La principal ventaja de este ensayo de turbidez basado en placas es que es rápido y permite que varios inhibidores de la interacción amiloide-beta fibrinógeno se torsen a la vez sin una configuración o requisitos sofisticados. Los compuestos de la cabeza que se encuentran en el ensayo de turbidez de la fibrina se pueden evaluar aún más por su capacidad para restaurar la anormalidad estructural inducida por A-beta en los coágulos de fibrina analizados por microscopía electrónica de barrido. La demostración visual de la preparación del coágulo para el análisis de microscopía electrónica de barrido es fundamental, ya que cualquier variación en la preparación puede contribuir a variaciones dentro de los resultados experimentales.
El enfoque de esta demostración aquí es en las interacciones de fibrinógeno A-beta. Este protocolo se puede modificar fácilmente para analizar otras interacciones con otras proteínas y los compuestos con el coágulo de fibrina. Comience añadiendo 1,5 micromolares de fibrinógeno recién preparado en 200 microlitros de tampón de formación de coágulos a cada A-beta negativo 42 que contiene y controla pozos e incubar la placa en una plataforma giratoria a temperatura ambiente.
Después de 30 minutos añadir simultáneamente 30 microlitros de solución de trombina recién preparada directamente en el centro del pozo que contiene fibrinógenos para iniciar la formación de coágulos y leer inmediatamente la absorbancia de los coágulos in vitro a 350 nanómetros, repitiendo la medición cada 30 a 60 segundos en el transcurso de 10 minutos. Para evaluar el efecto de los inhibidores de la interacción con fibrinógeno A-beta en la estructura del coágulo de fibrina, primero utilice fórceps para colocar limpio, la cubierta del círculo de vidrio siliconizado de 12 milímetros se desliza a los pozos individuales de una placa de 12 pozos y añadir 80 microlitros de fibrinógeno en cada resbalón de la cubierta, extendiendo suavemente la solución para que se distribuyan uniformemente. Añadir 20 microlitros de solución de trombina a cada pozo para iniciar la formación de coágulos.
Cubra el plato durante una incubación de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, luego sumerja suavemente cada coágulo en dos mililitros de tampón de cacodilato de sodio helado durante dos minutos, cubierto, a temperatura ambiente dos veces, usando una pipeta de un mililitro para retirar cuidadosamente el tampón después de cada lavado. Después del último lavado, compruebe el estado de la formación de coágulos en el resbalón de la cubierta y fije los coágulos en dos o tres mililitros de hielo 2%glutaraldehído sobre hielo durante 30 minutos. Al final de la incubación, retire suavemente el glutaraldehído de cada pocópido y lave los coágulos con tampón de cacodilato de sodio fresco como se demuestra en el hielo.
Hidratar los coágulos fijos en una serie de cinco minutos de etanol helado de cinco minutos se lava sobre hielo sin eliminar completamente el etanol entre los lavados para mantener los coágulos protegidos de la exposición al aire. Durante el último lavado de etanol al 100%, transfiera los resbalones de la cubierta a un portacuchillas de secador de puntos críticos, colocando al menos 1 arandela entre cada resbalón de cubierta y coloque el soporte en una cámara de secadora de punto crítico llena de etanol. Después de un ciclo de secado de 30 minutos, utilice cinta de carbono para montar los resbalones de la cubierta en talones de microscopía electrónica de barrido individuales y transfiera las muestras a la cámara de recubrimiento de pulverización de una cinta de vacío.
A continuación, cubra menos de 20 nanómetros de paladio de oro u otros materiales conductores en las muestras durante 25 segundos a cuatro angstroms por segundo e imagine las muestras en un microscopio electrónico de barrido equipado con un detector de electrones secundario tipo dos a cuatro kilovoltas. La formación de coágulos de fibrina provoca la dispersión de la luz que pasa a través de la solución, lo que resulta en un aumento de la turbidez que se al final del período de lectura. Cuando el fibrinógeno se incuba en presencia de A-beta 42 la turbidez de la solución disminuye con la curva alcanzando una altura máxima de aproximadamente la mitad de la de fibrinógeno solo.
En presencia de un bloqueador de interacción A-beta 42 se mejora el efecto de beta-amiloide y la turbidez es mayor que la de A-beta solo. El efecto del bloqueador no aparece debido a la turbidez de fondo, ya que el compuesto no cambia la turbidez del coágulo de fibrina cuando A-beta está ausente. Además, la formación de coágulos en presencia de GPRP, un péptido conocido por interferir con la polimerización de la fibrina, demuestra una turbidez significativamente reducida en comparación con la formación de coágulos de fibrina en ausencia del inhibidor.
El fibrinógeno generado en presencia de trombina y cloruro de calcio sólo forman una malla de fibrina con hilos alargados e intercalados de fibrina, así como haces más grandes. Cuando A-beta está presente, los hilos de fibrina se volvieron más delgados con varios grumos pegajosos en agregados, lo que indica anomalías estructurales inducidas por A-beta. De acuerdo con los resultados del ensayo de turbidez, la formación de coágulos en presencia de un bloqueador de interacción de fibrinógeno A-beta restaura parcialmente la estructura del coágulo de fibrina a partir de los cambios inducidos por A-beta a medida que se observan menos grumos con este tratamiento.
El ensayo de turbidez del coágulo y los protocolos de análisis del microscopio electrónico de barrido se han optimizado para evaluar varios inhibidores de la interacción con fibrinógenos A-beta de una manera rápida y reproducible. Y pronto los datos proporcionarán información valiosa sobre la formación de coágulos de fibrina que se puede aplicar a otros estudios tanto in vitro como in vivo.
