Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Grundlagenforschung und klinischen Anwendungen zu beantworten, wie Krebsforschung und Krebsbehandlung, aber auch im Bereich der Immunologie. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass es eine statische Methode und leicht zu erleichtern ist. Diese Technik ist in der Lage, erkrankte Zelltypen basierend auf ihrer Form und Bewegungseigenschaften automatisch zu identifizieren.
Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Diagnose und Therapie von Krebs oder entzündlichen Erkrankungen. Diese Methode kann Einblicke in Aktionen zwischen Immunzellen und Krebszellen geben, aber sie kann auch in jedem Bereich angewendet werden, in dem dreidimensionale Mikroskopiedaten erforderlich sind. Es kann sein, dass Personen, die neu mit dieser Methode sind, aufgrund ihrer Probleme schwierigkeiten haben, die dreidimensionalen Mikroskopiedaten zu beschreiben und zu validieren.
Wir dachten, dass eine visuelle Demonstration dieser Methode entscheidend ist, weil die Software-Tools, die wir hier verwenden, vielen Wissenschaftlern nicht vertraut sind. Um zu beginnen, erhalten Sie einen hochauflösenden, dekonvolved dreidimensionalen Mikroskopie-Datensatz, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Laden Sie die 3D-Bilddaten in die Rekonstruktionssoftware, und beginnen Sie mit der Erstellung einer 3D-Oberfläche für jedes Objekt.
Um dies zu erreichen, wählen Sie die Option 3D-Ansicht aus, und klicken Sie auf Flächen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Weiter, um mit dem Oberflächenerstellungs-Assistenten fortzufahren. Wählen Sie nun den Bildkanal für die Oberflächenrekonstruktion aus. Wählen Sie einen Glättungswert, der die Details der Oberfläche nicht ausblendet, aber auch poröse Oberflächen vermeidet.
Wenden Sie die Glättungsfunktion an, indem Sie auf das Kontrollkästchen Glatte Option klicken und einen Glättungsradius bereitstellen. Bei der Erstellung dreidimensionaler Bildkonstruktionen von Mikroskopiedaten ist es besonders wichtig, auf den Glättungsfaktor und die richtige Schwellenwertmethode zu achten, um keine zellulären Eigenschaften oder Formen zu verlieren. Wählen Sie als Nächstes die Schwellenwertmethode aus, um die Flächen zu finden.
Verwenden Sie einen absoluten Intensitätsschwellenwert, wenn die Objekte, wie die hier gezeigten, gut vom Hintergrund getrennt sind und eine annähernd gleichmäßige Helligkeit aufweisen. Wenn die Objekte in ihrer Intensität variieren, aber dennoch vom lokalen Hintergrund und von den anderen objekten, die sie umgeben, getrennt werden können, wenden Sie einen lokalen Kontrastschwellenwert an. Legen Sie den lokalen Schwellenwertsuchbereich entsprechend dem Wert des erwarteten Durchmessers der rekonstruierten Objekte fest.
Wählen Sie als Nächstes aus einer Liste von Optionen aus, um die rekonstruierten Flächen nach morphologischen Parametern von Interesse zu filtern. Dazu gehören Volumen, Sphärizität, Flächen-Volumen-Verhältnis und vieles mehr. Speichern und exportieren Sie die generierten Flächen in einem Format wie VRML, das mit der 3D-Animationssoftware kompatibel ist, die im nächsten Schritt verwendet wird.
Starten Sie Blender, und wechseln Sie zur Registerkarte Ausgabe auf der rechten Seite des Fensters. Wählen Sie das TIFF-Format im Dropdown-Menü aus, und legen Sie die Farbtiefe auf 8-Bit-RGBA fest. Wechseln Sie als Nächstes in den Skriptmodus, und navigieren Sie zur bereitgestellten Skriptdatei Titled:GUI_Autorotate.
py, die für diese Arbeit aus dem github-Repository heruntergeladen werden kann. Klicken Sie im Hauptfenster auf Skript ausführen, und wählen Sie den Ordner der wrl-Dateien aus, wenn Sie zur Eingabe aufgefordert werden. Wechseln Sie dann zum Standardmenü.
Legen Sie hier die Drehungen auf einen Wert bei oder über sechs fest. Führen Sie das Skript aus, indem Sie auf die Schaltfläche Drehen klicken. Eine Drehung von sechs verschiedenen Winkeln ist in der Regel ausreichend, um die verschiedenen Zellpopulationen zu unterscheiden, jedoch empfehlen wir nicht, weniger als sechs Rotationen zu verwenden, um keine Informationen über Formen oder Eigenschaften zu verlieren.
Speichern Sie die Projektionen der einzelnen Flächen in demselben Ordner, der für die Eingabe verwendet wurde. Standardmäßig werden die Bilder in einem 8-Bit-TIFF-Format gespeichert, das das Format ist, das vom FIJI-Plugin Shade benötigt wird. Öffnen Sie Fidschi, und wählen Sie Schatten im Menü Plugins aus.
Beginnen Sie mit den Standardwerten, und optimieren Sie die Parameter später. Klicken Sie auf Okay, wenn Sie bereit sind, das Programm auszuführen. Wählen Sie als Nächstes den Quellordner aus, der die TIFF-Dateien enthält, die im vorherigen Abschnitt erstellt wurden, und klicken Sie auf Auswählen.
Geben Sie dann einen Ausgabedatenordner an. Wenn das erste Bild angezeigt wird, zeichnen Sie ein Rechteck um die Zelle, und klicken Sie zunächst auf Okay. Während das Plugin läuft, sehen Sie die Vorverarbeitung des Bildes in der Peripherie Suche der Zellen durch rote Linien angezeigt.
Die Koordinaten der gefundenen Kanten werden nun verwendet, um die diskreten vierieiner Komponenten zu berechnen. Um zum ersten Mal selbstorganisierende Karten zu trainieren, beginnen Sie mit dem Laden von MATLAB. Laden Sie das TrainSOM MATLAP-Skript, und wählen Sie dann Ausführen aus, um mit dem Training zu beginnen.
Stellen Sie sicher, dass die Datei bei Bedarf korrekt geroutet wird. Wenn es ausgeführt wird, wird ein zusätzliches Fenster angezeigt, um den Fortschritt anzuzeigen. Warten Sie, bis die Schulung abgeschlossen ist, bevor Sie fortfahren.
Standardmäßig ist das Skript so eingestellt, dass es 2.000 Iterationen oder Epen ausführt. Nachdem die Schulung abgeschlossen ist, untersuchen Sie die Topologiediagramme des Netzwerks. Hier ist ein Beispiel für das Nachbar-Entfernungs-Plot, das Sample-Hits-Diagramm und das Eingabe-Ebenen-Plot.
Selbstorganisierende Karten sind ein wichtiges Werkzeug, um verborgene Beziehungen in Ihrem Datensatz zu ermitteln. Sie gruppieren Ihre Daten objektiv und haben den Vorteil, dass sie keinen Trainingsdatensatz benötigen, da sie unbeaufsichtigt lernen. Das Netzwerk ist nun geschult.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Datei in Ihrem Arbeitsbereich, und speichern Sie sie für die zukünftige Verwendung. Laden Sie die selbstorganisierenden Karten, wenn Sie eine bereits trainierte Karte verwenden, um einen Datensatz zu gruppieren. Importieren Sie dann die CSV-Datei, die mit den vorinstallierten trainierten Karten getestet werden soll.
Hier wählen wir die CSV-Ausgabe des Shade Plugins aus. Wenn die Daten geladen werden, ändern Sie den Ausgabetyp in Numerische Matrix, und wählen Sie dann Auswahl importieren aus. Nachdem die Klassifizierung abgeschlossen ist, verwenden Sie das Befehlsfenster, um die verschiedenen Diagramme auszuwerten.
Die Bildschau hier ist von einem dekonvolved intravitalen Multi-Photon Miscroskopie-Datensatz von Mikrogliazellen. Unter physiologischen Bedingungen präsentierte die Mikroglia eine recht komplexe Form mit mehreren, hochverzweigten Prozessen. Wenn sie in einer krebsartigen Umgebung, wie diesem kortikalen Tumormodell, platziert wurde, änderte sich die Mikroglia in eine einfachere, spindelähnlichere Form.
20 dieser forierförmigen Deskriptionskomponenten wurden als Inputs verwendet, um die selbstorganisierende Karte zu trainieren. Die trainierte Karte wurde dann getestet, um ihre Fähigkeit zu bewerten, zwischen gesunden und krebsernden Zellen zu unterscheiden. Die gesunde Zellpopulation wurde auf einen einzigen hier gezeigten Bereich projiziert, während der krebserne Mikroglia-Datensatz als hantelförmige naktive Region dargestellt wurde.
Karten können auch von medizinischen Experten trainiert werden, um verschiedene Zellgruppen zu identifizieren. Hier wurden ruhende Zellen, phagozytosierende Zellen, interagierende Zellen und mobile Zellen identifiziert, rekonstruiert und zum Trainieren einer 12x12-Karte verwendet. Diese kombinierte Karte zeigt Gruppen von künstlichen Neuronen mit hohem Trefferwert, insbesondere im unteren linken und mittleren Bereich der Karte.
Die Robustheit des Mapping-Ansatzes wurde anhand der trainierten selbstorganisierenden Karte mit 3 zufälligen Teilmengen desselben Ruhezellentyps getestet, die nicht Teil des Trainingsdatensatzes waren. Die Antwort der S.O.M auf diese Eingabe weist eine sehr ähnliche Antwort auf, die den richtigen Zelltyp angibt. Nach der Entwicklung dieser Technik haben wir nun ein Toolkit, mit dem wir Zellformänderungen einfach kategorisieren können.
Diese Veränderungen treten beispielsweise bei Krebs oder anderen Reaktionen des Immunsystems auf, und wir können sie mit Mikroskopie messen, wobei ganze Tiere, ausgeschnittenes Gewebe oder sogar Organe auf dem Chip verwendet werden.
