Der Hauptvorteil dieses plattenbasierten Trübungstests ist, dass er schnell ist und es ermöglicht, mehrere Amyloid-Beta-Fibrinogen-Wechselwirkungshemmer sofort ohne ausgeklügeltes Setup oder Anforderungen zu überprüfen. Die Kopfverbindungen, die sich im Fibrin-Trübungstest befinden, können weiter auf ihre Fähigkeit untersucht werden, A-Beta-induzierte strukturelle Anomalien in den fibrin-Gerinnseln wiederherzustellen, die durch Rasterelektronenmikroskopie analysiert werden. Die visuelle Demonstration der Gerinnselvorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie-Analyse ist von entscheidender Bedeutung, da Abweichungen in der Präparation zu Variationen innerhalb der experimentellen Ergebnisse beitragen können.
Der Schwerpunkt dieser Demonstration liegt hier auf A-Beta-Fibrinogen-Wechselwirkungen. Dieses Protokoll kann leicht modifiziert werden, um andere Wechselwirkungen mit anderen Proteinen und den Verbindungen mit dem Fibringer zu analysieren. Beginnen Sie mit 1,5 Mikromolaren frisch zubereitetem Fibrinogen in 200 Mikroliter gerinnungsbildendem Puffer zu jedem A-beta-Negativ 42, das Brunnen enthält und kontrolliert, und brütedien Sie die Platte auf einer rotierenden Plattform bei Raumtemperatur.
Nach 30 Minuten gleichzeitig 30 Mikroliter frisch zubereitete Thrombinlösung direkt in das Zentrum des fibrinogenhaltigen Brunnens geben, um die Gerinnselbildung zu initiieren und sofort die Absorption der In-vitro-Gerinnsel bei 350 Nanometern zu lesen, wobei die Messung im Laufe von 10 Minuten alle 30 bis 60 Sekunden wiederholt wird. Um die Wirkung von A-Beta-Fibrinogen-Wechselwirkungshemmern auf die Fibrin-Gerinnselstruktur zu bewerten, verwenden Sie zunächst Zangen, um saubere, 12 Millimeter silikonisierte Glaskreisabdeckung zu einzelnen Bohrungen einer 12-Well-Platte zu platzieren und 80 Mikroliter Fibrinogen auf jeden Deckelschlupf zu legen, wobei die Lösung sanft verteilt wird, so dass sie gleichmäßig verteilt werden. Fügen Sie 20 Mikroliter Thrombin-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen, um die Gerinnselbildung zu initiieren.
Bedecken Sie die Platte für eine 30 bis 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur, dann tauchen Sie jedes Gerinnsel vorsichtig in zwei Milliliter eiskalten NatriumkokodilatPuffer für zwei Minuten, bedeckt, bei Raumtemperatur zwei Mal, mit einer Ein-Milliliter-Pipette, um vorsichtig den Puffer nach jeder Wäsche zu entfernen. Nach der letzten Wäsche den Status der Gerinnselbildung auf dem Decksschlupf überprüfen und die Gerinnsel 30 Minuten lang in zwei bis drei Milliliter eiskaltem 2%glutaraldehyd auf Eis fixieren. Am Ende der Inkubation das Glutaraldehyd aus jedem Brunnen vorsichtig entfernen und die Gerinnsel mit frischem Natriumkakodilatatpuffer waschen, wie auf Eis gezeigt.
Hydratisieren der festen Gerinnsel in einer abgestuften Serie von fünfminütigen eiskalten Ethanol-Wassaufenthalten auf Eis, ohne das Ethanol zwischen den Wärteilen vollständig zu entfernen, um die Gerinnsel vor Luftexposition zu schützen. Während der letzten 100%Ethanol-Wäsche die Deckelschlupfin in einen kritischen Punkttrockner-Probenhalter übertragen, mindestens 1 Scheibe zwischen jedem Abdeckungsschlupf platzieren und den Halter in eine mit Ethanol gefüllte kritische Punkttrocknerkammer legen. Verwenden Sie nach einem 30-minütigen Trocknungszyklus Mit Kohleband die Deckelschlupfe an einzelnen Rasterelektronenmikroskopie-Stubs und übertragen Sie die Proben in die Sputter-Beschichtungskammer eines Vakuum-Sputterlackierers.
Dann spritzen Sie weniger als 20 Nanometer Goldpalladium oder andere leitfähige Materialien für 25 Sekunden bei vier Angstroms pro Sekunde auf die Proben und stellen die Proben auf einem Rasterelektronenmikroskop ab, das mit einem Sekundärelektronendetektor Typ 2 bei vier Kilovolt ausgestattet ist. Die Fibrin-Gerinnselbildung bewirkt eine Streuung des Lichts, das durch die Lösung geht, was zu einer erhöhten Trübung führt, die am Ende der Leseperiode hochist. Wenn das Fibrinogen in Gegenwart von A-beta 42 inkubiert wird, nimmt die Trübung der Lösung ab, wobei die Kurve eine maximale Höhe von etwa der Hälfte der von Fibrinogen allein erreicht.
In Gegenwart eines A-beta 42-Interaktionsblockers wird die Wirkung von Beta-Amyloid gemildert und die Trübung ist höher als bei A-beta allein. Die Wirkung des Blockers erscheint nicht aufgrund der Hintergrundtrübung, da die Verbindung die Trübung des Fibringerflecks nicht verändert, wenn A-beta fehlt. Darüber hinaus zeigt die Gerinnselbildung in Gegenwart von GPRP, einem Peptid, das bekanntermaßen die Fibrinpolymerisation stört, eine signifikant reduzierte Trübung im Vergleich zur Fibringerengerbildung in Abwesenheit des Inhibitors.
Fibrinogen, das in Gegenwart von Thrombin und Calciumchlorid erzeugt wird, bildet nur ein Fibringewebe mit längenden und interkalierten Fibrinfäden sowie größeren Bündeln. Wenn A-beta vorhanden ist, wurden die Fibrinfäden dünner mit mehreren klebrigen Klumpen in Aggregaten, was auf A-Beta-induzierte strukturelle Anomalien hindeutet. In Übereinstimmung mit den Trübungs-Assay-Ergebnissen stellt die Gerinnselbildung in Gegenwart eines A-beta-Fibrinogen-Interaktionsblockers teilweise die Struktur des Fibringer aus den A-Beta-induzierten Veränderungen wieder her, da bei dieser Behandlung weniger Klumpen beobachtet werden.
Die Analyseprotokolle "Gerinnseltrübungstest" und "Rasterelektronenmikroskop" wurden für die schnelle und reproduzierbare Bewertung mehrerer A-beta-Fibrinogen-Wechselwirkungshemmer optimiert. Und bald werden Daten wertvolle Informationen über die Bildung von Fibrin-Gerinnsel liefern, die sowohl in vitro als auch in vivo auf weitere Studien angewendet werden können.
