Dieser liniengesteuerte Ansatz ermöglicht die proteomische Analyse wichtiger Entwicklungsereignisse mit räumlicher und zeitlicher Auflösung innerhalb des Wirbeltierembryos und vermittelt Informationen, die durch Messungen des gesamten Embryos nicht zugänglich wären. Dieser Ansatz kann leicht erweitert werden, um Proteine, Metaboliten und Transkripte verschiedener embryonaler Zellen zu untersuchen, während sie sich während der Entwicklung differenzieren. Diese Methode kann unser Verständnis der molekularen Mechanismen verbessern, die die normale Entwicklung und die Entwicklung von Krankheiten steuern, einschließlich der Mechanismen der Gewebeinduktion und des Zellschicksals während der frühen Entwicklung.
Verwenden Sie eine Haarschlaufe, um jeden Embryo in eine Vertiefung zu führen, und positionieren Sie ihn vorsichtig so, dass sich die Zielzelle im richtigen Winkel zur Mikronadel befindet. Folgen Sie den Schicksalskarten des Xenopus laevis-Gewebes, um die Vorläuferzelle der interessierenden Abstammungslinie zu identifizieren. Verwenden Sie zwei angespitzte Pinzetten, um die Vitellinmembran, die den Embryo umgibt, vorsichtig zu entfernen.
Isolieren Sie die einzelnen Zellen aus dem Embryo durch manuelle Präparation mit einer Pinzette. Beginnen Sie mit dem Einrichten der Injektionsnadel mit der Lineage-Tracer-Lösung. Montieren Sie die Mikroinjektionsnadel in einen Mikropipettenhalter, der von einem mehrachsigen Mikromanipulator gesteuert wird.
Schließen Sie den Mikropipettenhalter an einen Mikroinjektor an und füllen Sie die Nadel mit dem Lineage Tracer durch Anlegen von Unterdruck. Kalibrieren Sie die Nadel und passen Sie die Größe der Nadelspitze und die Injektionszeit an, um etwa einen Nanoliter der in Mineralöl gemessenen Tracerlösung zu liefern. Stellen Sie sicher, dass die injizierte Tröpfchengröße genau ist, und passen Sie die Injektoreinstellungen bei Bedarf an.
Fluten Sie die Mikroinjektionsschale mit einer 3%igen fCAL-Lösung und übertragen Sie etwa 10 Embryonen mit einer Transferpipette in die Tonschale. Injizieren Sie den zu untersuchenden Zellen etwa einen Nanoliter des fluoreszierenden Dextrans oder 200 Pikogramm GFP-mRNA. Bestätigen Sie mit einem Stereomikroskop den Erfolg der Zellmarkierung.
Stellen Sie sicher, dass nur die vorgesehene Zelle injiziert wird. Embryonen, die verletzte oder falsch markierte Zellen enthalten, werden gemäß den institutionellen Richtlinien verworfen. Übertragen Sie die injizierten Embryonen in eine Petrischale mit 0,5-facher Steinberg-Lösung.
Kultivieren Sie sie zwischen 14 und 25 Grad Celsius, bis sie das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben. Übertragen Sie drei bis fünf Embryonen in eine Agarschale mit 0,2-facher Steinberg-Lösung für Mikrodissektionen. Verwenden Sie eine Pinzette, um den markierten Klon aus dem Embryo zu sezieren.
Sammeln Sie das präparierte Gewebe mit einer 0,5- bis 10-Mikroliter-Pipette und geben Sie es in eine Mikrozentrifugenfeile. Saugen Sie mit einer Pipette die Medien ab, die das gesammelte Gewebe umgeben, um Salze in der Probe zu begrenzen und Interferenzen mit der HRMS-Analyse zu vermeiden. Frieren Sie die isolierten Zellen sofort ein, indem Sie das Probenfläschchen auf Trockeneis oder flüssigen Stickstoff legen.
Lagern Sie die Proben bis zur massenspektrometrischen Analyse bei minus 80 Grad Celsius. Für die Verarbeitung von Einzelzellproben durch CE denaturieren Sie die Proteine, indem Sie die Probe etwa 15 Minuten lang auf 60 Grad Celsius erhitzen. Bringen Sie die Probe dann fünf Minuten lang auf Raumtemperatur und fügen Sie den Proben Trypsin zum Aufschluss hinzu.
Für die Analyse mittels NanoLC werden bis zu fünf präparierte Gewebe in 50 Mikrolitern Lysepuffer lysiert. Erleichtern Sie den Vorgang, indem Sie die Probe auf und ab pipettieren. Um das präparierte Gewebe zu verarbeiten, wird das Lysat 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert.
Anschließend pelletieren Sie die Zelltrümmer und Eigelbplättchen bei vier Grad Celsius durch Zentrierung bei 4.500 RCF. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenfläschchen und fügen Sie 10 % SDS hinzu, um eine Endkonzentration von 1 % SDS im Lysat zu erhalten. Bei Geweben werden dem Lysat 0,5 molare Dithiothreitol zugesetzt, um eine Endkonzentration von etwa 25 Millimolaren zu erhalten.
Anschließend wird das Lysat 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius inkubiert, um Disulfidbrücken in Proteinen chemisch zu reduzieren. Fügen Sie 0,5 molares Iodacetamid hinzu, um die Endkonzentration von etwa 75 Millimolar im Lysat zu erhalten, und inkubieren Sie das Gemisch 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Fügen Sie 0,5 molaren Dithiothreitol hinzu, das dem Anfangsvolumen entspricht, um die von der Alkylierungsreaktion verbleibenden Reaktanten zu löschen.
Fallen Sie Proteine in Aceton über Nacht aus, wie im Textprotokoll beschrieben, und rekonstituieren Sie sie in 0,5 molaren Ammoniumbicarbonat. Fügen Sie Trypsin für den Probenaufschluss hinzu und inkubieren Sie die Fläschchen bei 37 Grad Celsius. Um die Peptide mit CE zu trennen, rekonstituieren Sie das in ein bis zwei Mikrolitern des Probenlösungsmittels verdaute Protein.
Die gemischte Probe und die Zentrifusion bei 10.000 RCF zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius vortexen, um Zellreste zu pelletieren. Initialisieren Sie das CE-ESI-Gerät, indem Sie die CE-Kapillare mit dem BGE spülen. Geben Sie einen Mikroliter der Probe in das Probenfläschchen und injizieren Sie ein bis 10 Nanoliter der Probe durch hydrodynamische Injektion in die CE-Trennkapillare.
Übertragen Sie das Einlaufende der CE-Trennkapillare in die BGE. Beginnen Sie mit der elektrophoretischen Trennung, indem Sie die CE-Trennspannung von der Erdung aus allmählich erhöhen. Potentiale von 20 bis 28 Kilovolt mit einem Strom unter 10 Mikroampere gewährleisten eine stabile und reproduzierbare instrumentelle Leistung für die Analyse.
Um die Peptidprobe mit Nano LC zu trennen, wird sie in der mobilen Phase A erneut suspendiert.Die Konzentration und das Injektionsvolumen der Probe hängen vom verfügbaren LC-System und der Säule ab. Übertragen Sie die Probe in ein LC-Fläschchen. Laden Sie etwa 200 Nanogramm bis zwei Mikrogramm Peptidprobe in die C18-Analysesäule und trennen Sie die Peptide mit einer Flussrate von 300 Nanolitern pro Minute mittels Gradientenelution, wie im Textmanuskript beschrieben.
Überprüfen Sie mit einer Kamera den Flüssigkeitsfluss durch den Elektrosprühstrahler und inspizieren Sie den Aufbau visuell auf mögliche Lecks. Erfassen Sie Massenspektrometrieereignisse und sequenzieren Sie die Peptide wie im Textmanuskript beschrieben. Gentranslationale Unterschiede wurden zwischen D11-Zellen nachgewiesen, die mittels CE-ESI-HRMS aus verschiedenen Embryonen präpariert wurden.
Linienmarkierte präparierte Zellklone wurden mittels LC-HRMS analysiert. Die Signalwegsanalyse von Proteinen zeigte eine hochregulierte Proteintranslation und einen hochregulierten Energiestoffwechsel im Spemann-Organizer mit dem Neuroektoderm. Das Prodeum des Neuroektoderms war mit Proteinen angereichert, die mit dem nukleären Transport von Proteinfracht in der Zelle assoziiert sind, was wahrscheinlich auf nachgeschaltete Ereignisse nach der Signalübertragung hinweist.
Die Anreicherungsanalyse molekularer Funktionen deutete auf eine Hochregulation der Translationsinitiierung, RNA-Bindung und Bindung des Proteasomkomplexes hin, was auf eine Rolle für den dynamischen Proteinumsatz bei der Entwicklung des Spemann-Organizers hindeutet. Wählen Sie für dieses Protokoll nur stereotype Embryonen aus, um die Reproduzierbarkeit und die Interpretation der Ergebnisse zu verbessern. Präpariertes Gewebe sollte in eine Durchstechflasche überführt und sofort eingefroren werden, die so wenig Medienpuffer wie möglich enthält, um die Kontamination durch Puffersalze zu minimieren.
Dieser Ansatz hat es uns ermöglicht, die Proteindynamik in identifizierten Zellen und Zelllinien in lebenden Embryonen zu untersuchen. Die neuen Informationen, die wir über die räumlich-zeitliche Produktion wichtiger Proteine in sich entwickelnden Geweben gewonnen haben, haben es uns ermöglicht, gezielte Experimente zu entwerfen, um ihre biologische Funktion zu untersuchen.
