Die Säuremazerationsmethode kann helfen, wichtige Fragen über die Niere zu beantworten und wie bestimmte Gene zur Nephronentwicklung beitragen oder beeinflussen und wie bestimmte Bedingungen wie Diabetes oder Bluthochdruck die Nephronzahl beeinflussen. Dies ist wichtig, da eine Gesamtzahl von Nephronen, mit denen ein geborener Personen während der fetalen Entwicklung und des Verlusts von Nephronen bestimmt wird, mit der Nierenpathologie in Verbindung gebracht wurde. Die Hauptvorteile der Säuremazeration Methode sind, dass es schneller, reproduzierbarer, kostengünstiger und weniger zeitaufwändig als andere Nephron-Zählmethoden, wie Magnetresonanztomographie.
Diese Technik erleichtert die Korrelation der Auswirkungen in Nephronzahl auf die Nierenfunktion, was wichtig ist, um unser Verständnis darüber zu fördern, wie bestimmte Gene die Nephronfunktion und -entwicklung beeinflussen. Die Untersuchung von Genen oder Faktoren, die die Gesamtnephronzahl beeinflussen, wird bei der Entwicklung pharmakologischer oder genetischer Ansätze zur Begrenzung des krankheitsassoziierten Nephronverlustes eine entscheidende Rolle spielen. Mit guter experimenteller Technik und Praxis sollten Personen, die mit dieser Methode neu sind, leicht die Beherrschung der Säuremazerationsmethode erlangen, die zuverlässige und reproduzierbare Schätzungen ganzer Nierennephronzahlen ermöglicht.
Beginnen Sie mit einer feinen chirurgischen Schere, um die Bauchhöhle der Maus entlang der Mittellinie zu öffnen. Verschieben Sie vorsichtig den Darm und reproduktive Fett auf die rechte Seite des Tieres. Mit grober Sesection, isolieren Sie die linke Niere und schneiden Sie die linke Nierenarterie und Vene, um vorsichtig die Niere zu entfernen, die das Organ in ein entsprechend gekennzeichnetes Wägeboot von PBS legt.
Sammeln Sie die rechte Niere auf die gleiche Weise und legen Sie beide Nieren auf eine chirurgische Gaze vorbefeuchtet mit PBS. Entfernen Sie schnell alle anhaftenden nicht-renalen Gewebe und die Nierenkapseln. Dann gewichten Sie jede Niere einzeln das Gewicht des linken und rechten Organs separat aufzeichnen.
Legen Sie nach dem Wiegen jede Niere ohne PBS wieder in ein entsprechend beschriftetes Wägeboot und schneiden Sie jedes Organ in der Längsrichtung mit einer sauberen Rasierklinge. Jede Nierenhälfte halb nach unten schneiden und jede Hälfte in zwei Millimeter oder kleinere Stücke schneiden. Mit der gleichen Rasierklinge die gehackten Nierenstücke vorsichtig in ein entsprechend beschriftetes 15 Milliliter konisches Rohr übertragen.
In einer gut belüfteten Dunstabzugshaube fünf Milliliter sechs Molsalzsäure in jedes Rohr geben. Als nächstes rühren Sie die Nierensäuremischungen vorsichtig auf, bevor Sie die Schläuche 90 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius Wasserbad geben. Am Ende der sauren Mazeration eine 18-Meter-Nadel an einer Fünf-Milliliter-Spritze pro Niere befestigen und die Spritzenkolben vorsichtig entfernen.
Legen Sie die Spritzen in einzelne 50 Milliliter konische Schläuche in die Dunstabzugshaube und gießen Sie die Nierenlösungen in das offene Ende jeder Spritze, die die leeren Schläuche in einem Reagenzglasregal beiseite legt. Dann tauschen Sie die Kolben für die langsame Extrusion jeder Lösung durch die Nadeln in die 50 Milliliter Rohre sorgfältig aus. Waschen Sie die 15 Milliliter konischen Schläuche mit fünf MilliliterPBS-Lösung pro Tube, die das PBS wirbelt, um das verbleibende Nierengewebe zu löslich.
Extrudieren Sie den Waschinhalt in das entsprechende 50-Milliliter-Rohr, wie soeben gezeigt. Nach dem Extrudieren der dritten Wäsche jede Spritze mit einer 21-Spur-Nadel ausstatten. Extrudieren Sie den Inhalt der 50 Milliliter-Rohre in einen zweiten Satz von 50 Milliliter-Rohren durch die kleinere Bohrung Nadel waschen und extrudieren die ersten 50 Milliliter Rohrinhalt dreimal mit frischen PBS, wie gezeigt.
Nach der dritten Wasch- und Extrusionsmenge das Gesamtvolumen in jedem Rohr mit zusätzlichem PBS auf 50 Milliliter bringen und die Rohre über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Rockerplatte in ein Rack legen. Legen Sie innerhalb von fünf Tagen nach der Verarbeitung ein Gitter mit 16 separaten Abschnitten auf den Boden von sechs Brunnen einer 12 Brunnenplatte. Um die Röhren der Nierenlösung mehrmals sanft umzukehren, um das pelletierte Gewebe wieder aufzuhängen.
Fügen Sie vorsichtig drei 500 Mikroliter Aliquots jeder homogenisierten Lösung pro Niere zu jedem der drei Brunnen der 12 Brunnenplatte hinzu. Verdünnen Sie den Inhalt jedes Brunnens mit einem gleichen PBS-Volumen. Legen Sie die Platte auf die Bühne eines invertierten Mikroskops.
Identifizieren Sie die Glomeruli anhand ihrer kugelförmigen Struktur, rötlichen Farbtons und der Vor- oder Nachartials, die an den Körpern einzelner Glomeruli befestigt sind. Zählen Sie die Anzahl der Glomeruli pro gerasterten Abschnitt, um die Anzahl pro Raster für die Berechnung der Gesamtzahl der Glomeruli pro Brunnen zu summieren. Dann multiplizieren Sie die Anzahl der Glomeruli pro Well mal 100, um die durchschnittliche Anzahl von Glomeruli pro Niere zu erhalten.
In diesem repräsentativen Experiment betrug die Gesamtanzahl der Nephronen bei Mäusen, die 14 Tage lang mit dem Fahrzeug infundiert wurden, etwa 12 500 Nephrone pro Niere. Angiotensin zwei Infusionen erhöhten jedoch den Vorhofdruck um etwa 40 Millimeter Quecksilber und waren mit einer signifikanten Verringerung der gesamten Nephronzahl um fast 26 % verbunden. In diesem genetischen Modell der Nierenagenese der Ratte wurden Tiere, die mit zwei Nieren geboren wurden, nach der sauren Mazeration mit etwa 27 500 Nephronen pro Niere berechnet, während Ratten, die mit einer einsamen Niere geboren wurden, signifikant niedrigere Nephronzahlen insgesamt hatten.
Die Schätzungen beider Experimente entsprachen den zuvor bei Ratten gemeldeten Bereichen. Die Säuremazerationsmethode ist ideal für die Schätzung von Nephronzahlen in ganzen Nieren, insbesondere in Laboratorien, die nicht mit arbeitsintensiveren und kostenintensiven Techniken zum Zählen von Nephronen ausgestattet sind, wie z. B. die Disektorfraktionatormethode oder die Magnetresonanztomographie. Diese Methode ermöglicht eine hohe Durchsatz-, effiziente und reproduzierbare Schätzung der gesamten Nieren-Nephron-Zahl, die innerhalb von 5% der Zahlen durch Magnetresonanztomographie bestimmt sind.
Die Beurteilung der Nephronzahl ist von klinischer Relevanz, da reduzierte Nephronzahlen mit einem erhöhten Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie chronische Nierenerkrankungen in Verbindung gebracht wurden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Salzsäure extrem gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Schutzbrillen und einem Labormantel getroffen werden sollten.
