glasbodenmikroskopieschale. Dann fügen Sie ein entsprechendes Volumen von gereinigten Zellen auf die Schale. Schließlich legen Sie die Schale in ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop und starten Sie die Bildaufnahme.
In diesem Protokoll wurde MUB40 auf lebenden Zellen verwendet, um neutrophile Sekretion bei simulation mit FMLP zu erkennen. Die Dynamik der Freisetzung von Granulatgehalt, einschließlich Lactoferrin, kann im Laufe der Zeit visualisiert werden, hier in Magenta. MUB40 kann zusätzlich bei festen Neutrophilen angewendet werden.
Hier phagozytisieren fluoreszierende Perlen in einer zeitgezeitierten Serie. Der Inhalt des Neutrophilen Granulats ist hier blau beschriftet. Die Neutrophile zeigten wenig bis gar keine Zellfärbung zu frühen Zeitpunkten und allmählich nahm die RI-MUB40-Etikettierung im Laufe der Zeit zu, sowohl auf der Plasmamembran als auch auf der Perlenoberfläche.
MUB40 kann auch auf festen entzündlichen Geweben verwendet werden, um Neutrophile gezielt zu erkennen, wie in den Textabbildungen gezeigt. Wir beschreiben hier das Neutrophilenreinigungsverfahren, das routinemäßig in unserem Labor angewendet wird. Jede andere Methode ist geeignet, MUB40-Cy5 Etikettierung wird immer noch funktionieren.
Neutrophil kann nach der Reinigung spezifisch mit MUB40 gekennzeichnet werden oder direkt in entzündetem Gewebe von Patienten oder Tiermodellen. Mehrere MUB40-Derivate wurden entwickelt, um seine Verwendung zu erweitern. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entzündung, um neutrophile Rekrutierung und Aktivierung bei entzündlichen Erkrankungen zu erforschen.
