Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine weit verbreitete Demyelinisierung des Kortex beider Gehirnhemisphären in einem Rattenmodell unter Verwendung einer subklinischen Immunisierung gegen Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein zu erzeugen, gefolgt von einer interessanten zerebralen Injektion von Zytokinen durch einen implantierten Katheter. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei entzündlichen demyelinisierungsfördernden Erkrankungen des Gehirns wie Multipler Sklerose zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine entzündungsinduzierte Demyelinisierung der grauen Substanz im Kortex beider Gehirnhemisphären erzeugen kann, ohne zu Pfropfen der weißen Substanz zu führen.
Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf ein besseres Verständnis der Mechanismen der kortikalen Demyelinisierung, die hauptsächlich bei progressiven Arten von Multipler Sklerose beobachtet wird. Um diesen Vorgang zu beginnen, montieren Sie den Katheter und die Katheterkappe mit dem Einlass. Als nächstes schneiden Sie den Katheter mit einem Skalpell auf eine Länge von zwei Millimetern.
Dann rasieren Sie den Kopf einer betäubten Ratte zwischen den Ohren mit dem Elektrorasierer. Legen Sie die Ratte in den stereotaktischen Rahmen und befestigen Sie ihren Kopf mit den Ohrbügeln und der Bissplatte. Stellen Sie sicher, dass der Kopf horizontal ist und überprüfen Sie seine Stabilität, indem Sie mit dem Finger oder der Zette Druck auf ihn ausüben.
Tragen Sie anschließend schmierende Augentropfen auf, um Hornhauttrockenheit während der Operation zu verhindern, bedecken Sie die Augen mit einem undurchsichtigen Material, um eine chirurgische Lichtexposition zu verhindern. Als nächstes reinigen Sie den rasierten Bereich, indem Sie abwechselnd 70% Ethanol und 10% Povidon-Jodkomplex auftragen. Um den Katheter zu implantieren, machen Sie einen Längsschnitt von etwa zwei Zentimetern Länge entlang der Mittellinie.
Verwenden Sie dann Bulldoggenklemmen, um die Haut an den Seiten zu halten. Entfernen Sie das Blut mit einem Baumwollspitzenapplikator. Danach entfernen Sie das Periost, reinigen Sie das Gewebe mit dem Baumwollspitzenapplikator, legen Sie den Schädel frei und lassen Sie ihn etwa eine Minute trocknen.
Als nächstes identifizieren Sie die anatomischen Orientierungspunkte, Lambda, Bregma und mediale Naht. Wenn der Bohrer auf dem stereotaktischen Rahmen installiert ist, positionieren Sie die Spitze des Bohrers an der Bregma als Ausgangspunkt. Bewegen Sie zwei Millimeter hinter dem Bregma und 2,4 Millimeter seitlich zur medialen Naht.
Bohren Sie dann an dieser Stelle ein Loch mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern für den Katheter. Bohren Sie drei weitere Löcher mit 1,3 Millimeter Durchmesser für die Ankerschrauben wenige Millimeter vom ersten Loch entfernt. Entfernen Sie den Knochenstaub durch Bewässerung mit etwa ein bis zwei Millilitern sterilem PBS und reinigen Sie den Schädel.
Anschließend ziehen Sie die Ankerschrauben um zwei bis drei volle Umdrehungen fest. Führen Sie einen zwei Millimeter langen Katheter durch das erste Loch senkrecht zur Schädeloberfläche ein. Während Sie den Katheter noch halten, tragen Sie etwas Zahnzement auf und lassen Sie ihn unter kurzer Einwirkung des Zahnhärtungslichts polymerisieren, um den Katheter zu stabilisieren.
Dann tragen Sie mehr Zahnzement um den Katheter auf, verankern Sie die Schrauben und erstarren Sie den Zahnzement mit dem Zahnhärtungslicht für etwa 15 bis 30 Sekunden, bestätigen Sie, dass der Zement gehärtet ist. Nach der Implantation die Haut mit resorbierbaren Nähten anterior und posterior zum Katheter verschließen. Dann injizieren Sie die Gegenmittelmischung subkutan.
Als nächstes verabreichen Sie 2,5% Enrofloxacin durch subkutane Injektion zur prophylaktischen Antibiotikabehandlung. Bringen Sie das Tier in den modifizierten Käfig zurück und halten Sie es ein bis drei Stunden lang unter Beobachtung mit Infrarotlicht, um Unterkühlung zu vermeiden. Wiederholen Sie die Enrofloxacin-Behandlung und verabreichen Sie Carprofen bei einem Milligramm pro Milliliter subkutan zur Schmerzlinderung durch Injektion am Tag nach der Operation.
Um die Impfmischung vorzubereiten, verbinden Sie zwei 10-Milliliter-Glasspritzen mit der unteren Verschlussspitze an die kurzen Arme eines Drei-Wege-Absperrhahns und schließen Sie den dritten Auslass mit dem langen Arm. Als nächstes pipetten Sie einen Milliliter IFA und 50 Mikrogramm rMOG zusammen. Und stellen Sie die Mischung mit sterilem PBS auf ein Endvolumen von zwei Millilitern ein.
Legen Sie das verdünnte IFA- und rMOG-Gemisch in die offene Spritze und führen Sie den Kolben vorsichtig ein, während Sie einen losen Druck auf den gegenüberliegenden Kolben aufrechterhalten. Emulgieren Sie das Inokum, indem Sie es von einer Spritze zur anderen treiben, indem Sie die Kolben hin und her schieben, bis es weiß und viskos ist. Als nächstes befestigen Sie eine ein Milliliter untere Sicherungsspritze am offenen kurzen Arm des Drei-Wege-Absperrhahns und füllen Sie sie mit Inokum.
Verteilen Sie das gesamte Inoculum auf ein Milliliter Spritzen und halten Sie sie bis zur Injektion auf Eis. Anschließend werden 200 Mikroliter der IFA- und rMOG-Mischung subkutan an der Schwanzbasis unter einer temporären Isoflurananästhesie mit einer 21-Gauge-Nadel injiziert. Für die intrazerebrale Zytokininjektion stellen Sie die Länge der Anschlusskanüle auf zwei Millimeter ein.
Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit der Zytokinmischung. Verbinden Sie dann die Spritze mit der Anschlusskanüle. Als nächstes füllen Sie die Kanüle mit der Zytokinmischung und vermeiden Sie die Schaffung von Blasen.
Montieren Sie dann die Spritze auf die programmierbare Spritzenpumpe und programmieren Sie sie so, dass sie mit einer Rate von 0,2 Mikrolitern pro Minute injiziert wird. Starten Sie die Pumpe und halten Sie sie am Laufen, um eine Luftblasenbildung an der Spitze der Kanüle zu vermeiden. Danach entfernen Sie die Katheterkappe mit dem Einlass.
Setzen Sie die Anschlusskanüle in den Katheter ein, schrauben und festziehen Sie sie. Lassen Sie dann die Injektion 10 Minuten lang fortgesetzt werden, bevor Sie die Pumpe stoppen. Lassen Sie die Kanüle 20 Minuten im Katheter, damit das injizierte Volumen vollständig diffundieren kann.
Anschließend schrauben Sie die Anschlusskanüle ab und entfernen Sie sie langsam, um einen Vakuumeffekt zu vermeiden. Befestigen Sie die Katheterkappe wieder mit dem Einlass und schrauben Sie sie. Lassen Sie das Tier sich von der Anästhesie in einem Käfig erholen.
Die kortikale Demyelinisierung konnte zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer Zytokininjektion durch Immunhetochemie für PLP beurteilt werden. Abbildung 6A zeigt eine intakte PLP-Immunreaktivität am Tag 15 bei einem moggy immunisierten Kontrolltier, das nur steriles PBS über den implantierten Katheter erhielt. Bereits am ersten Tag nach der Zytokininjektion konnte bei MOG-Prime-Tieren eine Demyelinisierung nachgewiesen werden.
Allerdings nur in unmittelbarer Nähe des katheterisierten Bereichs. Die PLP-Immunreaktivität bleibt im kontralateralen Kortex eines Tages nach der Zytokininjektion intakt. Am dritten Tag konnte ein allmählicher Anstieg des Verlustes der PLP-Immunreaktivität beobachtet werden, die sich im ipsilateralen Kortex ausbreitet.
Eine kontralaterale kortikale Demyelinisierung konnte auch am dritten Tag nachgewiesen werden, ist jedoch eher auf den Bereich unter den Ankerschrauben beschränkt. Zwischen den Tagen neun bis 15 betrifft die Demyelinisierung große Teile des Kortex beider Hemisphären. Die kortikale Demyelinisierung wird bis zu 30 Tage nach der Zytokininjektion in beiden Hemisphären mit nur einer partiellen Remyelinisierung aufrechterhalten.
Abbildung 6J zeigt eine Quantifizierung des PLP-Verlustes in der kortikalen grauen Substanz nach der intrazerebralen Zytokininjektion. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Demyelinisierung der grauen Substanz durch subklinische Immunisierung gegen Myelinproteine erzeugen können, gefolgt von der intrazerebralen Injektion von Zytokinen durch den implantierten Katheter. Dieses Tiermodell könnte Forschern bei der Untersuchung progressiver Arten von Multipler Sklerose helfen, Schicht-Grau-Substanz-Demyelinisierung ist eine ganze Marke.
Der implantierte Katheter ermöglicht mehrere Runden der Demyelinisierung oder interzerebralen Verabreichung potenzieller therapeutischer Medikamente, die sich einer präklinischen Untersuchung unterziehen, ohne ein injektionsinduziertes Trauma zu verursachen.
