This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).

1. Herstellung der Probe <ol><li> Wachsen Spalthefe - Zellen, die die Spindel Polkörper Marker SAd1-mCherry 23 und Typ - II - Myosin regulatorische leichte Kette RLC1-Tomate 24 in YE flüssigen Medien bei 32 ° C für 8 Generationen. HINWEIS: Bei temperaturempfindlichen Mutanten wachsen Zellen bei 25 ° C. Wachsen Zellen bis zur mittleren logarithmischen Phase bis zu einer OD 600 von 0,5 in YE. Weitere Informationen über die Spaltung beziehen Hefe Wachstumsbedingungen der Spalthefe Laborhandbuch 25. </li><li> Bereitet (oder minimal) Medien mit 0,6% Agarose (Agarose basierte Medien zeigen weniger fluoreszierenden Hintergrund im Vergleich zu Agar). Um das geschmolzene Medien hinzufügen 1 mM Ascorbinsäure (Vitamin C). Das Vitamin C quencht freie Radikale, die durch Photobleaching freigesetzt werden, wodurch Phototoxizität zu minimieren. </li><li> Gießen Sie 3 bis 4 ml der Vitamin-C-Medien geschmolzen geschnürt auf einen Glasboden Kulturschale. Lassen Sie die Medien kühl und zu verfestigen. Beachten Sie dasDicke des Glases in der Kulturschale, hängt von der Deckglasdicke geeignet für das Mikroskop. Hier Gebrauch Deck Nr 1.5. </li><li> erhöhen Sie vorsichtig die verfestigte Medien aus der Kulturschale mit Hilfe eines scharfen Skalpell. Legen Sie eine Pipettenspitze zwischen dem Medienplatte und der Kulturschale die Platte zu verhindern , fallen zurück in die Schale (Abbildung 1). </li><li> Nehmen Sie 1 ml frisch wachsenden Zellen, wie in 1.1 oben beschrieben. Drehen Sie die Zellen vorsichtig bei 300 g für 30 s. Überstand verwerfen. Resuspendieren der Zellen in der geringen Menge an Rest Medien, das nach dem Verwerfen des Überstandes in der Röhre verbleibt. </li><li> Last von 2 bis 5 &amp; mgr; l der resuspendierten Zellkultur zwischen dem Medienplatte und den Glasboden der Kulturschale. Die Zellen sollten auf dem Glas sein. Die Pipettenspitze zwischen den Medien gegeben und die Schale ermöglicht eine einfache Beladung der Zellkultur. </li><li> Sehr sanft die Pipettenspitze entfernen und die Medienplatte wieder in seine ursprüngliche Position auf dem culture Gericht. Achten Sie darauf, alle Luftblasen zu vermeiden. Wenn die Notwendigkeit, die Luftblasen durch Verschieben der Rückseite einer Pipettenspitze auf der Oberseite der Medienplatte herausdrücken sanft werden. </li><li> Lassen sich die Zellen bei der Temperatur für 30 min bis eine Stunde in der Dunkelheit in der Kulturschale sitzen, an der Mikroskopie durchgeführt wird. Dies ist wichtig, jeden Schlag zu vermeiden aufgrund der Wachstumsbedingungen für die Zellen zu ändern. </li></ol> 2. Image Acquisition <ol><li> Einen Tropfen von Öl auf der Außenseite des Glases auf der Kulturschale. Legen Sie die Kulturschale auf einem inversen Mikroskop. </li><li> (- 535 nm 520) Autofluoreszenz von YE Medien verwenden, um eine GFP-Filter mit einem schmalen Wellenlängenbereich zu minimieren. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der medialen Ebene der Zellen und sicherzustellen, dass sie gut verteilt sind und nicht zu voll. Stellen Sie sicher, Bildaufnahme der Zellen in der geeigneten Phase des Zellzyklus zu starten. Für dieses Experiment folgen Zellen vom späten G2. </li><li> Programmieren Sie die Bildaufnahme - Software to nehmen GFP, RFP und DIC Bilder der Zellen. <ol><li> Für dieses Experiment wurden 100 ms Belichtungszeit für die DIC verwenden und 75 ms Belichtungszeit für GFP und RFP-Filter. Die Belichtungszeit hängt von den Einstellungen des Mikroskops, das Protein untersucht und der Dauer des Experiments. Für den gegebenen Mikroskopeinstellungen, verwenden 50% der Laserleistung. </li><li> So erfassen Bilder in 3 Dimensionen, Programm der Bilderfassungssoftware für Z-Skala Bildgebung. Verwenden Sie einen Schrittgröße von 0,4 um und einem Abstand von 3,0 um (die Hälfte der gesamten z) um den zentralen Fokuspunkt der Zellen. Dies führt zur Erfassung von 16 Z-Frames pro Zeitpunkt mit insgesamt Z-Abstand von 6 um. HINWEIS: Z-Serie Bildaufnahme ermöglicht die Erfassung der Spindel Polkörper. </li></ol></li><li> Nehmen Sie Bilder alle 2 min. Verändern der Belichtungszeit entsprechend den Anforderungen des Experiments. Die Belichtungszeit kann auch nach dem interessierenden Protein und der Signalstärke verändert werden. Beachten Sie jedoch, dass die kurzeer Intervallen oder längere Belichtungszeit Erhöhung Phototoxizität aufgrund Bleichen und daher können die Zellen nur für eine kurze Zeit verfolgt werden. </li><li> Erwerben Sie Bilder bis in die Zellen physikalisch getrennt, wie durch die DIC Bilder beobachtet, oder die Software programmieren, um Erwerb nach 90 min zu stoppen. </li></ol> 3. Bildanalyse <ol><li> Zeitliche Analyse der zytokinetischen Ereignisse <ol><li> Mit Hilfe der Bildaufnahme-Software machen Projektionen der Z-Frames für jeden Zeitpunkt. Machen Sie verschiedene Dateien für jede Wellenlänge des Bildes erfasst. </li><li> Exportieren Sie diese Projektion Zeitpunkt Serie als Tiff-Datei. </li><li> Analysieren Sie die Bilder ImageJ-Software. Öffnen der Bilderserie für jede eine der Wellenlängen. </li><li> Wählen Sie eine Zelle untersucht werden. Klicken Sie doppelt auf die Zeile Option der Symbolleiste. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen, um Linienbreite anpassen. Stellen Sie die Linienbreite zur Zellenbreite entspricht. Für eine WT-Zelle ist dies etwa 40 - 50 Pixel. Zeichnen Sie eine Linie entlang derlangen Achse der Zelle von Interesse. </li><li> Klicken Sie auf Analysieren&gt; Tools&gt; ROI-Manager und klicken Sie auf Hinzufügen. Dadurch wird die ausgewählte Zeile in die ROI-Fenster für den Einsatz später hinzufügen. Sie dieses Fenster nicht schließen. </li><li> Klicken Sie auf das Bild von Interesse und wählen Sie Bearbeiten&gt; Auswahl&gt; Begradigen. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen. Check &quot;gesamte Stapel verarbeiten&quot;. Dadurch wird die Zelle horizontal auszurichten. </li><li> Klicken Sie auf Bild&gt; Transformieren&gt; Drehen um 90 Grad nach rechts. Dieses Bild ist nun vertikal gestreckt. </li><li> Klicken Sie auf Bild&gt; Stacks&gt; Make Montage. Dadurch wird ein Fenster geöffnet, um die Anzahl der Zeilen und Spalten für den Stapel, der Skalierungsfaktor für die Bildgröße, die erste und die letzte Scheibe (Rahmen) für die Montage und der Rahmen Schrittweite für die Montage zuordnen. Überprüfen Etikett Scheiben und drücken Sie die Eingabetaste. </li><li> Als ein Fenster mit einer Montage der Zelle von Interesse gezeigt wird, öffnen Sie die Bildserien für die andere Wellenlänge. </li><li> Klicken Sie auf die Zeilennummer auf ROI-Manager. Dies wird wählendie gleiche Zelle auf der zweiten Bilddatei. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.6 - 3.1.8. Dies wird eine Montage des zweiten Bildes öffnen. </li><li> Auf dem Bild mit dem Körper Marker Spindelpoltrennung SAd1-mCherry, suchen Sie nach Beginn der Trennung der Spindel Polkörper Marker und diesem Zeitpunkt als Zeitpunkt 0 zu markieren. </li><li> Folgen Sie dem RLC1-Tomato-Signal auf das Bild im Laufe der Zeit und suchen Sie nach dem Signal, das als eigenständige Linie erscheint im Gegensatz zu Patches von RLC1-Tomaten. Diese Zeitpunkt markiert Abschluss Actomyosinaktivität Ringanordnung / Beginn der Reifephase. </li><li> Weiter blättern durch den Film über die Zeit zu bestimmen, wann der RLC1-Tomate Ring in der Größe zu sinken beginnt. Dies wird als das Ende der Reifungsphase / Einsetzen der Ringverengung gekennzeichnet. </li><li> Folgen der RLC1-Tomato-Signal über die Zeit im ganzen Einschnürung bis es als ein Punkt in der Mitte der Zellenachse erscheint. Dies wird als das Ende der Ringverengung / Ende Septum ingression markiert. </li><li> Nach der Montage der DIC Bilder, bestimmen die endgültige ZellTrennung. Notieren Sie sich den Zeitpunkt, wenn die Zelle physikalisch trennt. </li><li> Für Spindel Polkörper Trennung messen Sie den Abstand zwischen den beiden Spindel Polkörper im Laufe der Zeit das Linienwerkzeug in ImageJ. Zeichnen Sie die Strecke in Spindel Polkörper über die Zeit. </li><li> Notieren Sie die verschiedenen Zeitpunkte für die verschiedenen zytokinetischen Ereignisse die Dauer der einzelnen zytokinetischen Phase zu berechnen und zu vergleichen mit Spindel Polkörper Trennung über die Zeit. </li></ol></li><li> Räumliche Analyse von zytokinetischen Veranstaltungen <ol><li> Wählen Sie eine Zelle mit einem sichtbaren Aktomyosin Ring. Klicken Sie doppelt auf die Zeilenoption von ImageJ Symbolleiste. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen, um Linienbreite anpassen. Stellen Sie die Linienbreite auf die Ringdicke zu entsprechen (15 bis 20 Punkte). Zeichnen Sie eine Linie entlang des Rings kümmert sich die gesamte Dicke des Rings, um sicherzustellen, ist im Preis inbegriffen. </li><li> Klicken Sie auf Analysieren&gt; Tools&gt; ROI-Manager und klicken Sie auf Hinzufügen. Dadurch wird die ausgewählte Zeile in die ROI-Fenster für den Einsatz später hinzufügen.Sie dieses Fenster nicht schließen. </li><li> Klicken Sie auf das Bild von Interesse und wählen Sie Bearbeiten&gt; Auswahl&gt; Begradigen. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen. Check &quot;gesamte Stapel verarbeiten&quot;. Dadurch wird der Ring horizontal auszurichten. </li><li> Setzen Sie die Intensität der hellsten Ebene in der gestreckten Z-Stapel (von 3.1.6) Bild mit&gt; Anpassen&gt; Helligkeit / Kontrast&gt; Zurücksetzen. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte Stk&gt; 3D-Projekt. Dadurch wird ein Dialogfeld geöffnet. Ändern Sie den Projektionsverfahren auf hellste Punkt und dem Slice-Abstand auf 2 oder 3 Pixel. Schließlich ändern Drehachse X oder Y-Achse (dies hängt von der gewünschten Betrachtungswinkel ändern, je nachdem), klicken Sie interpolieren und OK klicken, um eine 3D-Projektion des Bildes zu erzeugen. Verwenden Sie die Bildlaufleiste unter dem Bild, um das Bild zu drehen. </li><li> Öffnen Sie das Bild Serie für die andere Wellenlänge mit ImageJ. </li><li> Klicken Sie auf die Zeilennummer auf ROI-Manager. Dies wird den gleichen Ring auf dem zweiten Bild-Datei auswählen. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.4 und 4.2.5.Dies wird mit der anderen Wellenlänge, die eine 3-dimensionale Ring im Bild zu öffnen. </li><li> Mit den beiden 3D-Bild Ringe öffnen, klicken Sie auf das Bild&gt; Farbe&gt; Kanäle zusammenführen. Dies wird eine Box zu öffnen. Wählen Sie jedes Bild aus dem Dropdown-Menü für die entsprechende Farbe gewünscht und klicken Sie auf OK. Es öffnet sich ein Verbund aus den beiden Bildern bei unterschiedlichen Wellenlängen. </li><li> Vergleichen Sie die Lokalisierung von verschiedenen Markern in Bezug auf die Lokalisierung am zytokinetischen Ring oder eindringende Membran. RLC1-GFP ist ein Marker für die zytokinetischen Ring. Proteine ​​co-lokalisierenden mit RLC1-GFP in den Ring zu lokalisieren während Proteine ​​hinter RLC1-GFP-Signal zu lokalisieren, um die eindringenden Membran zu lokalisieren. HINWEIS: Das Protein von Interesse muss von einem anderen Fluorophor zu sein, als die des Ringmarkierung. </li><li> Generieren 3-dimensionale Ringe während verschiedener Stadien der Zellteilung die räumliche Lokalisierung der Proteine ​​alle durch cytokinesis zu vergleichen. </li></ol></li><li> Analyse von Protein distriteilung bei zytokinetischen Ring <ol><li> Zu vergleichen und zu analysieren Verteilung von Proteinen entlang des Rings der Koeffizient der Varianz der Proteinverteilung messen. Ein hoher Koeffizient der Varianz zeigt eine ungleichmäßige Verteilung von Proteinen entlang der Teilungsstelle und schlägt vor unsachgemäßen Ringanordnung, Reifung oder Septum Bildung, je nachdem, welche Phasen abgebildet oder analysiert wird. </li><li> Unter Verwendung von 3 dimensionalen rekonstruierten zytokinetischen Ring (ab 3.2.2), teilen sich das Bild in mindestens vier Quadranten, so dass ein Viertel des Rings in jedem Quadranten erscheint. Dazu das Linienwerkzeug verwenden, um senkrechte Linien auf dem Bild zeichnen. Nach jedem Klick Bildzeile&gt; Overlay&gt; Auswahl hinzufügen oder Abkürzung Strg + B verwenden. </li><li> Zum Analysieren&gt; Set-Messung. Wählen mittleren Grauwert in dem Feld, das sich öffnet. OK klicken. </li><li> Mit den gezogenen Linien oben als Führer zeichnen ein Rechteck jedem Quadranten mit dem Rechteck-Werkzeug zu definieren. </li><li> Zur Messung der mittleren Intensität jedes Quadranten, klickenAnalysieren Sie auf&gt; Messen oder die Abkürzung Strg + M verwenden. </li><li> Notieren Sie den mittleren Grauwert für alle vier Quadranten (MG 1 -MG 4). </li><li> Wählen Sie einen kleinen Bereich in jedem Quadranten außerhalb des Rings als Hintergrund Auswahl. </li><li> Messen mittleren Grauwert für die Hintergrundauswahl für alle vier Quadranten (BG 1 -BG 4). </li><li> li&gt; Für Untergrundsubtraktion für jeden Quadranten verwenden Sie die folgende Formel- MG 1 -Average (BG 1: BG 4) = Intensität des Rings in jedem Quadranten (IRQ). In diesem Stadium gibt es 4 IRQ-Werte, einen für jeden Quadranten. </li><li> Als nächstes berechnen die folgende Formel- Standardabweichung (IRQ 1: IRQ 4) unter Verwendung der Variationskoeffizient für jeden Ring / Normal (IRQ 1: IRQ 4). Berechnen durchschnittliche Co effiziente Varianz für jeden Stamm und vergleichen, um zu den anderen Stämmen. ANMERKUNG: Eine statistisch signifikante Zunahme der Koeffizient der Varianz in einem Stamm im Vergleich zu Kontrollen indicates uneben Proteinverteilung / Lieferung entlang der Teilungsebene in diesem Stadium der Zellteilung. </li></ol></li></ol>

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	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+cytokinesis+in+eukaryotes.">Mechanics of cytokinesis in eukaryotes.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (1), 50-56 (2010).</li><li>Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+in+eukaryotes.">Cytokinesis in eukaryotes.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66 (2), 155-178 (2002).</li><li>Xu, X., Vogel, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+promotes+cleavage+furrow+maturation+during+cytokinesis.">A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis.</a> Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).</li><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+and+cancer.">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584 (12), 2652-2661 (2010).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+failure+generating+tetraploids+promotes+tumorigenesis+in+p53-null+cells.">Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells.</a> Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+in+development+and+disease:+variations+on+a+common+theme.">Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme.</a> Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).</li><li>Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+cytokinesis+in+cells+deficient+in+the+breast+cancer+susceptibility+protein+BRCA2.">Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2.</a> Science. 306 (5697), 876-879 (2004).</li><li>Storchova, Z., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+polyploidy+to+aneuploidy,+genome+instability+and+cancer.">From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).</li><li>Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile-ring+assembly+in+fission+yeast+cytokinesis:+Recent+advances+and+new+perspectives.">Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).</li><li>Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+cytokinesis+in+budding+yeast,+fission+yeast+and+animal+cells.">Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells.</a> Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).</li><li>Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+turgor+pressure,+the+contractile+ring,+and+septum+assembly+to+forces+in+cytokinesis+in+fission+yeast.">Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast.</a> Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).</li><li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+cell+wall+beta(1,3)glucan+is+required+to+couple+septation+to+actomyosin+ring+contraction.">Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction.</a> J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).</li><li>Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+TRAPP-II+Complex+and+the+Exocyst+in+Membrane+Deposition+during+Fission+Yeast+Cytokinesis.">Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis.</a> PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).</li><li>Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drc1p/Cps1p,+a+1,3-beta-glucan+synthase+subunit,+is+essential+for+division+septum+assembly+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).</li><li>Cortes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+(1,3)beta-D-glucan+synthase+subunit+Bgs1p+is+responsible+for+the+fission+yeast+primary+septum+formation.">The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation.</a> Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).</li><li>Cortes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+Paxillin-like+Protein+Pxl1+and+Glucan+Synthase+Bgs1+Is+Essential+for+Actomyosin+Ring+Stability+and+Septum+Formation+in+Fission+Yeast.">Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast.</a> PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).</li><li>Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+(1,3)beta-D-glucan+synthase+catalytic+subunit+homologue+Bgs1p/Cps1p+from+fission+yeast+suggests+that+it+is+involved+in+septation,+polarized+growth,+mating,+spore+wall+formation+and+spore+germination.">Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination.</a> J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).</li><li>Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+the+integral+membrane+protein+Cps1p+to+the+cell+division+site+is+dependent+on+the+actomyosin+ring+and+the+septation-inducing+network+in+Schizosaccharomyces+pombe.">The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).</li><li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos.">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li><li>Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+membrane+flattens+out+to+fuel+cell-surface+growth+during+Drosophila+cellularization.">The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).</li><li>Wei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Spatiotemporal+Activation+Pattern+of+Cdc42+by+Gef1+and+Scd1+Promotes+Different+Events+during+Cytokinesis.">Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis.</a> Mol Biol Cell. , (2016).</li><li>Nabeshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centromeres+during+metaphase-anaphase+transition+in+fission+yeast:+Dis1+is+implicated+in+force+balance+in+metaphase+bipolar+spindle.">Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle.</a> Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).</li><li>Johnson, A. E., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dma1+ubiquitinates+the+SIN+scaffold,+Sid4,+to+impede+the+mitotic+localization+of+Plo1+kinase.">Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase.</a> EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).</li><li>Yonetani, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cytokinesis+by+the+formin+cdc12p.">Regulation of cytokinesis by the formin cdc12p.</a> Curr Biol. 20 (6), 561-566 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fission Yeast: A laboratory Manual. , (2016).</li><li>Hachet, O., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid1p/anillin+and+the+septation+initiation+network+orchestrate+contractile+ring+assembly+for+cytokinesis.">Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis.</a> Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+ring+coordinates+curvature-dependent+septum+assembly+during+fission+yeast+cytokinesis.">The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis.</a> Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998 (2014).</li><li>Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-level+investigation+of+the+structure,+transformation,+and+bioactivity+of+single+living+fission+yeast+cells+by+time-+and+space-resolved+Raman+spectroscopy.">Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy.</a> Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).</li><li>Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+dynamic+changes+of+multiple+cellular+components+during+the+yeast+cell+cycle+by+in+vivo+multivariate+Raman+imaging.">Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging.</a> Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).</li><li>Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cps1+gene+provides+evidence+for+a+septation+checkpoint+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier haben wir ein Protokoll zu studieren zytokinetischen Ereignisse in Spalthefe in einer zeitlichen Weise beschrieben. Das hier beschriebene Protokoll liefert zeitliche Auflösung verschiedener zytokinetischen Ereignisse mit Bezug zueinander; Timing der Protein Rekrutierung oder Verlust in Bezug auf zytokinetischen Phase; Struktur des Rings in den verschiedenen Phasen der Zytokinese; und das Fortschreiten der Zytokinese mit Bezug auf die Mitose. Bei diesem Protokoll ist es möglich, die zytokinetischen Phase genau zu ...

Cytokinesis, der letzte Schritt bei der Zellteilung, ist ein komplexer Prozess essentiell für die Differenzierung, die Entwicklung und das Überleben eines Organismus. Cytokinesis umfasst mehrere Veranstaltungen , die organisiert werden erfolgreiche Zelltrennung zu gewährleisten , während genomische Integrität beibehalten 1. Cytokinesis beinhaltet Veranstaltungen , bei denen ein Aktomyosin Ring einmal Einschnürung montiert erfährt, die mit Membranausdehnungs und Runzeln gleichzeitig ist, und die extrazelluläre zelluläre Matrix Umbau, gefolgt schließlich von Zelle abscission 1, 2, 3. Eine falsche Organisation von zytokinetischen Ereignisse können zu Zellseparation und Ploidie Defekten führen und können Krankheiten wie Krebs 4 verursachen, 5, 6, 7, 8. Die grundlegenden Prinzipien, die ermöglichen organisation von zytokinetischen Ereignisse sind nicht gut verstanden, was zu Straßensperren in unserem Verständnis der Ätiologie dieser Krankheiten führt. Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) ist ein ausgezeichnetes Modellsystem cytokinesis aufgrund der konservierten Natur der beteiligten Proteine 1 studieren. In Spalthefe, nachdem Aktomyosin Ringanordnung tritt der Ring eine Reifung / Ruhephase , wo es nicht 9 nicht einengen. Ausreifung endet mit Beginn Actomyosinaktivität Schnürring, gleichzeitig mit Membran Runzeln und Septum ingression. Seminal Arbeit im Laufe der Jahre haben wir 1, ein ziemlich gutes Verständnis Actomyosinaktivität Ringanordnung in Spaltung 9, 10 Hefe gegeben. In einigen Eukaryonten, einschließlich Spalthefe, erfolgreiche Montage des Aktomyosin Ring ist für die Membran Runzeln nicht ausreichend. in fission Hefe, allein Schnürring ist jedoch nicht ausreichend Druckkraft interne turgor zu überwinden für Furche Bildung 11. Ein aktuelles Modell zeigt , dass diese Kraft anstelle von Septum ingression 11 vorgesehen ist. In einem anderen Modell hat sich die Rolle der Plasmamembran Erweiterung vorgeschlagen Bildung 12, 13 zu furchen beizutragen. Ring Verengung und Membran Runzeln treten nicht in Bgs1 / Cps1 temperaturempfindliche Mutante cps1-191, das Hauptenzym für die primäre Septenbildung 14, 15. Die Zellen Bgs1 zeigen defekte primäre Septum und verlängerte Ringverengung 15, fehlt 16. Bgs1 für Septum ingression während der Reifung zur Zellteilung Ort rekrutiert nach Aktomyosin Ringanordnung 17, 18. Similarly, während Zellularisierung in Drosophila - Embryos ist Schnürring zweiphasige mit einer deutlich langsamer initialer Einschnürung Rate 19, die Reifephase ähnelt in Spalthefe beobachtet. Biphasische Schnürring verlangsamen Membran Runzeln für eine ausreichende Membranausdehnungs 20 und Modifikation von extrazellulären Matrix zu ermöglichen. Dies deutet darauf hin, dass nach Aktomyosin Ringanordnung tritt Schnürring effizient nur dann, wenn die Zelle die Anforderungen für die Furche Bildung erfüllt hat. Es ist nicht gut verstanden, welche Bedingungen für Aktomyosin Schnürring nach Ringanordnung erforderlich sind, noch die molekularen Ereignisse, die diesen Prozess regulieren. Wir haben kürzlich gezeigt , dass Montage folgende Aktomyosin Ring die kleine GTPase Cdc42 ein einzigartiges Muster Raum - Zeit - Aktivierung unterzogen 21. Dieses Muster wird durch die einzigartige Lokalisierungsmuster der Austauschfaktoren Cdc42 Guanidin Nukleotid etabliert (GEFs), die Cdc42 aktivieren. Die GEF Gef1 lokalisiert an den Aktomyosin Ring montiert und fördert Einsetzen der Ringverengung und Septum ingression, während scd1 auf die furch Membran lokalisiert und fördert die normale Septenbildung. Wir finden, dass das Muster Cdc42 Aktivierung durch seine GEFs der Regulierung verschiedener zytokinetischen Ereignisse führen etabliert. Um den molekularen Mechanismus der Ereignisse zu verstehen, die schließlich folgende Aktomyosin Ringanordnung zur Trennung von Zellen führen, muss man die unterschiedlichen zytokinetischen Ereignisse in Zeit und Raum zu folgen. In Spalthefe beinhaltet Zytokinese zunächst die Montage von Vorläuferknoten um den Kern, die schließlich den Typ II Myosin rekrutieren, die formin CDC12 und anderen erforderlichen Proteine ​​zur Actomyosin Ringanordnung. Um Zeit einen Bezugsrahmen, ist die deutliche zytokinetischen Ereignisse und liefern die Trennung von Spindel Polkörper Marker (Spindelbildung) als Zeitpunkt 0 22 betrachtet. Die Montage von the Aktomyosin Ring kann durch die Überwachung im Laufe der Zeit die Intensität eines fluoreszierend markierten Aktomyosin Ring Protein wie der Typ-II-Myosin regulatorische leichte Kette RLC1 folgen. Hier haben wir einen mikroskopischen Ansatz beschreiben zu verschiedenen Stadien der Zellteilung im Laufe der Zeit zu analysieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract media</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>YES 225</td>
			<td>0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SeaKem LE agarose, Lonza</td>
			<td>50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottomed culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system</td>
			<td>Visitech International, UK</td>
			<td></td>
			<td>with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast

Zytokinese, der letzte Schritt in der Zellteilung ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Integrität Genoms. Proper Zytokinese ist wichtig für die Zelldifferenzierung und Entwicklung. Cytokinesis beinhaltet eine Reihe von Ereignissen, die in Zeit und Raum gut aufeinander abgestimmt sind. Cytokinesis beinhaltet die Bildung eines Aktomyosin Ring an der Teilungsebene, gefolgt von Ringverengung, Membran Furche Bildung und extrazellulären Matrixumbau. Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) ist ein gut untersuchtes Modellsystem , das mit erheblichen Klarheit die ersten Ereignisse in cytokinesis offenbart hat. Allerdings verstehen wir nicht klar, wie verschiedene zytokinetischen Ereignisse räumlich-zeitlich aufeinander abgestimmt sind. Um dies zu bestimmen, muss man die verschiedenen zytokinetischen Ereignisse in großen Details sowohl zeitlich als auch räumlich zu analysieren. Hier haben wir einen Mikroskopie-Ansatz beschreiben verschiedene zytokinetischen ev zu untersuchenents in lebenden Zellen. Mit diesem Ansatz ist es möglich, verschiedene zytokinetischen Ereignisse und bestimmen den Zeitpunkt der Rekrutierung von verschiedenen Proteinen während der Zellteilung zu Zeit. Darüber hinaus beschreiben wir Protokolle Proteinlokalisierung und Verteilung an der Stelle der Zellteilung zu vergleichen. Dies ist ein einfaches Protokoll Zytokinese in Spalthefe zu studieren, und kann auch für andere Hefen und Pilzsystemen verwendet werden.

Spalthefezellen den Ring Marker, RLC1-GFP (grün, Abbildung 2) und Spindel Polkörper Marker SAd1-mCherry (rot, Abbildung 2) exprimieren , wurden während der Zytokinese abgebildet. Einsetzen der Spindel - Pol - Körper - Marker (weißer Pfeil, Figuren 2A, B) mit der Zeit betrachtet wird 0. RLC1-GFP - Signal zum Zeitpunkt -4 min mit Bezug erscheint Polkörper Trennung der Spindel (roter Pfeil, 2A, 2B). RLC1-GFP - Signal bildet einen kont...

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Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe ist ein ausgezeichnetes Modellsystem cytokinesis studieren, die letzte Stufe in der Zellteilung. Hier haben wir einen Mikroskopie-Ansatz beschreiben verschiedene zytokinetischen Ereignisse in Live-Spalthefezellen analysieren.

Räumlich-zeitliche Analyse von zytokinetischen Events in Spalthefe

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

spatiotemporal-analysis-of-cytokinetic-events-in-fission-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Aufrufe.  University of Tennessee.  Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe ist ein ausgezeichnetes Modellsystem cytokinesis studieren, die letzte Stufe in der Zellteilung. Hier haben wir einen Mikroskopie-Ansatz beschreiben verschiedene zytokinetischen Ereignisse in Live-Spalthefezellen analysieren. 

Serie: Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Forschung

Biologie

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Raum-Zeit-Mapping der Motilität in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Vorbereitung des Darms

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D-Mikroskopie der Hefe

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...