Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen im Bereich der Hirnblutung wie Ätiologie, Verteilung und Nachweis von hirnmikroskopischer Hirnblutung usw. zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass LPS-Injektionen eine Entzündung stabil induzieren. Darüber hinaus ist die LPS-Injektion recht einfach, wirtschaftlich und kostengünstig.
Obwohl diese Methode Einblick in die Hirnblutungsinduktion geben kann, Kann es auch auf andere Erkrankungen des Gehirns wie Depression, Schizophrenie, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und Prion-Krankheit angewendet werden. Verabreichen Sie LPS in einer Dosis von einem Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht an 10 Wochen alte männliche Sprague Dawley Ratten durch intraperitoneale Injektion, dann jede Ratte in den heimischen Käfig zurück. Wiederholen Sie die LPS-Injektion nach sechs Stunden und 16 Stunden.
Bitte beachten Sie, dass die Injektion von SD-Ratten mit LPS in einer Dosis von einem Milligramm pro Kilogramm zu einer Sterblichkeit von 5 % führen kann. Die Sterblichkeit könnte bei jüngeren oder älteren Ratten oder schwangeren weiblichen Ratten weiter zunehmen. Bringen Sie die Ratten nach der LPS-Injektion in ihre Käfige zurück und bieten Sie ad libitum Zugang zu Nahrungsmitteln und Getränken.
Führen Sie unter Terminalanästhesie eine fünf bis acht Millimeter tiefe Herzpunktion an jeder Ratte durch. Der Punktionspunkt sollte fünf Millimeter zum linken Rand des Brustbeins im dritten und vierten interkostalen Raum sein. Halten Sie die Nadel an Ort und Stelle und ersetzen Sie das leere Rohr durch ein Rohr mit Evans blau.
Warten Sie, bis die Bluterholung beobachtet wird, und injizieren Sie Evans blau in einer Dosis von 0,2 Milliliter pro 100 Gramm Körpergewicht in den linken Herzventrikel. Halten Sie die Ratte in einer Supine-Position für 10 Minuten, wenn Sie Evans blaue Leckage durch die Blut/Hirn-Schranke durch Immunfluoreszenz-Bildgebung beurteilen. Führen Sie Herzperfusionen mit eiskalten 200 bis 300 Millilitern 0,9% Salinelösung durch, um die zerebrale Vaskulatur und gehirn zu löschen.
Wechseln Sie zur Fixierung auf eiskaltes 4%Paraformaldehyd. Dann, nach der Isolierung des Gehirns, tauchen Sie es in 20%Saccharose in PBS für mindestens sechs Stunden oder bis das Gehirn auf den Boden der Röhre sinkt. Ändern Sie die Lösung auf 30%Saccharose und fixieren Sie sie für weitere sechs Stunden.
Schließlich bereiten Sie 10 Millimeter dicke Hirngewebeabschnitte mit einem Kryostat vor. Waschen Sie die Dias dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS, dann inkubieren Sie Dias mit 4, 6'diamidino-2-phenylindole oder DAPI Lösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen der Dias in PBS wie zuvor, montieren Sie die Dias mit PBS-Glyzerin-Lösung.
Erfassen Sie Bilder auf einem Fluoreszenzmikroskop. Die EB-Abscheidung wird durch rote Fluoreszenz angezeigt, Kerne sind durch blaue Fluoreszenz gekennzeichnet. Beginnen Sie mit der H&E-Färbung, indem Sie die Dias in destilliertem Wasser waschen.
Dann tauchen Sie acht Minuten lang in Hämatoxylinlösung ein. Alternativ für Perl preußische blaue Färbung, Färbung in Reaktionslösung mit gleichen Teilen Mischung von Ferrocyanid und Salzsäure für 10 Minuten. Nach der Färbung fünf Minuten lang in fließendem Leitungswasser waschen.
In 1%säurealkohol für 30 Sekunden differenzieren. Nach dem Waschen in fließendem Leitungswasser für eine Minute, Flecken in 0,2%Ammoniak-Wasser oder gesättigte Lithium-Carbonat-Lösung für 30 Sekunden bis eine Minute. Als nächstes fünf Minuten in fließendem Leitungswasser waschen.
Gegenfleck mit Eosin-Lösung für 30 Sekunden bis eine Minute. Dehydrieren Sie durch 90%Alkohol, dann 95% Alkohol und absoluten Alkohol für jeweils 0,5 bis zwei Minuten. Nach der Austrocknung 30 Sekunden lang in Xylol löschen.
Analysieren Sie nach der Montage die H&E-Färbung mit einem Hellfeldfluoreszenzmikroskop. Die roten Blutkörperchen, die aus den Blutgefäßen freigesetzt werden, die Bestandteile der CMHs sind, erscheinen in rot-orange unter H&E-Färbung. Oberflächen-CMHs können durch grobe Beobachtung erkannt werden, wie durch die roten Pfeile angezeigt.
Evans blaue Färbung zeigt sichtbare rote Fluoreszenz, wo Evans blaue Moleküle aus einer verletzten Blut -Hirn-Schranke austraten. Die H&E-Färbung zeigt rote Blutkörperchen außerhalb der Kapillaren, und preußische Färbung zeigt eisenrote Ionenpunkte, die aus der Lyse roter Blutkörperchen abgeleitet sind. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Dosis von LPS, um zerebrale Mikroblutungen zu induzieren, größer ist als die, die bei Parkinson-Krankheit oder Schizophrenie-Modell verwendet wird.
Daher sollte die Umwelt der Tiere sauber gehalten werden, um die Sterblichkeitsrate zu senken. Im Anschluss an dieses Verfahren könnten andere Methoden wie Elektronenmikroskopie, Magnetresonanztomographie und immunfluoreszierende Bildgebung durchgeführt werden, um die Schädigung der äußeren Struktur der Blut-Hirn-Schranke bei hirn-Hirn-Blutungen, die Verteilung von hirnmikroskopischen Mikroblutungen im Blutparenchym in vivo sowie die Gliazellaktivierung zu bestimmen.
