Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave em pesquisas básicas e aplicações clínicas, como pesquisa sobre câncer e tratamento do câncer, mas também no campo da imunologia. A principal vantagem deste método é que ele é um método estático e fácil de facilitar. Esta técnica é capaz de identificar automaticamente tipos de células doentes com base em suas características de forma e movimento.
As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico e terapia de câncer ou doenças inflamatórias. Este método pode fornecer insights sobre ações entre células imunes e células cancerosas, mas também pode ser aplicado em qualquer campo onde dados tridimensionais de microscopia são necessários. Pode ser que os indivíduos novos neste método se esforcem por causa de seus problemas para descrever e validar os dados de microscopia tridimensional.
Pensamos que uma demonstração visual deste método é fundamental porque as ferramentas de software que utilizamos aqui não são familiares para muitos dos cientistas. Para começar, obtenha um conjunto de dados de microscopia tridimensional de alta resolução, desconvolved, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Carregue os dados de imagem 3D no software de reconstrução e comece a criar uma superfície 3D para cada objeto.
Para isso, selecione a opção Exibir 3D e clique em Superfícies e clique no botão Seguir para prosseguir com o Assistente de Criação de Superfície. Agora, selecione o canal de imagem para a reconstrução da superfície. Escolha um valor de suavização que não esconda os detalhes da superfície, mas também evite superfícies porosas.
Aplique a função de alisamento clicando na caixa de seleção de opção suave e fornecendo um raio de suavização. Ao criar construções tridimensionais de imagens de dados de microscopia, é especialmente importante prestar atenção ao fator de suavização e ao método de limiar adequado, a fim de não perder nenhuma característica ou forma celular. Em seguida, selecione o método de limiar para encontrar as superfícies.
Use um limiar de intensidade absoluta quando os objetos, como os mostrados aqui, são bem separados do fundo e têm um nível de brilho aproximadamente uniforme. Quando os objetos variam em sua intensidade, mas ainda podem ser separados do fundo local e dos outros objetos ao seu redor, aplique um limiar de contraste local. Defina a Área de Pesquisa de Limiares Locais de acordo com o valor do diâmetro esperado dos objetos reconstruídos.
Em seguida, selecione a partir de uma lista de opções para filtrar as superfícies reconstruídas de acordo com parâmetros morfológicos de interesse. Isso inclui volume, esfericidade, relação superfície-volume e muito mais. Salve e exporte as superfícies geradas em um formato como VRML, que é compatível com o software de animação 3D que será usado na próxima etapa.
Inicie o Liquidificador e vá para a guia Saída no lado direito da janela. Selecione o formato TIFF no menu suspenso e defina a profundidade de cor para RGBA de 8 bits. Em seguida, mude para o modo de script e navegue para o arquivo de script fornecido Intitulado:GUI_Autorotate.
py, que é baixado do repositório github para este trabalho. De volta à janela principal, clique em Executar script e escolha a pasta dos arquivos wrl quando solicitado para entrada. Em seguida, vá para o Menu Padrão.
Aqui, defina as rotações para um valor acima ou superior a seis. Execute o script clicando no botão Girar. Uma rotação de seis ângulos diferentes geralmente é suficiente para distinguir as diferentes populações celulares, no entanto, não recomendamos usar menos de seis rotações, a fim de não perder nenhuma informação sobre formas ou características.
Guarde as projeções das superfícies individuais na mesma pasta que foi usada para a entrada. Por padrão, as imagens são salvas em um formato TIFF de 8 bits, que é o formato exigido pelo plugin FIJI, Shade. Abra Fiji e selecione Sombra no menu Plugins.
Comece com os valores padrão e ajuste os parâmetros mais tarde. Clique em Ok quando estiver pronto para executar o programa. Em seguida, escolha a pasta de origem que contém os arquivos TIFF que foram criados na seção anterior e clique em Selecionar.
Em seguida, forneça uma pasta de dados de saída. Quando a primeira imagem aparecer, desenhe um retângulo ao redor da célula e comece clicando em Ok. À medida que o plugin é executado, você vê o pré-processamento da imagem na periferia encontrando as células indicadas por linhas vermelhas.
As coordenadas das bordas encontradas são agora usadas para calcular os componentes mais discretos do fourier. Para treinar mapas auto-organizados pela primeira vez, comece carregando o MATLAB. Carregue o script TrainSOM MATLAP e selecione Executar para iniciar o treinamento.
Certifique-se de seguir corretamente o arquivo, se necessário. Quando ele começar a funcionar, e a janela adicional aparecerá para exibir o progresso. Espere até que o treinamento seja concluído antes de prosseguir.
Por padrão, o script está definido para executar 2.000 iterações ou, épicos. Após o término do treinamento, examine as tramas de topologia da rede. Aqui está um exemplo do enredo de distâncias dos vizinhos, do enredo de hits de amostra e do enredo de insumos.
Mapas auto-organizados são uma ferramenta importante para descobrir relacionamentos ocultos em seu conjunto de dados. Eles agrupam seus dados objetivamente, e eles têm a vantagem de que eles não precisam de um conjunto de dados de treinamento, porque eles aprendem sem supervisão. A rede está treinada.
Clique com o botão direito do mouse no arquivo em seu espaço de trabalho e salve-o para uso futuro. Carregue nos mapas auto-organizados, ao usar um mapa já treinado, a fim de agrupar um conjunto de dados. Em seguida, importe o arquivo CSV que deve ser testado com os mapas treinados pré-carregados.
Aqui, vamos selecionar a saída CSV do Plugin de sombra. Quando os dados são carregados, altere o tipo de saída para Matriz Numérica e selecione Seleção de importação. Após o término da classificação, use a janela de comando para avaliar os vários gráficos.
O show de imagem aqui é de um conjunto de dados de miscroscopia intra-fótons desconvolved de células microgliais. Em condições fisiológicas, a microglia apresentou uma forma bastante complexa com múltiplos processos altamente ramificados. Quando colocada em um ambiente cancerígeno, como este modelo de tumor cortical, a microglia mudou para uma forma mais simples, mais parecida com o fuso.
20 desses componentes descritivos em forma de forier foram usados como entradas para treinar o mapa auto-organizador. O mapa treinado foi então testado para avaliar sua capacidade de distinguir entre células saudáveis e cancerígenas. A população de células saudáveis foi projetada em uma única área mostrada aqui, enquanto o conjunto de dados cancerígenos de microglia apresentado como uma região ativa em forma de halter.
Mapas também podem ser treinados por especialistas médicos para identificar grupos celulares distintos. Aqui, células de repouso, células fagocitas, células interativas e células móveis foram identificadas, reconstruídas e usadas para treinar um mapa 12x12. Este mapa combinado mostra grupos de neurônios artificiais de alto valor, especialmente nas áreas inferior esquerda e média do mapa.
A robustez da abordagem de mapeamento foi testada utilizando-se o mapa auto-organizador treinado com 3 subconjuntos aleatórios do mesmo tipo de célula de repouso que não fazia parte do conjunto de dados de treinamento. A resposta do S.O.M a esta entrada exibe uma resposta muito semelhante que indica o tipo de célula correta. Após o desenvolvimento desta técnica, agora temos um kit de ferramentas, com o qual podemos simplesmente categorizar mudanças na forma celular.
Essas alterações ocorrem, durante o câncer, por exemplo, ou outras respostas do sistema imunológico, e podemos medi-las com microscopia, usando animais inteiros, tecido excisado ou até mesmo órgãos em chip.
