Diese Methode kann dazu beitragen, die großflächige und hochauflösende Charakterisierung von Protein-Isoformen und nach-translationalen Modifikationen in Zellen zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Kapillarzonen-Massenspektrometrie eine hocheffiziente Trennung und hochempfindliche Detektion intakter Proteine bietet. Um die Kapillare vorzubehandeln, trocknen Sie sie mindestens 12 Stunden lang mit Stickstoffgas bei 10 psi.
Dann füllen Sie die Kapillare mit 50% Volumen-by-Volumen 3-Propylmethacrylat in Methanol mit einer Spritzenpumpe. Beide Enden der Kapillare mit Kieselgummi versiegeln. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 24 Stunden mit einer linearen Polyacrylamidbeschichtung an der Innenwand der Trennkapillare, wie im Textprotokoll beschrieben, weiter.
Verbrennen Sie einen Teil der Kapillare mit einer sanften Flamme, um die Polyamid-Außenbeschichtung etwa vier Zentimeter von einem Ende der Kapillare entfernt zu entfernen. Reinigen Sie den verbrannten Teil der Kapillare vorsichtig, indem Sie wischen, um die Polyamidbeschichtung vollständig zu entfernen. Bohren Sie ein kleines Loch am Ende eines 200-Mikroliter-Rohrs in der Gleichen Größe wie der Kapillaraußendurchmesser, um die Kapillare ausreichend an Ort und Stelle zu halten, sobald sie durch dieses Loch gefädelt wird.
Gewinden Sie das Ende der Kapillare, die sich in der Nähe des verbrannten Teils befindet, durch das Loch, bis sich der verbrannte Teil im Rohr befindet. Fügen Sie dann etwa 150 Mikroliter HF in das 200-Mikroliter-Rohr, so dass die HF-Lösung etwa auf halbem Weg den verbrannten Teil auf der Kapillare ist. Inkubieren Sie die Kapillare in der HF-Lösung bei Raumtemperatur 90 bis 100 Minuten.
Bereiten Sie die Standardproteinmischung und die E.coli-Probe wie im Textprotokoll beschrieben vor. Um die Kapillarzonenelektrophorese oder das CZE-System einzurichten, laden Sie die Probe, den Hintergrundelektrolyten und die Trennkapillare in CZE-Auto-Sampler. Wählen Sie die Probenlast auf der manuellen Steuerseite des CZE-Auto-Samplers aus.
Laden Sie die Hintergrundelektrolyt-Durchstechflasche in die Pufferwanne des Auto-Samplers und notieren Sie ihre Position in der Pufferschale. Laden Sie dann die Probendurchstechsons in das Probenfach des Auto-Samplers und notieren Sie ihre Position im Probenfach. Setzen Sie den Auto-Sampler mithilfe einer manuellen Steuerung an die Ausrichtungsposition.
Laden Sie nun die Trennkapillare mit dem nicht geätzten Ende der Kapillare in den CZE-Auto-Sampler. Passen Sie die Höhe des Injektionsendes der Kapillare an, wenn das Probenvolumen unter 50 Mikrolitern liegt. Schalten Sie den Auto-Sampler über eine manuelle Steuerung in den Standby-Modus.
Geben Sie die Probenposition im System ein, und verschieben Sie die Kapillare in die Probe. Drücken Sie das Injektionsende der Kapillare weiter nach unten, um den Boden der Probendurchstechszusen zu erreichen. Wenn Sie die manuelle Steuerung weiterhin verwenden, spülen Sie die Kapillare mit dem Hintergrundelektrolyten 20 Minuten lang mit einem Druck von 20 psi.
Montieren Sie nun eine kommerzielle elektrokinetisch gepumpte Mantelflussschnittstelle an der Vorderseite des Massenspektrometers. Füllen Sie das Mantelpufferreservoir mit einem Puffer, der 10 % Volumen-Volumen-Methanol und 0,2 % Volumen-Volumen-Ameisensäure in LCMS-Wasser enthält. Spülen Sie das T in der Schnittstelle mit dem Mantelpuffer, indem Sie den Druck manuell mit einer Spritze aufbringen.
Verfädeln Sie das ein Millimeter äußere DurchmesserEnde eines Elektrospray-Emitters durch einen Hülsenschlauch und verbinden Sie den Strahler über einen Anschluss des T über eine Armatur mit einem Anschluss des T. Spülen Sie das T einfach manuell wieder mit einer Spritze, um den Emitter mit dem Mantelpuffer zu füllen. Stellen Sie den Abstand zwischen der Öffnung des Emitters und dem Eingang des Massenspektrometers mit Hilfe der Kamera, die mit der Schnittstelle kam, auf etwa zwei Millimeter ein.
Tragen Sie eine Zwei-bis-2,2-Kilovolt-Spannung an der Mantelpufferdurchstechflasche für Elektrospray auf. Passen Sie dann die Sprühspannung an, um ein stabiles Elektrospray zu erreichen. Tragen Sie während dieses Prozesses einen niedrigen Druck am Injektionsende der Kapillare auf, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen in der Kapillare befinden.
Schalten Sie die Sprühspannung aus und fädeln Sie das geätzte Ende der Trennkapillare durch das T vorsichtig in den Emitter ein, bis es nicht weiter geschoben werden kann. Nachdem Sie den niedrigen Druck am Einspritzende der Kapillare gestoppt haben, spülen Sie den Emitter etwas mit einem Mantelpuffer. Wenden Sie erneut zwei bis 2,2 Kilovolt Sprühspannung an, um das Spray zu testen.
Wählen Sie unter dem Dropdown-Menü Datei auf dem Hauptbildschirm des Instruments eine neue Methode aus. Wählen Sie dort einlass als Startmuster-Durchstechflasche, Endprobe-Durchstechflasche, Tablett als Probe, Druck als fünf psi, Kilovolt als Null und Dauer als 95 Sekunden für eine Probeninjektion. Dann einlass als Einlassdurchstechflasche, Tablett als Puffer, Druck als Null psi, Kilovolt als 30 und Dauer als 4, 200 Sekunden für die Trennung der Standard-Protein-Gemischprobe.
Für die Trennung der E.coli-Proteomprobe eingelassen als Einlassdurchstechflasche, Tablett als Puffer, Druck als Null psi, Kilovolt als 20 und Dauer als 6, 600 Sekunden. Wählen Sie schließlich eingelassen als Einlassdurchstechflasche, Tablett als Puffer, Druck als 10 psi, Kilovolt als 30 und Dauer als 600 Sekunden für Kapillarspülung. Richten Sie nun die MS- und MS/MS-Parameter für die intakte Proteinanalyse mithilfe eines Vierfach-Ionen-Trap-Maskenspektrometers ein.
Um die Einstellungen der Tune-Datei anzupassen, schalten Sie den intakten Proteinmodus ein und verwenden Sie einen Fangdruck von 0,2. Stellen Sie die Ionentransferkapillartemperatur auf 320 Grad Celsius und die Hf-Stufe der S-Linse auf 55. Um das CZE MS/MS-Experiment durchzuführen, starten Sie die Datenerfassungsmethode auf dem Massenspektrometercomputer, indem Sie zunächst die Ausführungssequenz auswählen.
Starten Sie dann die Kapillarelektrophoresesequenz auf dem Kapillarelektrophorese-Auto-Sampler-Computer. Führen Sie eine Datenbanksuche mit TopPIC in der TopPIC-Suite und in der grafischen Benutzeroberfläche von TopPIC durch. Klicken Sie auf die Datenbankdatei, und wählen Sie eine geeignete Datenbank für die Suche aus.
Klicken Sie auf die Spektrumdatei und wählen Sie die generierte ms2 aus. msalign-Datei, die als Eingabe generiert wurde. Wählen Sie die MS1-Featuredatei aus, und wählen Sie die generierte Feature-Datei aus.
Setzen Sie Cystein-Carbamidomethyl C57 als feste Modifikation aufgrund der Iodoacetamid-Behandlung. Wählen Sie die Decoy-Datenbank-Funktion aus, und wählen Sie unter Cutoff-Einstellungen die falsche Ermittlungsrate im Dropdown-Menü neben der Spektrumebene aus. Legen Sie die falsche Ermittlungsrate auf Spektrumebene auf 0,01 fest.
Lassen Sie die Generierungsfunktion deaktiviert und legen Sie die Fehlertoleranz auf 15 Teile pro Million fest. Legen Sie die falsche Ermittlungsrate auf proteoforme Ebene auf 0,05 fest. Wählen Sie unter erweiterte Parameter zwei für die maximale Anzahl von Massenverschiebungen im Dropdown-Menü aus.
Legen Sie die maximale Massenverschiebung unbekannter Modifikationen auf 500 Daltons fest. Lassen Sie alle anderen Parameter bei ihren Standardwerten und klicken Sie auf die Start-Schaltfläche unten rechts in der grafischen Benutzeroberfläche. Das repräsentative Elektropherogramm für die Standard-Proteinmischung wird gezeigt.
Die Standard-Proteinmischung wird in der Regel mindestens in doppelter Ausführung ausgeführt, um die Trenneffizienz und die Reproduzierbarkeit des Systems zu bewerten. Die Trenneffizienz kann mit der Anzahl der theoretischen Platten einiger Proteine bewertet werden. Die Reproduzierbarkeit kann anhand der relativen Standardabweichungen von Proteinintensität und Migrationszeit beurteilt werden.
Die CZE MS/MS-Plattform kann zur großflächigen Charakterisierung von Proteoformen in verschiedenen komplexen Proteomen verwendet werden, wobei über 500 Proteoformen und 190 Proteine aus einem E.coli-Proteom in einem einzigen Durchlauf mit hohem Vertrauen identifiziert werden. Hier kann ein gezoomter Blick auf das Elektropherogramm verwendet werden, um das Trennfenster des Systems zu beurteilen. Der sehr niedrige E-Wert und die spektrale FDR deuten auf die hohe Konfidenz der Proteoform-ID hin. Die hohe Anzahl der abgestimmten Fragmentionen deutet weiter auf die hohe Konfidenz der ID hin. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die geätzte Trennkapillare langsam und schonend in den Elektrospray-Emitter einzufädeln.
Stabile Isotopenkennzeichnung oder etikettenfreie Methoden können in das CZE MS-Verfahren integriert werden, um zu bestimmen, wie sich die proteoforme Fülle in den Zellen unter verschiedenen Bedingungen ändert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Top-Down-Proteomik, um die Rolle von Proteoformen bei der Regulierung verschiedener biologischer Prozesse in Zellen zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Flusssäure extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die richtige persönliche Schutzausrüstung und Notfallmaßnahmen sollten immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
