Diese Arbeit wurde von Start-up-Fonds der New York University unterstützt. Wir danken Maitreya Dunham und Matt Brauer, die zunächst die Verwendung von Chemostate Sixfors Bioreaktoren entwickelt.

Das Prinzip der kontinuierlichen Kultivierung mit einem Chemostat können in einer Vielzahl von Ausführungen realisiert werden. In allen Chemostate ist es wesentlich, 1) Verfahren zur Aufrechterhaltung der Sterilität aller Komponenten, 2) eine gut gemischte Kultur, 3) geeignete Belüftung des Kulturgefäßes und 4) einer zuverlässigen Medien Zugabe und Entnahme Kultur. Hier beschreiben wir die Verwendung eines Sixfors Bioreaktor (Infors Inc) als Chemostat mit Methoden, die leicht auf alternative Konfigurationen angepasst werden können. 1. Montage der Chemostat Schiffe <ol><li> Schalten Sie die Sixfors über den Hauptschalter. </li><li> Die Chemostatgefäß, Rührer Montage, und die angeschlossenen Schläuche mit entsalztem (VE) Wasser gründlich abspülen. Überprüfen Sie alle Schläuche und O-Ringe und ersetzen Sie abgenutzte aussehende Stücke. </li><li> Sicherzustellen, dass die Antriebswellenstützbasis nach oben gerichtet in das Glasgefäß und die Oberseite der Antriebswelle in ihrem Gehäuse auf der Rühranordnung schnappt. Stellen Sie die stirrer Anordnung in das Glasgefäß Gewährleistung der Unterseite der Antriebswelle in dem Antriebswellenträger gelagert. Verwenden Sie den Haken, um den Rührer Anordnung an der Glasbehälter zu sichern. </li><li> Füllen Sie den Behälter mit etwa 300 ml DI-Wasser. </li><li> Entfernen Sie die Kappen von einem gelösten Sauerstoff (DO 2)-Sonde und überprüfen Sie den Elektrolytstand durch Abschrauben der unteren Gehäuse und dafür sorgen, dass der Boden Gehäuse ist zur Hälfte mit Elektrolytlösung gefüllt. Rescrew den unteren Mantel und stecken in den Anschluss auf der Chemostatgefäß. Schrauben handfest. </li><li> Nehmen Sie eine pH-Sonde und aus seiner Speicherpuffer (3 M KCl). Entfernen Sie den pH-Sonde Kappe und heften sich an ein Fermenter. Mit der Sixfors Steuerbildschirm zu den Fermenter Parametermenü und wählen Sie &quot;Kalibrieren pH&quot;. Setzen Sie den pH-Sonde in eine Standard-pH-7-Puffer und Plattenlese als Hoch lesen. Wiederholen Sie mit pH 4-Puffer und Plattenlese als Low lesen. Nehmen Sie den pH-Sonde aus Fermenter, wäscht mit DI-Wasser und führen Sie die Sonde into der Port auf dem Chemostatgefäß. Schrauben handfest. </li><li> Legen Sie die Chemostatgefäß im Rack. Hinweis auf dem Schiff, die Fermenter (1-6) der pH-Sonde wurde angeschlossen und kalibriert. Setzen Sie die Kappe auf pH-Sonde der pH-Sonde. Mit Folie abdecken dicht die Spitze der DO 2-Sonde. </li><li> Einklappen Folie über die Enden des Schlauchs an den Chemostatgefäß befestigt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,2-1,8 für alle Schiffe. </li><li> Sterilisieren der Gefäße durch Autoklavieren sie für 15 Minuten auf einem Flüssigkeitskreislauf. </li></ol> 2. Vorbereiten der Medien <ol><li> Stellen Sie die Begrenzung Konzentrationsbereich für einen Nährstoff durch den Anbau von Batch-Kulturen in verschiedenen Nährstoffkonzentrationen. Der Nährstoff wird in dem Bereich, wo die Begrenzung der endgültige Zelldichte ist eine lineare Funktion des ursprünglichen Nährstoffkonzentration (Fig. 4). Wählen Sie einen Nährstoffkonzentration auch im Grenzbereich. Beispiele für Standardmedien Zusammensetzung für Studien mit Saccharomyces cerevisiae sind in 7-11 zur Verfügung. </li><li> Autoklav eine leere Glasballon, der mit einem Gummistöpsel enthält einen Lufteinlass und Medienunter nach zunächst sicherzustellen, dass das Ende der Medien Schlauch wird in Folie abgedeckt gekappt wird. </li><li> In einem separaten Gefäß vorbereitet 10 l Medium. </li><li> Bringen Sie einen 500-ml-Filtertasse in einen 100 ml-Flasche Medien. Entfernen Sie die Baumwollfilter mit einer Pinzette in Ethanol sterilisiert und sofort an die Filtration Anschluss befestigen auf dem Medienglasballon. </li><li> Befestigen Sie den Medienglasballon mit einer Vakuumquelle und Filtermedien sterilisieren, indem es zu den Filtertopf. </li><li> Wenn Filtration von Medien abgeschlossen ist, schließen Sie den Filter Port mit einer Metallklemme. </li></ol> 3. Kalibrieren dO 2 Sonden und Einrichten Chemostat <ol><li> Nachdem die Chemostat Schiffe wurden autoklaviert und darf Ort das Schiff in die entsprechende Wärmejacke abkühlen. Schließen Sie den Temperaturfühler, pH-Sonde, und DO 2-Sonde. Lassen Sie dieSchiff sitzen mit der Macht für mindestens 6 Stunden, damit die DO 2-Sonden zu polarisieren. </li><li> Legen Sie das Ende jeder Abwasserrohr in einen separaten Auffangbehälter. Schließen Sie die Luftversorgung über ein Filter autoklaviert und schalten Sie Luftstrom. Das Wasser in jedes Schiff sollte aus den Abwasserrohren zu fließen, was bedeutet, dass alle Dichtungen korrekt gebildet werden. </li><li> Einstellen der Höhe des Abwasserrohres gemäß der gewünschten Arbeitsvolumen (z. B. 300 ml). Wir verwenden ein Herrscher, der mit Rohrplatzierungen an verschiedenen Arbeitsvolumen kalibriert gekennzeichnet ist. </li><li> Schließen Sie die Medien auf den Glasballon Chemostatgefäß. Verwenden Ethanol um Rohr zu halten endet so steril wie möglich. Fädeln Sie den Pumpenschlauch durch die Pumpe und offene Klemme. Manuell drücken Sie die Pumpe, bis die Medien beginnt, in der Chemostatgefäß fließen. Lassen Schlauch von der Pumpe, sollten Medien frei in Chemostatgefäß fließen. Wenn die Medien die Abwasserrohr erreicht, bringen Schlauch zu pumpen und zu klemmen. </li><li> Starten running das Basisprogramm mit Laufradsatz bis 400 Umdrehungen pro Minute und die Temperatur auf 30 ° C eingestellt </li><li> Um das zu tun zwei Sonden kalibrieren, schalten Sie Luftversorgung und wechseln Sie zu Stickstoffgas. Warten Sie mindestens eine Stunde und Rekordmesswert als &quot;Low read&quot;. Wechseln Sie wieder zu Luftversorgung (dh haltigen Umgebung Sauerstoffkonzentration), warten Sie mindestens eine weitere Stunde und Plattenmessung als &quot;hohe Lese&quot;. </li><li> Starten Sie die Datenaufzeichnung mit Iris-Software. </li></ol> 4. Impfung <ol><li> 70% Ethanol zu verwenden, um die Oberseite des Kulturgefäßes zu sterilisieren. </li><li> Schraube auf Behälterdecke und Pipette 1 ml einer Übernachtkultur in die Chemostatgefäß. Ziehen Sie die Schraube. </li><li> Geben Sie die Zeit der Impfung in Iris. </li><li> Warten Sie etwa 24 Stunden für Kulturen frühen stationären Phase zu erreichen. Wie die Kultur wächst, werden gelösten Sauerstoff und pH-Wert verringern. Im Falle von Glucose-Begrenzungsmittel, wird gelöster Sauerstoff auf ~ 100% im stationären pha zurückse. Für andere Nährstoff Einschränkungen gelöstem Sauerstoff wird in der stationären Phase bleiben &lt;100%. </li></ol> 5. Initiierung von Pumpen und Erreichen Steady State <ol><li> Das Verdünnungsverhältnis wird durch Dividieren der Flussrate durch die Kulturvolumen berechnet (wie viel Medien in den Behälter pro Stunde fließt). Beispielsweise mit einem Volumen von 300 ml einer Verdünnungsrate von 0,1 bedeutet, daß 30 ml Medium zu der Kultur pro Stunde aufgenommen. Da das System unter Überdruck das gleiche Volumen aus dem Behälter sichergestellt wird, dass die Kultur kontinuierlich verdünnt wird entfernt. Eine Reihe von Verdünnungsraten (D) verwendet, die die maximale Wachstumsrate (μ max) der Zellen, über dem Zellen aus dem Chemostat gewaschen werden, nicht überschreiten werden. </li><li> Wählen Pumpeneinstellungen, die die Anzahl der Sekunden, die Pumpe an und aus angeben, um die gewünschte Durchflussmenge zu etablieren. Die Pumpe fördert Medien mit einer Geschwindigkeit von ~ 0,11 ml / sec. </li><li> Definieren Sie ein Programm mit dem Sixfors interface, die die Pumptakt, Temperatur und Geschwindigkeit Flügelrad angibt. Starten Sie das Programm. </li><li> Leeren Sie den Auffanggefäßen von Flüssigkeit und notieren Sie die Zeit. </li><li> Nach mindestens zwei Stunden, mit einem Messzylinder zu messen, wie viel Medien aus dem Gefäß entfernt. Dies wird das Volumen, das in die Chemostatgefäß hinzugefügt wurde gleich. Berechnen Sie die Verdünnungsrate (D = V Abwasser / V Kultur / Zeit). Stellen Pumpeneinstellungen, wenn berechnet Verdünnungsrate nicht gewünschten Verdünnungsrate entsprechen. </li><li> Im stationären Zustand ist die Zelldichte in der Chemostat nicht mit der Zeit ändern. Dies kann ohne Stören der Kultur durch Abtasten des Ausfluss gemessen werden. Wir Erreichen stationärer operativ definiert als identisch Zelldichtemessungen, die durch mindestens eine Verdopplung der Population abgetrennt werden. Erreichen stabilen Zustand wird etwa acht Kultur Generationen nach Beginn der Kultur Verdünnung zu nehmen. Im stationären Zustand Zellen wachsen exponentiell (dhE. konstante Wachstumsrate über die Zeit) in nährstofflimitierten Bedingungen. Die Verdopplungszeit der Population (Generationszeit) ist ln (2) / D. </li><li> Weiterhin periodisch messen Abwassermenge für die Dauer des Experiments, um sicherzustellen, daß ein konstanter Verdünnungsrate aufrechterhalten wird. </li></ol> 6. Anwendung 1: Studieren wachsenden Zellen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Steady-State-Bedingungen <ol><li> Im stationären Zustand im Chemostat, ist die Wachstumsrate der Population von Zellen, die gleich der Verdünnungsrate. Durch die systematische Veränderung der Verdünnungsrate ist es möglich, Zellen mit unterschiedlichen Raten wachsen. Dies ermöglicht die systematische Untersuchung von physiologischen Parametern, die mit Wachstumsrate einschließlich Zellvolumen, Zellzyklus-Stadium und Stressresistenz variieren. Zusätzlich können stationäre Profile der globalen mRNA, Protein und Metabolitenspiegel in Zellen, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten getestet werden. Es gibt zwei Möglichkeiten, um Proben zu erwerben: </li><li> Kleine Proben kann passiv sein, obindem das Ende des Rohrs in einem Abwasser 1,5 ml oder 15 ml-Röhrchen enthaltene. Eine Probe von 1-5 ml in wenigen Minuten (in Abhängigkeit von der Durchflussmenge) erhalten werden. Viele physiologische Parameter aus diesen Proben gemessen werden. </li><li> Genexpression oder Metaboliten Analysen erfordern größere Proben, die so schnell wie möglich erreicht werden muss. Das Ende des Abwassers Rohr in ein 15 ml konischen Röhrchen. Lösen Sie die Schraube, mit der Metall Ende des Abwasserrohres und sanft nach unten drücken. A ~ 10 ml Probe rasch füllen Sie Ihre Röhre. Beachten Sie, dass das Volumen in der Chemostatgefäß geändert hat. Wenn viele aufeinander folgende Proben entnommen werden, kann es notwendig sein, um die Strömung zu verringern, um ein konstantes Verdünnungsverhältnis zu erhalten. </li></ol> 7. Anwendung 2: Präzise Messung der Unterschiede in den Wachstumsraten zwischen den Genotypen in Controlled Environments mittels Durchflusszytometrie-basierte Assays Wettbewerb <ol><li> Chemostaten verwendet werden, um die Wirkung der Nährstoffkonzentration genau zu quantifizierenauf Unterschiede in den Wachstumsraten (dh Fitness) zwischen verschiedenen genetischen Hintergründen. Durch Co-Kultivieren Stämme mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen markiert die Änderungsrate der relativen Häufigkeit während des exponentiellen Wachstums bestimmt. Durchführung dieses Tests bei verschiedenen Verdünnungsraten (D) ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der Nährstoffkonzentration (e) auf Fitness Unterschiede. </li><li> Stellen stationären Kulturen der beiden Stämme in separaten Chemostat Gefäße mit identischen Verdünnungsraten und einem Volumen von 300 ml. </li><li> Passiv Probe 1 ml aus jedem Gefäß. Spin down Zellen resuspendieren in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und bei 4 ° C Diese Proben enthalten homogenen Zellproben, die Steuerelemente für die nachfolgende Durchflusszytometrie sind. </li><li> Setzen Sie den Abwasserrohr von einem Behälter in einen Messzylinder autoklaviert. Lösen Sie die Schraube, mit der Metall Ende des Abwasserrohres und sanft nach unten drücken, um Zellen aus dem Chemostat zu vertreiben. Wanndas Volumen erreicht 150 ml, senden Sie das Metall Ende des Abwasserrohres in seine ursprüngliche Position (300 ml). Wiederholen, mit dem zweiten Behälter, mit einem anderen Messzylinder. </li><li> 70% Ethanol zu verwenden, um die Sterilität aufrecht zu erhalten, während das Entfernen Schraube an der Oberseite der Chemostatgefäß. Zeigen Trichter in Öffnung und gießen Sie 150 ml von der anderen Kultur in die Chemostatgefäß. Ziehen Sie die Schraube. Wiederholen, mit dem zweiten Behälter mit dem zweiten Trichter. Jede Chemostatgefäß enthält nun eine Mischung der beiden Stämme. </li><li> Besorgen Sie sich eine 1 ml Probe aus jedem Gefäß mit passiven Probenahme alle 2-6 Stunden. Spin down Zellen in PBS resuspendieren und bei 4 ° C Nimmt die Proben für 2-3 Tage sorgfältig Aufzeichnen der Zeit wurde jede Probe gemacht. </li><li> Am Ende des Experiments beschallen und verdünnte Proben auf ~ 2 × 10 6 Zellen / ml. Verwendung der Durchflusszytometrie messen den Anteil der beiden Stämme in jeder Probe. Da beide Stämme sind exponentiell wächst, ist die relative Wachstumsrate Unterschieddurch lineare Regression ln (strain1/strain2) gegen die Zeit (in Generationen gemessen) bestimmt. Die Steigung der Regression ist die proportionale Differenz in der Wachstumsrate (dh die Eignung Vorteil) einer Belastung gegenüber dem anderen. </li><li> Da die Mischkultur kann einige Zeit, um einen neuen stationären Zustand zu erreichen nimmt, kann frühen Zeitpunkten schlecht auf der Regressions passen. Dieses Problem ist am besten, indem 2-3 Generationen vor Beginn Probenahme oder Entfernen von Punkten, die früh klar Ausreißer verstreichen gelöst. Umgekehrt, wenn ein Stamm dem anderen outcompeted die Daten nicht mehr sinnvoll und diese Punkte sollten ausgeschlossen werden. </li></ol> 8. Anwendung 3: Experimentelle Entwicklung <ol><li> Experimentelle Entwicklung in Chemostate durchgeführt wählt für Mutanten, die in Fitness im nährstoff begrenzt Umwelt erhöht. Die Auswahl erfolgt in der Regel über Hunderte von Generationen durchgeführt. </li><li> Stellen Sie eine Steady-State-Chemostatkultur mit einem Stammvon bekannten Genotyp (und vorzugsweise bekannte Genomsequenz) und eine definierte Nährstoffbeschränkung. </li><li> Um ein &quot;Fossilien&quot; der Bevölkerung zu erhalten Anpassung passiv probieren Chemostat alle 2-3 Tage und speichern Sie die Probe in 15% Glycerin bei -80 ° C </li><li> Überwachen Sie den Medienspeicher wieder aufzufüllen und mit frischem Medium wie nötig. </li><li> Pflegen Sie die exponentiell wachsenden Kultur für mehrere hundert Generationen. </li><li> Nach Beendigung des Selektionsplatte eine Probe von Zellen auf festen Agar-Platten. Nach der Zellen zu Kolonien gewachsen, nehmen eine unvoreingenommene Stichprobe von Kolonien mit Zahnstochern und impfen Klone in einzelne Wells einer 96-Well-Platte mit 100 ul Medium. Lassen klonalen Proben über Nacht wachsen, werden 100 ul von 30% Glycerin und Speicher in -80 ° C </li><li> Charakterisieren Klone durch Sequenzierung ganzer Genome und die Durchführung phänotypische Tests einschließlich der Beurteilung von Eignung, mit einem gemeinsamen fluoreszenzmarkierten Referenzstamm, wie in Anwendungs ​​2 beschrieben. &lt;/ Li&gt; </ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Chemostate ermöglichen den Anbau von Mikroben in Wachstumsgesteuerten stationären Bedingungen. Die Zellen wachsen kontinuierlich mit einer konstanten Geschwindigkeit, was zu einem unveränderlichen äußeren Umgebung. Dies steht im Gegensatz zur Batch-Kultur Methoden, bei denen das äußere Umfeld kontinuierlich verändert und die Rate des Zellwachstums wird durch die komplexe Wechselwirkung von Genotyp und Umgebung bestimmt. Somit ist ein Hauptvorteil der Kultivierung von Mikroben in Chemostaten über Batch-Kulturen ...

Das Wachstum der Zellen wird durch komplexe Netzwerke von zusammenwirkenden genetischen und Umweltfaktoren 1,2 geregelt. Die multifaktorielle Regulation von Zellwachstum erfordert einen System-Level-Ansatz für ihre Studie. Jedoch ist die strenge Untersuchung regulierten Zellwachstum durch die Schwierigkeit der experimentell Steuern der Rate, mit der Zellen wachsen in Frage. Darüber hinaus wird in selbst die einfachsten Experimente extrazellulären Bedingungen sind häufig dynamisch und komplex wie Zellen zu verändern ständig ihre Umwelt, wie sie sich vermehren. Ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, die experimentelle Kontrolle der Zellwachstumsraten definiert, unveränderlich und kontrollierten Umgebungen ermöglicht: Eine Lösung für diese Probleme wird durch die Chemostat zur Verfügung gestellt. Die Methode der kontinuierlichen Kultivierung mit einem Chemostat wurde unabhängig von Monod 3 und Novick &amp; Szilard 4 im Jahr 1950 beschrieben. Wie ursprünglich konzipiert, werden die Zellen in einem festen Volumen von Medien, die con ist gewachsenlaufend durch Zugabe von neuen Medien und gleichzeitiger Entfernung des alten Medien und Zellen (Fig. 1) verdünnt. Gekoppelten Differentialgleichungen (2) beschreiben die Änderungsrate der Zelldichte (x) und die Konzentration des Wachstums-limitierende Nährstoff (e) in dem Chemostatgefäß. Wichtig ist, dass dieses System von Gleichungen, sagt eine einzige (nicht Null) stabil stationären (Abbildung 3) mit der bemerkenswerten Implikation, dass im stationären Zustand, gleich der Rate ist die spezifische Wachstumsrate der Zellen (dh die exponentielle Wachstumsrate konstant) bei der die Kultur verdünnt wird (D). Durch Variation der Verdünnungsrate ist es möglich, stationäre Populationen von Zellen in unterschiedlichen Wachstumsraten und unter verschiedenen Bedingungen von Nährstoffmangel zu etablieren. Die experimentelle Kontrolle der Wachstumsrate mit Chemostate war entscheidend für die Entwicklung des Verständnisses, wie Veränderungen der Zellphysiologiemit Wachstumsraten 5,6. Das ehemalige Hauptstütze der mikrobiologischen Methoden wurde jedoch bei der Explosion in der molekularbiologischen Forschung während des späten zwanzigsten Jahrhunderts zunehmend unklar. Heute, erneutes Interesse in der Wachstumskontrolle in beiden Mikroben und vielzelligen Organismen und dem Aufkommen der genomweiten Methoden zur Analyse auf Systemebene hat die Motivation für den Einsatz von Chemostate erneuert. Hier beschreiben wir drei Anwendungen, die auf die präzise Steuerung von Zellwachstumsraten und der äußeren Umgebung, die eindeutig mit Chemostate möglich zu nutzen. Zunächst beschreiben wir die Verwendung von Chemostate zu untersuchen, wie die Fülle von Tausenden von Biomolekülen - wie Transkripte und Metaboliten - sind koordinativ mit Wachstumsrate geregelt. Zweitens beschreiben wir, wie Chemostate verwendet werden, um eine präzise Schätzung der Wachstumsrate Unterschiede zwischen den verschiedenen Genotypen in nährstoff beschränkt Umgebungen mit Konkurrenzversuchen zu erhalten. Drittens werden wir beschreiben, wie Chemostate kannverwendet werden, um adaptive Evolution der Zellen, die in konstanter nährstoffarmen Umgebungen zu untersuchen. Diese Beispiele veranschaulichen, in welcher Weise Chemostate ermöglichen es Systemebene Untersuchungen von Zellwachstumsregulierung, durch Gen-Umwelt-Interaktionen und adaptive Evolution.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td>
			<td>Appropriate Technical Resources, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle 9.5 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-887-1</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinchcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-867</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopper, Size 12, Green Neoprene</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-62991-42</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Connector</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-30703-02</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General purpose ties 4 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9557052</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone Rubber</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>B000FMWTDE</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone, 3/8 in OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-587-1Q</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone, 7/32 in OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-587-1E</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6100K164</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6100K161</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hook Connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-66-18Q</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ratchet Clamp</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-06403-11</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, Female</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-45512-34</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, Male</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-45513-04</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 &mu;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MTGR05010</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 &mu;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9131037</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Reading Flowtube for Air</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-32047-77</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Reading Flowtube for Nitrogen</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-32048-63</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Proportioner Multitube Frames</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03218-50</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator, Two-Stage Analytical</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12-N145D580</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose Adaptor, Stainless Steel</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y99-26450</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose Male Adaptor</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>WES544</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norprene Tubing</td>
			<td>US Plastics</td>
			<td>57280</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod Base</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03218-58</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Cartridges</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03217-92</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboy 10 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-963-2A</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP-T10-RE</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-800-100</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride&middot;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate&middot;7H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424205000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423400010</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper sulfate&middot;5H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>209198</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60400</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ferric chloride&middot;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>I88-100</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese sulfate&middot;H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium molybdate&middot;2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc sulfate&middot;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium pantothenate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC24330-1000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>folic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7876</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inositol (aka myo-inositol)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC12226-1000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>niacin (aka nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-aminobenzoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC14621-2500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9755</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>riboflavin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4500-25G</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP892-100</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L8000-100G</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0155-08-5</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of chemostats in microbial systems biology

Zellen regulieren ihre Wachstumsrate in Reaktion auf Signale von der Außenwelt. Als die Zelle wächst, müssen diverse zelluläre Prozesse koordiniert einschließlich makromolekulare Synthese, Stoffwechsel und letztlich Einsatz für die Zellteilungszyklus ist. Der Chemostat, eine Methode der experimentell Steuerung der Zellwachstumsrate, liefert ein leistungsfähiges Mittel, systematisch zu untersuchen, wie Wachstumsrate Auswirkungen zelluläre Prozesse - einschließlich der Genexpression und Stoffwechsel - und die regulatorischen Netzwerke, die die Geschwindigkeit von Zellwachstum steuern. Wenn für Hunderte von Generationen Chemostate beibehalten kann zur adaptiven Evolution der Mikroben in Umweltbedingungen, die das Zellwachstum zu begrenzen studieren. Wir beschreiben das Prinzip der Chemostatkulturen, zeigen deren Betrieb und liefern Beispiele für ihre verschiedenen Anwendungen. Nach einer Periode des Stillstands nach ihrer Einführung in der Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts, die Konvergenz der genomweiten Methoden mit einer erneutenInteresse an der Regulation von Zellwachstum und die molekularen Grundlagen der adaptiven Evolution ist anregend eine Renaissance in der Verwendung von Chemostate in der biologischen Forschung.

Ein Hauptvorteil der Chemostate ist die Fähigkeit, das Wachstum von Zellen experimentell durch Variieren des Verdünnungsrate zu steuern. In der Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, die Morphologie einer Zelle ist informativ seiner Phase im Zellzyklus. Populationen mit höheren Wachstumsraten enthalten einen höheren Anteil von aktiv teilenden Zellen, wie durch Messung der Bruchteil unbudded Zellen (5A) bestimmt. Analysen der globalen mRNA-Expression in Chemostatkulturen hat gezeigt, daß die Express...

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The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Zellwachstumsrate ist ein regulierter Prozess und eine wesentliche Determinante für Zellphysiologie. Kontinuierliche Kultivierung mit Chemostate ermöglicht extrinsischen Kontrolle der Zellwachstumsrate von Nährstoffmangel erleichtert die Untersuchung der molekularen Netzwerke, die Zellwachstum und wie diese Netzwerke entwickeln, um das Zellwachstum zu optimieren steuern.

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.6K Aufrufe.  New York University.  Zellwachstumsrate ist ein regulierter Prozess und eine wesentliche Determinante für Zellphysiologie. Kontinuierliche Kultivierung mit Chemostate ermöglicht extrinsischen Kontrolle der Zellwachstumsrate von Nährstoffmangel erleichtert die Untersuchung der molekularen Netzwerke, die Zellwachstum und wie diese Netzwerke entwickeln, um das Zellwachstum zu optimieren steuern. 

Serie: The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft in der Termite Enddarm - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

Forschung

Biologie

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Schichten von Symbiosis - Visualisierung der Termite Enddarm mikrobiellen Gemeinschaft

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Mikrobielle Gemeinschaften in Natur und Labor - Interview

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologie mikrobieller Gemeinschaften - Interview

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Mit Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) zu Diagnose-Tools entwickeln

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life activities. Its high prevalence in general population and the severe limitations it causes, point out the necessity to find new efficient strategies to treat it. Together with the cognitive-behavioral treatments, relaxation represents a useful approach for the treatment of GAD, but it has the limitation that it is hard to be learned. The INTREPID project is aimed to implement a new instrument to treat anxiety-related disorders and to test its clinical efficacy in reducing anxiety-related symptoms. The innovation of this approach is the combination of virtual reality and biofeedback, so that the first one is directly modified by the output of the second one. In this way, the patient is made aware of his or her reactions through the modification of some features of the VR environment in real time. Using mental exercises the patient learns to control these physiological parameters and using the feedback provided by the virtual environment is able to gauge his or her success. The supplemental use of portable devices, such as PDA or smart-phones, allows the patient to perform at home, individually and autonomously, the same exercises experienced in therapist's office. The goal is to anchor the learned protocol in a real life context, so enhancing the patients' ability to deal with their symptoms. The expected result is a better and faster learning of relaxation techniques, and thus an increased effectiveness of the treatment if compared with traditional clinical protocols.

The Project on Virtual Reality Intelligent Multi-sensor System for the Treatment of Anxiety-related Disorders (INTREPID) is aimed at developing a multi-sensor context-aware virtual reality system for the treatment of anxiety-related disorders.

Der Einsatz von Biofeedback in der klinischen Virtual Reality: Die INTREPID Projekt

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in the environment, as well as directly for the transmission of pathogens to drinking water supplies. Natural porous media is composed of an intricate physical topology, varied surface chemistries, dynamic gradients of nutrients and electron acceptors, and a patchy distribution of microbes. These features vary substantially over a length scale of microns, making the results of macro-scale investigations of microbial transport difficult to interpret, and the validation of mechanistic models challenging. Here we demonstrate how simple microfluidic devices can be used to visualize microbial interactions with micro-structured habitats, to identify key processes influencing the observed phenomena, and to systematically validate predictive models. Simple, easy-to-use flow cells were constructed out of the transparent, biocompatible and oxygen-permeable material poly(dimethyl siloxane). Standard methods of photolithography were used to make micro-structured masters, and replica molding was used to cast micro-structured flow cells from the masters. The physical design of the flow cell chamber is adaptable to the experimental requirements: microchannels can vary from simple linear connections to complex topologies with feature sizes as small as 2 &mu;m. Our modular EcoChip flow cell array features dozens of identical chambers and flow control by a gravity-driven flow module. We demonstrate that through use of EcoChip devices, physical structures and pressure heads can be held constant or varied systematically while the influence of surface chemistry, fluid properties, or the characteristics of the microbial population is investigated. Through transport experiments using a non-pathogenic, green fluorescent protein-expressing Vibrio bacterial strain, we illustrate the importance of habitat structure, flow conditions, and inoculums size on fundamental transport phenomena, and with real-time particle-scale observations, demonstrate that microfluidics offer a compelling view of a hidden world.

Microfluidic devices can be used to visualize complex natural processes in real time and at the appropriate physical scales. We have developed a simple microfluidic device that mimics key features of natural porous media for studying growth and transport of bacteria in the subsurface.

Fenster an einem Microworld: Einfache mikrofluidische Systeme für Studium Mikrobielle Transport in porösen Medien

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Bestimmung des Beitrages der Energy Systems während des Trainings

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

The quantity and quality of detritus entering the soil determines the rate of decomposition by microbial communities as well as recycle rates of nitrogen (N) and carbon (C) sequestration1,2. Plant litter comprises the majority of detritus3, and so it is assumed that decomposition is only marginally influenced by biomass inputs from animals such as herbivores and carnivores4,5. However, carnivores may influence microbial decomposition of plant litter via a chain of interactions in which predation risk alters the physiology of their herbivore prey that in turn alters soil microbial functioning when the herbivore carcasses are decomposed6. A physiological stress response by herbivores to the risk of predation can change the C:N elemental composition of herbivore biomass7,8,9 because stress from predation risk increases herbivore basal energy demands that in nutrient-limited systems forces herbivores to shift their consumption from N-rich resources to support growth and reproduction to C-rich carbohydrate resources to support heightened metabolism6. Herbivores have limited ability to store excess nutrients, so stressed herbivores excrete N as they increase carbohydrate-C consumption7. Ultimately, prey stressed by predation risk increase their body C:N ratio7,10, making them poorer quality resources for the soil microbial pool likely due to lower availability of labile N for microbial enzyme production6. Thus, decomposition of carcasses of stressed herbivores has a priming effect on the functioning of microbial communities that decreases subsequent ability to of microbes to decompose plant litter6,10,11.
We present the methodology to evaluate linkages between predation risk and litter decomposition by soil microbes. We describe how to: induce stress in herbivores from predation risk; measure those stress responses, and measure the consequences on microbial decomposition. We use insights from a model grassland ecosystem comprising the hunting spider predator (Pisuarina mira), a dominant grasshopper herbivore (Melanoplus femurrubrum),and a variety of grass and forb plants9.

We present methods to evaluate how predation risk can alter the chemical quality of herbivore prey by inducing dietary changes to meet demands of heightened stress, and how the decomposition of carcasses from these stressed herbivores slows subsequent plant litter decomposition by soil microbes.

Linking Prädationsrisiko, Herbivore Physiologische Stress und mikrobielle Zersetzung des Pflanzenstreu

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...