Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche fondamentale et les applications cliniques, telles que la recherche sur le cancer et le traitement du cancer, mais aussi dans le domaine de l’immunologie. Le principal avantage de cette méthode est qu’il s’agit d’une méthode statique et facile à faciliter. Cette technique est capable d’identifier automatiquement les types de cellules maladies en fonction de leurs caractéristiques de forme et de mouvement.
Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic et à la thérapie du cancer ou des maladies inflammatoires. Cette méthode peut fournir un aperçu des actions entre les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses, mais elle peut également être appliquée dans n’importe quel domaine où des données de microscopie tridimensionnelles sont nécessaires. Il se peut que les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal en raison de leurs problèmes pour décrire et valider les données de microscopie tridimensionnelle.
Nous avons pensé qu’une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle parce que les outils logiciels que nous utilisons ici ne sont pas familiers à beaucoup de scientifiques. Pour commencer, obtenez un ensemble de données de microscopie tridimensionnelle à haute résolution et décontvolté tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne. Chargez les données d’image 3D dans le logiciel de reconstruction et commencez à créer une surface 3D pour chaque objet.
Pour ce faire, sélectionnez l’option Vue 3D et cliquez sur Surfaces, puis cliquez sur le bouton Suivant pour procéder à l’assistant de création de surface. Maintenant, sélectionnez le canal d’image pour la reconstruction de surface. Choisissez une valeur lissante qui ne cache pas les détails de la surface mais évite également les surfaces poreuses.
Appliquez la fonction de lissage en cliquant sur la case à cocher option lisse et en fournissant un rayon de lissage. Lors de la création de constructions d’imagerie tridimensionnelle de données de microscopie, il est particulièrement important de prêter attention au facteur de lissage et à la méthode de seuil appropriée, afin de ne pas perdre de caractéristiques ou de formes cellulaires. Ensuite, sélectionnez la méthode de seuil pour trouver les surfaces.
Utilisez un seuil d’intensité absolue lorsque les objets, comme ceux montrés ici, sont bien séparés de l’arrière-plan et ont un niveau de luminosité approximativement uniforme. Lorsque les objets varient en intensité mais peuvent encore être séparés de l’arrière-plan local et des autres objets qui les entourent, appliquez un seuil de contraste local. Définissez la zone de recherche de seuil local en fonction de la valeur du diamètre prévu des objets reconstruits.
Ensuite, sélectionnez parmi une liste d’options pour filtrer les surfaces reconstruites en fonction des paramètres morphologiques d’intérêt. Cela inclut le volume, la sphérité, le rapport surface/volume, et plus encore. Enregistrer et exporter les surfaces générées dans un format tel que VRML, qui est compatible avec le logiciel d’animation 3D qui sera utilisé dans l’étape suivante.
Démarrez blender, et allez à l’onglet Sortie sur le côté droit de la fenêtre. Sélectionnez le format TIFF dans le menu Dropdown et réglez la profondeur de couleur en RGBA 8 bits. Ensuite, passez en mode Scripting et accédez au fichier script fourni intitulé :GUI_Autorotate.
py, qui est téléchargeable à partir du référentiel github pour ce travail. Retour dans la fenêtre principale, cliquez sur Exécuter script, et choisissez le dossier des fichiers wrl lorsqu’il est invité pour l’entrée. Ensuite, allez au menu par défaut.
Ici, réglez les rotations à une valeur égale ou supérieure à six. Exécutez le script en cliquant sur le bouton Rotation. Une rotation de six angles différents est généralement suffisante pour distinguer les différentes populations cellulaires, cependant, nous ne recommandons pas d’utiliser moins de six rotations, afin de ne pas perdre d’informations sur les formes ou les caractéristiques.
Enregistrez les projections des surfaces individuelles dans le même dossier qui a été utilisé pour l’entrée. Par défaut, les images sont enregistrées dans un format TIFF 8 bits, qui est le format requis par le plugin FIJI, Shade. Ouvrez Fidji et sélectionnez Shade dans le menu Plugins.
Commencez par les valeurs par défaut et peaufinez les paramètres plus tard. Cliquez sur Ok lorsque vous êtes prêt à exécuter le programme. Ensuite, choisissez le dossier source qui contient les fichiers TIFF qui ont été créés dans la section précédente, et cliquez sur Sélectionnez.
Ensuite, fournissez un dossier de données de sortie. Lorsque la première image apparaît, dessiner un rectangle autour de la cellule, et commencer par cliquer sur Ok. Comme le plugin fonctionne, vous voyez le pré-traitement de l’image dans la découverte périphérique des cellules indiquées par les lignes rouges.
Les coordonnées des bords trouvés sont maintenant utilisées pour calculer les composants quatre plus discrets. Pour former pour la première fois des cartes auto-organisatrices, commencez par charger MATLAB. Chargez le script TrainSOM MATLAP, puis sélectionnez Exécuter pour commencer la formation.
Assurez-vous de suivre correctement le fichier si nécessaire. Lorsqu’il commence à s’exécuter, et une fenêtre supplémentaire apparaît pour afficher la progression. Attendez que la formation soit terminée avant de procéder.
Par défaut, le script est défini pour exécuter 2000 itérations, ou.des épopées. Une fois la formation terminée, examinez les parcelles de topologie du réseau. Voici un exemple de l’intrigue des distances voisines, de l’intrigue de l’échantillon-hits et de la parcelle d’entrée-plans.
L’auto-organisation des cartes est un outil important pour découvrir les relations cachées dans votre ensemble de données. Ils regroupent vos données objectivement, et ils ont l’avantage qu’ils n’ont pas besoin d’un ensemble de données de formation, parce qu’ils apprennent sans surveillance. Le réseau est maintenant formé.
Cliquez à droite sur le fichier dans votre espace de travail, et enregistrez-le pour une utilisation future. Chargez dans les cartes d’auto-organisation, lors de l’utilisation d’une carte déjà formée, afin de regrouper un ensemble de données. Ensuite, importez le fichier CSV qui doit être testé avec les cartes formées préchargées.
Ici, nous sélectionnerons la sortie CSV du Plugin d’Ombre. Lorsque les données se chargent, modifiez le type de sortie en Matrice numérique, puis sélectionnez Sélection d’importation. Une fois la classification terminée, utilisez la fenêtre de commande pour évaluer les différentes parcelles.
L’image montre ici est d’un décontvolé intravital multi-photon ensemble de données de erreur de cellules microgliales. Dans des conditions physiologiques, les microglies présentaient une forme assez complexe avec de multiples processus très ram ramés. Lorsqu’elles sont placées dans un environnement cancéreux, comme ce modèle de tumeur corticale, les microglies sont passées à une forme plus simple, plus fuseau.
20 de ces composants descripteurs en forme de forier ont été utilisés comme intrants pour former la carte d’auto-organisation. La carte formée a ensuite été testée afin d’évaluer sa capacité à distinguer les cellules saines des cellules cancéreuses. La population de cellules saines a été projetée sur une seule zone montrée ici, tandis que, l’ensemble de données cancéreuses de microglies présenté comme une région active en forme d’haltère.
Les cartes peuvent également être formées par des experts médicaux pour identifier des groupes cellulaires distincts. Ici, les cellules de repos, les cellules phagocytosing, les cellules en interaction, et les cellules mobiles, ont été identifiées, reconstruites, et employées pour former une carte 12x12. Cette carte combinée montre des groupes de neurones artificiels de grande valeur, en particulier dans les zones inférieure gauche et moyenne de la carte.
La robustesse de l’approche cartographique a été mise à l’essai en utilisant la carte d’auto-organisation formée avec 3 sous-ensembles aléatoires du même type de cellules au repos qui ne faisaient pas partie de l’ensemble de données de formation. La réponse du S.O.M à cette entrée présente une réponse très similaire qui indique le type de cellule correct. Après le développement de cette technique, nous avons maintenant une boîte à outils, avec laquelle nous pouvons simplement catégoriser les changements de forme cellulaire.
Ces changements se produisent, pendant le cancer, par exemple, ou d’autres réponses du système immunitaire, et nous pouvons les mesurer par microscopie, en utilisant des animaux entiers, des tissus excisés, ou même des organes sur puce.
