Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca di base e nelle applicazioni cliniche, come la ricerca sul cancro e il trattamento del cancro, ma anche nel campo dell'immunologia. Il vantaggio principale di questo metodo è che è un metodo statico e facile da facilitare. Questa tecnica è in grado di identificare automaticamente i tipi di cellule masmato in base alla loro forma e caratteristiche di movimento.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi e la terapia del cancro o delle malattie infiammatorie. Questo metodo può fornire approfondimenti sulle azioni tra cellule immunitarie e cellule tumorali, ma può essere applicato anche in qualsiasi campo in cui sono necessari dati di microscopia tridimensionale. Potrebbe essere che gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa dei loro problemi a descrivere e convalidare i dati della microscopia tridimensionale.
Abbiamo pensato che una dimostrazione visiva di questo metodo sia fondamentale perché gli strumenti software che utilizziamo qui non sono familiari a molti degli scienziati. Per iniziare, ottenere un set di dati di microscopia tridimensionale deconvoluto ad alta risoluzione come descritto nel protocollo di testo allegato. Caricare i dati dell'immagine 3D nel software di ricostruzione e iniziare a creare una superficie 3D per ogni oggetto.
A tale scopo, selezionate l'opzione Vista 3D (3D View) e fate clic su Superfici (Surfaces), quindi fate clic sul pulsante Avanti (Next) per procedere con la Creazione guidata superficie (Surface Creation Wizard). Ora, selezionare il canale dell'immagine per la ricostruzione della superficie. Scegliete un valore di smussatura che non nascono i dettagli della superficie ma eviti anche superfici porose.
Applicate la funzione di smussatura facendo clic sulla casella di controllo Opzione liscia (Smooth Option Check) e fornendo un raggio di smussatura. Quando si creano costruzioni di immagini tridimensionali di dati di microscopia, è particolarmente importante prestare attenzione al fattore di levigatura e al metodo di soglia corretto, al fine di non perdere alcuna caratteristica o forma cellulare. Selezionare quindi il metodo di soglia per trovare le superfici.
Utilizzare una soglia di intensità assoluta quando gli oggetti, come quelli mostrati qui, sono ben separati dallo sfondo e hanno un livello di luminosità approssimativamente uniforme. Quando gli oggetti variano nella loro intensità ma possono ancora essere separati dallo sfondo locale e dagli altri oggetti che li circondano, applicare una soglia di contrasto locale. Impostare l'area di ricerca soglia locale in base al valore del diametro previsto degli oggetti ricostruiti.
Quindi, selezionare da un elenco di opzioni per filtrare le superfici ricostruite in base ai parametri morfologici di interesse. Ciò include volume, sfericità, rapporto superficie-volume e altro ancora. Salvare ed esportare le superfici generate in un formato come VRML, compatibile con il software di animazione 3D che verrà utilizzato nel passaggio successivo.
Avviare Blender e passare alla scheda Output sul lato destro della finestra. Selezionate il formato TIFF dal menu a discesa e impostate la profondità del colore su RGBA a 8 bit. Passare quindi alla modalità script e passare al file di script specificato Intitolato:GUI_Autorotate.
py, che è scaricabile dal repository github per questo lavoro. Di nuovo nella finestra principale, fare clic su Esegui script e scegliere la cartella dei file wrl quando viene richiesto l'input. Passare quindi al menu predefinito.
Qui, impostare le rotazioni su un valore pari o superiore a sei. Eseguire lo script facendo clic sul pulsante Ruota. Una rotazione di sei diverse angolazioni è solitamente sufficiente per distinguere le diverse popolazioni cellulari, tuttavia, non si consiglia di utilizzare meno di sei rotazioni, al fine di non perdere alcuna informazione su forme o caratteristiche.
Salvate le proiezioni delle singole superfici nella stessa cartella utilizzata per l'input. Per impostazione predefinita, le immagini vengono salvate in un formato TIFF a 8 bit, che è il formato richiesto dal plugin FIJI, Shade. Apri Fiji e seleziona Ombreggiatura nel menu Plugin.
Iniziate con i valori predefiniti e perfezionate i parametri in un secondo momento. Fare clic su Ok quando si è pronti per eseguire il programma. Scegliere quindi la cartella di origine contenente i file TIFF creati nella sezione precedente e fare clic su Seleziona.
Quindi, fornire una cartella dati di output. Quando viene visualizzata la prima immagine, disegnare un rettangolo che circonda la cella e iniziare facendo clic su Ok. Durante l'esecuzione del plug-in, viene eseguita la pre-elaborazione dell'immagine nella ricerca periferia delle celle indicate dalle linee rosse.
Le coordinate degli spigoli trovati vengono ora utilizzate per calcolare i componenti fourier discreti. Per addestrare per la prima volta mappe auto-organizzate, inizia caricando MATLAB. Caricare lo script TrainSOM MATLAP, quindi selezionare Esegui per iniziare il training.
Assicurarsi di percorso corretto del file, se necessario. Quando inizia l'esecuzione e verrà visualizzata una finestra aggiuntiva per visualizzare lo stato di avanzamento. Attendere il completamento dell'allenamento prima di procedere.
Per impostazione predefinita, lo script è impostato per eseguire 2.000 iterazioni o epiche. Al termine della formazione, esaminare i grafici di topologia della rete. Ecco un esempio del plottaggio delle distanze vicine, del tracciato sample-hits e del plottaggio dei piani di input.
Le mappe auto-organizzanti sono uno strumento importante per scoprire le relazioni nascoste nel set di dati. Raggruppano i dati in modo oggettivo e hanno il vantaggio di non aver bisogno di un set di dati di training, perché apprendono senza supervisione. La rete è ora addestrata.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sul file nell'area di lavoro e salvarlo per un uso futuro. Caricare nelle mappe auto-organizzate, quando si utilizza una mappa già addestrata, per raggruppare un set di dati. Quindi, importare il file CSV da testare con le mappe addestrate precaricate.
Qui, selezioneremo l'output CSV del plug-in shade. Quando i dati vengono caricati, modificare il tipo di output in Matrice numerica e quindi selezionare Importa selezione. Al termine della classificazione, utilizzare la finestra di comando per valutare i vari grafici.
L'immagine mostra qui proviene da un set di dati multi-fotoscopia intravitale deconvolta di cellule microgliali. In condizioni fisiologiche, la microglia presentava una forma piuttosto complessa con processi multipli e altamente ramificati. Se collocata in un ambiente canceroso, come questo modello tumorale corticale, la microglia è cambiata in una forma più semplice e simile a un mandrino.
20 di questi componenti di descripting a forma di forier sono stati utilizzati come input per addestrare la mappa auto-organizzante. La mappa addestrata è stata quindi testata al fine di valutare la sua capacità di distinguere tra cellule sane e cancerose. La popolazione cellulare sana è stata proiettata su un'unica area mostrata qui, mentre, il set di dati di microglia cancerosa presentato come una regione attiva a forma di manubrio.
Le mappe possono anche essere addestrate da esperti medici per identificare gruppi cellulari distinti. Qui, cellule a riposo, cellule fagocitose, cellule interagenti e cellule mobili, sono state identificate, ricostruite e utilizzate per addestrare una mappa 12x12. Questa mappa combinata mostra gruppi di neuroni artificiali di alto valore, specialmente nelle aree in basso a sinistra e al centro della mappa.
La robustezza dell'approccio di mappatura è stata testata utilizzando la mappa auto-organizzante addestrata con 3 sottoinsiemi casuali dello stesso tipo di cella a riposo che non faceva parte del set di dati di training. La risposta del S.O.M a questo input mostra una risposta molto simile che indica il tipo di cella corretto. Dopo lo sviluppo di questa tecnica, ora abbiamo un toolkit, con il quale possiamo semplicemente classificare i cambiamenti della forma cellulare.
Questi cambiamenti si verificano, durante il cancro, per esempio, o altre risposte del sistema immunitario, e possiamo misurarli con la microscopia, usando animali interi, tessuti asportati o persino organi su chip.
