Cette méthode peut aider à améliorer la caractérisation à grande échelle et à haute résolution des isoformes protéiques et des modifications post-translationnelles des protéines dans les cellules. Le principal avantage de cette technique est que la spectrométrie de masse de la zone capillaire offre une séparation très efficace et une détection très sensible des protéines intactes. Pour pré-traiter le capillaire, séchez-le avec du gaz azoté à 10 psi pendant au moins 12 heures.
Ensuite, remplissez le capillaire d’un méthacrylate 3 propyle à 50 % volume par volume dans du méthanol à l’aide d’une pompe à seringues. Sceller les deux extrémités du capillaire avec du caoutchouc de silice. Après avoir couver à température ambiante pendant au moins 24 heures, continuer avec un revêtement linéaire en polyacrylamide sur la paroi intérieure du capillaire de séparation, tel que décrit dans le protocole de texte.
Brûler une partie du capillaire à l’aide d’une flamme douce pour enlever le revêtement extérieur en polyamide à environ quatre centimètres d’une extrémité du capillaire. Nettoyez délicatement la partie brûlée du capillaire en essuyant pour enlever complètement le revêtement en polyamide. Percer un petit trou à l’extrémité d’un tube de 200 microlitres autour de la même taille que le diamètre extérieur capillaire pour maintenir suffisamment le capillaire en place une fois qu’il est fileté à travers ce trou.
Enfiler l’extrémité du capillaire qui est proche de la partie brûlée à travers le trou jusqu’à ce que la partie brûlée soit dans le tube. Ensuite, ajoutez environ 150 microlitres de HF au tube de 200 microlitres de sorte que la solution HF soit à peu près à mi-hauteur de la partie brûlée sur le capillaire. Incuber le capillaire dans la solution HF à température ambiante pendant 90 à 100 minutes.
Préparer le mélange de protéines standard et l’échantillon d’E.coli tel que décrit dans le protocole textuel. Pour configurer l’électrophoresis de zone capillaire, ou système de RTC, chargez l’échantillon, l’électrolyte de fond, et le capillaire de séparation dans l’auto-échantillonneur de CZE. Sélectionnez la charge de l’échantillon dans la page de commande manuelle de l’échantillonneur automatique CZE.
Chargez le flacon d’électrolyte de fond dans le bac tampon de l’échantillonneur automatique, en notant sa position dans le plateau tampon. Ensuite, chargez le flacon d’échantillon dans le bac d’échantillon de l’échantillonneur automatique, en notant sa position dans le plateau de l’échantillon. Placez l’échantillonneur automatique à la position d’alignement à l’aide d’un contrôle manuel.
Maintenant, chargez le capillaire de séparation dans l’échantillonneur automatique CZE en utilisant l’extrémité non gravée du capillaire. Ajustez la hauteur de l’extrémité d’injection du capillaire si le volume de l’échantillon est inférieur à 50 microlitres. Passez l’échantillonneur automatique en veille à l’aide d’un contrôle manuel.
Tapez la position de l’échantillon dans le système et déplacez le capillaire vers l’échantillon. Poussez l’extrémité d’injection du capillaire plus bas pour atteindre le fond du flacon de l’échantillon. En continuant à utiliser le contrôle manuel, rincer le capillaire avec l’électrolyte de fond pendant 20 minutes en utilisant une pression de 20 psi.
Maintenant, montez une interface commerciale de flux de gaine pompée électrocinétiquement à l’avant du spectromètre de masse. Remplissez le réservoir tampon de gaine d’un tampon contenant 10 % de méthanol en volume et 0,2 % d’acide formique en volume dans l’eau de qualité LCMS. Rincer le T dans l’interface avec le tampon de gaine en appliquant la pression manuellement avec une seringue.
Enfiler l’extrémité extérieure d’un millimètre de diamètre d’un émetteur d’électrospray à travers un tube de manche et connecter l’émetteur avec un port du T via un raccord. Il suffit de rincer le T manuellement à nouveau avec une seringue pour remplir l’émetteur avec le tampon de gaine. Réglez la distance entre l’orifice de l’émetteur et l’entrée du spectromètre de masse à environ deux millimètres à l’aide de la caméra qui est venu avec l’interface.
Appliquez une tension de deux à 2,2 kilovolts sur le flacon tampon de gaine pour l’électrospray. Ensuite, ajustez la tension de pulvérisation pour atteindre une électrospray stable. Appliquer une basse pression à l’extrémité d’injection du capillaire au cours de ce processus pour s’assurer qu’il n’y a pas de bulles dans le capillaire.
Éteignez la tension de pulvérisation et enfilez doucement l’extrémité gravée du capillaire de séparation à travers le T dans l’émetteur jusqu’à ce qu’elle ne puisse pas être poussée plus loin. Après avoir arrêté la basse pression à l’extrémité d’injection du capillaire, rincer un peu l’émetteur avec le tampon de gaine. Encore une fois, appliquez deux à 2,2 kilovolts de tension de pulvérisation pour tester le jet.
Sélectionnez la nouvelle méthode sous le menu de dropdown de fichier sur l’écran principal de l’instrument. Là, sélectionnez l’entrée comme flacon d’échantillon de départ, flacon d’échantillon de fin, plateau comme échantillon, pression comme cinq psi, kilovolts comme zéro, et durée comme 95 secondes pour une injection d’échantillon. Ensuite, placez l’entrée comme flacon d’entrée, plateau comme tampon, pression comme psi zéro, kilovolts comme 30, et durée comme 4200 secondes pour la séparation de l’échantillon standard de mélange de protéine.
Pour la séparation de l’échantillon de protéome E.coli, réglez l’entrée comme flacon d’entrée, plateau comme tampon, pression comme psi zéro, kilovolts comme 20, et durée comme 6600 secondes. Enfin, sélectionnez l’entrée comme flacon d’entrée, plateau comme tampon, pression comme 10 psi, kilovolts comme 30, et la durée comme 600 secondes pour le rinçage capillaire. Maintenant, configurez les paramètres MS et MS/MS pour l’analyse des protéines intactes à l’aide d’un spectromètre quadruple masque piège à ion.
Pour régler les paramètres du fichier d’accord, activez le mode protéines intactes et utilisez une pression de piégeage de 0,2. Réglez la température capillaire de transfert d’ion à 320 degrés Celsius et le niveau RF de lentille S à 55. Pour effectuer l’expérience CZE MS/MS, démarrez la méthode d’acquisition de données sur l’ordinateur spectromètre de masse, d’abord en sélectionnant la séquence d’exécuter.
Ensuite, démarrez la séquence d’électrophoresis capillaire sur l’ordinateur auto-échantillonneur d’électrophoresis capillaire. Effectuez une recherche de base de données avec TopPIC dans la suite TopPIC et dans l’interface utilisateur graphique TopPIC. Cliquez sur le fichier de base de données et sélectionnez une base de données appropriée pour la recherche.
Cliquez sur le fichier spectre et sélectionnez le ms2 généré. msalign fichier généré comme l’entrée. Sélectionnez le fichier de fonctionnalités MS1 et choisissez le fichier de fonctionnalité généré.
Réglez la cystéine carbamidomethyl C57 comme modification fixe due au traitement d’iodoacetamide. Sélectionnez la fonction de base de données leurre et sous les paramètres de coupure, sélectionnez le taux de fausse découverte dans le menu dropdown à côté du niveau du spectre. Réglez le taux de fausse découverte à 0,01 au niveau du spectre.
Laissez la fonction génératrice non sélectionné et réglez la tolérance aux erreurs à 15 parties par million. Réglez le taux de fausse découverte à 0,05 au niveau protéoforme. Selon des paramètres avancés, sélectionnez deux pour le nombre maximum de décalages de masse dans le menu dropdown.
Réglez le déplacement de masse maximum des modifications inconnues à 500 daltons. Laissez tous les autres paramètres à leurs valeurs par défaut et cliquez sur le bouton de démarrage en bas à droite de l’interface utilisateur graphique. L’électrophétogramme représentatif du mélange protéique standard est indiqué.
Le mélange de protéines standard est généralement exécuté au moins en double pour évaluer l’efficacité de séparation et la reproductibilité du système. L’efficacité de séparation peut être évaluée avec le nombre de plaques théoriques de certaines protéines. La reproductibilité peut être évaluée par les écarts types relatifs de l’intensité des protéines et du temps de migration.
La plate-forme CZE MS/MS peut être utilisée pour la caractérisation à grande échelle des protéoformes dans divers protéomes complexes, identifiant plus de 500 protéoformes et 190 protéines d’un protéome E.coli en une seule course avec une grande confiance. Ici, un zoom en vue de l’électrophéogramme peut être utilisé pour évaluer la fenêtre de séparation du système. La très faible valeur E et spectral FDR suggère la haute confiance de l’ID.The protéoforme id.The nombre élevé d’ions fragmentés assortis indique en outre la confiance élevée de l’ID.While essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’enfiler le capillaire de séparation gravé dans l’émetteur d’électrospray lentement et doucement.
L’étiquetage isotopique stable ou les méthodes sans étiquette peuvent être incorporés dans la procédure de SEp de RTC pour déterminer comment l’abondance protéoforme change dans les cellules dans diverses conditions. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la protéomique descendante pour explorer les rôles des protéoformes dans la régulation de divers processus biologiques dans les cellules. N’oubliez pas que le travail avec de l’acide fluorhydrique peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’équipement de protection individuelle approprié et la prise en place de procédures d’urgence doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
