이 플레이트 기반 탁도 분석의 주요 장점은 빠르며 정교한 설정이나 요구 사항없이 여러 아밀로이드 베타 피브리노겐 상호 작용 억제제를 한 번에 선별 할 수 있다는 것입니다. 피브린 탁도 분석에 있는 헤드 화합물은 전자 현미경 검사를 스캔하여 분석된 피브린 혈전에서 A-베타 유도 된 구조적 이상을 복원하는 능력에 대해 더욱 평가될 수 있다. 전자 현미경 분석을 스캔하기 위한 혈전 제제의 시각적 데모는 제제의 모든 변화가 실험 결과 내의 변화에 기여할 수 있기 때문에 매우 중요합니다.
이 데모의 초점은 A-베타 피브리노겐 상호 작용에 있습니다. 이 프로토콜은 다른 단백질및 피브린 응고와의 화합물과의 다른 상호 작용을 분석하기 위해 쉽게 변형될 수 있다. 먼저 200마이크로리터의 응고 형성 버퍼에 갓 준비된 피브리노겐 1.5 마이크로몰라를 각 A-베타 네거티브(42)에 첨가하여 우물을 포함하고 제어하고 실온에서 회전 플랫폼에서 플레이트를 배양한다.
30분 후, 30분 동안 새로 준비된 트롬빈 용액 30마이크로리터를 피브리노겐 함유 의 중앙에 직접 추가하여 혈전 형성을 시작하고 즉시 350나노미터에서 체외 혈전의 흡수를 판독하여 10분 동안 30~60초마다 측정을 반복합니다. 피브린 응고 구조에 대한 A-베타 피브리노겐 상호 작용 억제제의 효과를 평가하기 위해 먼저 집게를 사용하여 12웰 플레이트의 개별 우물에 12mm 실리콘 유리 원 덮개 를 넣고 80 마이크로리터의 피브리노겐을 각 커버 슬립에 부드럽게 추가하여 용액을 균등하게 분산시합니다. 혈전 형성을 시작하기 위해 각 웰에 20 마이크로리터의 혈전 용액을 추가합니다.
실온에서 30~60분 동안 배양한 다음, 각 응고를 2밀리리터의 얼음냉나트륨 소염 버퍼에 2밀리리터로 부드럽게 담근 다음, 실온에서 두 번, 1밀리리터 파이펫을 사용하여 각 세척 후 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 마지막 세척 후, 커버 슬립에 응고 형성의 상태를 확인하고 30 분 동안 얼음에 얼음 차가운 2 % 글루타랄데히드의 2 ~ 3 밀리리터에 혈전을 수정합니다. 인큐베이션이 끝나면 각 우물에서 글루타랄데히드를 부드럽게 제거하고 얼음위에서 보여준 것처럼 신선한 나트륨 캐코디레이트 버퍼로 혈전을 씻습니다.
공기 노출로부터 응고를 보호하기 위해 워시 사이에 에탄올을 완전히 제거하지 않고 얼음 에탄올을 완전히 제거하지 않고 얼음에 5분 짜리 얼음 차가운 에탄올 의 등급 시리즈에서 고정 된 혈전을 수화한다. 마지막 100% 에탄올 세척 중에 커버 슬립을 임계 점 건조기 샘플 홀더로 옮기고 각 커버 슬립 사이에 적어도 1 개의 와셔를 배치하고 홀더를 에탄올로 채워진 임계 점 건조기 챔버에 놓습니다. 30분간의 건조 주기 후에는 카본 테이프를 사용하여 개별 스캐닝 전자 현미경 스텁에 커버 슬립을 장착하고 샘플을 진공 스퍼터 코팅 소터의 스퍼터 코팅 챔버로 옮기십시오.
그런 다음 초당 4개의 협스트롬에서 25초 동안 20나노미터 미만의 금 팔라듐 또는 기타 전도성 물질에 스퍼터 코트를 코팅하고 4킬로볼트에서 2형 이차 전자 검출기를 장착한 스캐닝 전자 현미경의 샘플을 이미지화한다. 피브린 응고 형성은 용액을 통과하는 빛의 산란을 일으켜 판독 기간이 끝날 때 고원도가 증가합니다. Fibrinogen이 A-베타(42)의 존재에서 배양되면 용액의 탁도가 감소하며 곡선은 피브리노겐의 약 절반높이에 도달한다.
A-베타 42 상호 작용 차단제의 존재에서 베타 아밀로이드의 효과는 개량되고 탁도는 혼자 A-베타와 그보다 높다. 차단기의 효과는 A-베타가 없을 때 화합물이 피브린 응고 탁도를 변경하지 않기 때문에 배경 탁도로 인해 나타나지 않습니다. 또한, 피브린 중합화를 방해하는 것으로 알려진 펩티드인 GPRP의 존재내 응고 형성은 억제제의 부재 시 피브린 응고 형성에 비해 현저히 감소된 탁도를 나타낸다.
혈전과 염화칼슘이 존재하여 생성된 피브리노겐은 피브린의 길쭉하고 상호 연관된 실과 더 큰 번들로만 피브린 메쉬를 형성합니다. A-베타가 존재할 때, 피브린 스레드는 골재에 여러 끈적끈적한 덩어리로 얇아졌고, 이는 A-베타 유도된 구조적 이상을 나타냅니다. 탁도 분석 결과와 일치하여, A-베타 피브리노겐 상호 작용 차단제의 존재내 응고 형성은 이 치료법으로 더 적은 덩어리가 관찰됨에 따라 A-베타 유도 된 변화로부터 피브린 응고의 구조를 부분적으로 복원한다.
응고 탁도 분석 및 스캐닝 전자 현미경 분석 프로토콜은 여러 A-베타 피브리노겐 상호 작용 억제제를 빠르고 재현 가능한 방식으로 평가하기 위해 최적화되었습니다. 그리고 곧 데이터는 시험관 내 및 생체 내 의 추가 연구에 적용 될 수있는 피브린 응고 형성에 대한 귀중한 정보를 제공 할 것입니다.
