Unser Protokoll bietet eine neuartige Methodik zur Entstehung traumatischer Hirnverletzungen bei Ratten, die Laserbestrahlung verwenden, um einen Fokuseinfluss im motorischen Kortex zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Technik sind die geringe Variabilität im Infarktbereich, die niedrigen Sterblichkeitsraten und die relative Einfachheit des Verfahrens, die keine fachkundigen Handler erfordert. Demonstriert wird das Verfahren von Dmitry Natanel, einem Forscher aus unserem Labor.
Um eine laserinduzierte Hirnverletzung durchzuführen, weisen Sie zunächst 20, 300 bis 350 Gramm Sprague Dawley Ratten in die Lasergruppe und 20 der Von Sham betriebenen Gruppe zu. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Entzugsreflex, legen Sie eine Ratte auf eine rektale Temperatur geregeltHeizung Pad und verwenden Sie einen Rasierer, um genügend Haare von der Verletzungsstelle mit einem etwa zwei Zentimeter haarfreien Rand um den Schnitt zu entfernen. Desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 70% Ethanol und legen Sie die Ratte in die anfällige Position in einem stereotaxic Kopfhalter.
Machen Sie einen drei Zentimeter großen Schnitt, um eine seitliche Reflexion der Kopfhaut zu ermöglichen, um den Bereich zwischen Bregma und Lambda freizulegen. Halten Sie einen Nd:YAG-Laser mit einer Spitzenwellenlänge von 1064 Nanometern in einem Abstand von zwei Millimetern vom Schädel, verabreichen Sie 50 Joule mal 10 Punkte mit einer Pulsdauer von einer Sekunde auf den exponierten Bereich des Schädels über der rechten Hemisphäre. Nachdem die Laserverletzung geliefert wurde, entfernen Sie die Ratte aus dem Gerät und schließen Sie die Kopfhaut mit 3-0 Seide chirurgische Nähte.
Dann legen Sie die Ratte in ihren Käfig mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. 24 Stunden nach dem Eingriff verwenden Sie ein 43-Punkte-Scoring-System, um den neurologischen Schweregrad zu bewerten. Testen der Tiere auf neurologische Defizite, Verhaltensstörungen, Strahlausgleichsaufgabe und Reflexe und Zuweisung höherer Werte für schwerere Behinderungen.
Nach der Bewertung ernten Sie die Gehirne von jedem Versuchs- und Kontrolltier nach Standardprotokollen. Zur Beurteilung des Hirninfarktvolumens schneiden Sie die geernteten Gehirne in sechs zwei Millimeter dicke koronale Scheiben und bebrüten jede Scheibe in 0,05%TTC für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Scannen Sie diese Scheiben nach der Färbung mit einem optischen Scanner mit einer Auflösung von 1600 mal 1600 Punkten pro Zoll.
Die ungefärbten Bereiche der fixierten Hirnscheiben werden als infarkt definiert. Um die Inzidenz von Blut-Hirn-Schrankenbruch zu bewerten, laden 24 Stunden nach der laserinduzierten Verletzung eine Spritze mit 2%Evans blauer Farbstoff in vier Milliliter pro Kilogramm Salinelösung verdünnt und liefern die Lösung intravenös an die verletzten und Kontrollieren Ratten über die kanülierte Schwanzvene. Lassen Sie die Lösung für eine Stunde zirkulieren, bevor Sie chirurgische Pinceten und Schere verwenden, um die Brust des ersten Tieres zu öffnen.
Durchdringen Sie das exponierte Herz mit gekühlten 0,9%saline über die linke Herzkammer bei 110 Millimeter Quecksilber Druck, bis eine farblose Überflussflüssigkeit vom rechten Vorhof beobachtet wird. Als nächstes ernten Sie das Gehirn und erhalten zwei Millimeter rostrale kaudalen Scheiben. Trennen Sie die linken Gehirnscheiben von den rechten Gehirnscheiben, um die Auswertung der verletzten und nicht verletzten Hemisphären getrennt zu ermöglichen, und wiegen Sie die Proben.
Homogenisieren Sie die Proben mit einem Mörtel und Stößel und inkubieren Sie die Gewebeproben in 50% Trichloressigsäure für 24 Stunden. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die homogenisierten Hirngewebeproben 20 Minuten lang bei 10.000 mal G und Raumtemperatur und mischen Sie einen Milliliter des Überstandes mit 1,5 Millilitern 96%Ethanol im Verhältnis eins zu drei. Verwenden Sie dann einen Fluoreszenzdetektor bei einer 620-Nanometer-Erregung und der 680-Nanometer-Emissionswellenlänge, um den Bruch der Blut-Hirn-Schranke zu bewerten.
Wie durch histologische Analyse beobachtet, kann Evans blaue Färbung verwendet werden, um die Inzidenz von Hirnverletzungen bei Laser- und MCAO-Modelltieren zu zeigen. In dieser repräsentativen Analyse wurden weder Todesfälle noch subarachnoidale Blutungen in den Kontroll- oder Versuchsgruppen registriert, und die MCAO-Gruppe wies eine Sterblichkeitsrate von 20 % auf und eine subarachnoidale Blutung. Die relativen Veränderungen der Körpertemperatur bei den Ratten beider Gruppen waren ebenfalls ähnlich, trotz eines Unterschieds in der Variabilität beider Gruppen.
Die neurologischen Schweregrade waren sowohl bei den Laser- als auch bei den MCAO-Modellen signifikant schlechter als bei der von Sham betriebenen Kontrollgruppe. Laserinduzierte Hirnverletzungen verursachten auch eine signifikante Zunahme des Infarktvolumens auf der Zielhalbkugel im Vergleich zur von Sham betriebenen Kontrollgruppe. Das Infarktvolumen des Lasermodells war jedoch im Vergleich zu den durch die MCAO-Technik verletzten Tieren geringer.
Es wurde kein Unterschied bei Hirnödemen zwischen dem laserinduzierten Hirnverletzungsmodell und der von Sham betriebenen Kontrollgruppe beobachtet. Es gab jedoch einen signifikanten Unterschied bei Hirnödemen zwischen dem Lasermodell und den MCAO-verletzten Gruppen. Im Vergleich zur Sham-betriebenen Kontrollgruppe verursachten die laserinduzierten Hirnverletzungen und MCAO-Techniken einen signifikanten Anstieg des Blut-Hirnschrankenbruchs an den nicht verletzten und Zielhalbkugeln.
Denken Sie beim Versuch dieses Modells daran, die Motorkortexfläche genau ins Visier zu nehmen und die Energie, die Anzahl der bestrahlten Punkte und die gesamte Expositionszeit zu standardisieren. Nach diesem Verfahren kann eine Vielzahl von Verhaltenstests durchgeführt werden, wie Z. B. Balkenwandern, Froedert und andere Auswertungen.
