Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Gerüste aus nativem Gewebe zu erstellen, die für die Knorpelregeneration verwendet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Komponenten des einheimischen Knorpels in den Gerüsten konserviert werden, die die Knorpelbildung und -regeneration in vitro und in vivo fördern können. Obwohl diese Methode Knorpel aus Pferde-Stifle-Gelenke verwendet, Knorpel von allen anderen Gelenken kann auch verwendet werden.
Um zu beginnen, erhalten Sie ein intaktes kadaverisches Gelenk für Knorpelisolierung und entfernen Sie die Haut überschüssiges Fett und Muskelgewebe, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Als Nächstes definieren Sie die Stelle, an der sich das Gelenk artikuliert, indem Sie eine Verlängerungsbiegung des Gelenks durchführen. Machen Sie einen horizontalen Schnitt, um die Gelenkhöhle zu erreichen.
Als nächstes machen Sie einen vertikalen Schnitt, um den Gelenkbereich zu öffnen. Die Gelenkhöhle wird mit Synovialflüssigkeit gefüllt, die wahrscheinlich aus der Höhle tropft, wenn sie einen korrekten Schnitt durchführt. Öffnen Sie das Gelenk weiterhin vollständig, indem Sie übermäßiges Fett, Muskeln und Sehnen entfernen und die Sehnen durchschneiden, die das Gelenk zusammenhalten.
Prüfen Sie den Knorpel sorgfältig auf makroskopische Schäden. Wenn der Gelenkknorpel kein glänzenderglattes Aussehen hat oder Wenn Beweise, Blasenbildung, Spalten oder Defekte vorhanden sind, entsorgen Sie den Knorpel und fangen Sie wieder an. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um den Knorpel aus dem Knochen zu entfernen.
Schneiden Sie den ganzen Weg bis zum subchondralen Knochen, um den tiefen Zonenknorpel zu entfernen. Sammeln Sie die entfernten Knorpelscheiben in 50 Milliliter-Rohren mit zuvor vorbereiteter Knorpelwaschlösung. Während der Verarbeitung, regelmäßig tropfen Knorpel Waschlösung auf den Knorpel, um zu verhindern, dass der Knorpel austrocknen.
Nachdem Sie den Knorpel aus allen Interessengebieten gesammelt haben, die Knorpelscheiben in flüssigem Stickstoff für fünf Minuten einfrieren. Dann die Knorpelscheiben in 50-Milliliter-Rohre geben und die gefrorenen Scheiben sofort in einen Gefriertrockner geben. Lyophilisieren Sie die Knorpelscheiben 24 Stunden lang mit dem Gefriertrockner.
Nach Fertigstellung die gefriergetrockneten Knorpelscheiben an einem trockenen Ort bei Raumtemperatur aufbewahren. Für die manuelle Verarbeitung einen Mörtel vorkühlen und mit flüssigem Stickstoff bewerfen, dann die lyophilisierten Knorpelscheiben in den Mörtel legen und unterTauchen und flüssigen Stickstoff. Die Proben ca. 45 Minuten direkt von Hand mahlen, bis sie ausreichend pulverisiert sind.
Alternativ können Sie die Proben automatisch mit einer Fräsmaschine mahlen, indem Sie zunächst den Schleifraum der Fräsmaschine durch Zugabe von flüssigem Stickstoff vorkühlen. Dann fügen Sie die lyophilisierten Knorpelscheiben und fräsen Sie die Probe mit ihrer voreingestellten Geschwindigkeit für ein paar Sekunden bis zu einer Minute. Stellen Sie sicher, dass alle Partikel geschliffen sind und keine Partikel im Boden des Schleifraums verbleiben.
Schließlich folgen Sie zusammen mit der Dezellularisierungstechnik, die im begleitenden Textprotokoll beschrieben ist, bevor Sie Gerüste bilden. Die Knorpelpartikel mit einem kleinen Etikett in eine zylindrische Kunststoffform übertragen. Drücken Sie alle Luftblasen heraus, um Hohlräume im Gerüst zu vermeiden und die Form vollständig zu füllen.
Um Hohlräume im Gerüst zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass Luftblasen ausgepresst werden, während die Form mit Knorpelpartikeln gefüllt wird. Nach der Bildung die Form für 10 Minuten bei minus 20 Grad Celsius einfrieren. Dann lyophilisieren Sie die Knorpelgerüste innerhalb der Form für 24 Stunden in einem Gefriertrockner.
Nach der Lyophilisierung das Gerüst vorsichtig aus der Form entfernen. Stellen Sie das Gerüst unter eine 365 Nanometer Wellenlänge UV-Licht und kreuzen Sie es über Nacht. Bilden Sie Gerüstscheiben, indem Sie sterilisierte Gerüste in drei Millimeter dicke Scheiben schneiden.
Dann die Gerüste in separate Brunnen einer sechs Brunnenplatte übertragen. Fügen Sie einen Milliliter Chondrozyten-Erweiterungsmedium auf das Gerüst und lassen Sie sie für 30 Minuten rehydrieren. Während die Gerüste rehydrieren, bereiten Sie die Zellen und Pipette 50 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension auf dem vorgetränkten Gerüst vor.
Dann das Gerüst für eine Stunde bei 37 Grad Celsius bebrüten. Wenn Sie Chondrozyten verwenden, stellen Sie sicher, dass sie nicht über den ersten Durchgang hinaus erweitert wurden, um die Anzahl der differenzierten Zellen zu minimieren. Nach einer Stunde den Teller zur Kulturhaube zurückgeben und das Gerüst vorsichtig umdrehen.
Die restlichen 50 Mikroliter Zellsuspension auf dem Gerüst anpfeifen und eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius bebrüten. Nach der Inkubation drei Milliliter Medium mit Gerüsten in die Brunnen geben. Vermeiden Sie das Pipettieren des Mediums direkt auf das Gerüst und behandeln Sie die Kulturplatte sanft, um eine Ablösung der Zellen zu vermeiden.
Bringen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius an den Brutkasten und die Kulturzelle abgetretene Gerüste zurück. Eine Kombination aus historlogischer Färbung und DNA-Quantifizierung wurde verwendet, um zu zeigen, dass die in diesem Artikel vorgestellten Methoden zu einer ausreichenden Knorpelgerüstdezellularisierung führen. Die resultierenden Gerüste enthielten keine Zellen zusammen mit nicht nachweisbaren DNA-Werten.
Sie haben auch keine Glykosaminoglykane und sind reich an Kollagen II. Hier wird die Neomatrixbildung auf Gerüsten beobachtet, die mit mesenchymalen Stammzellen abgetreten wurden, die vier Wochen lang kultiviert wurden. Die Bildung von Glykosaminoglykanen ist nach vier Wochen reichlich vorhanden. Nach dem Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig zu untersuchen, ob die Dezellularisierung erfolgreich war, bevor Sie sie in einer Anwendung verwenden.
Nach diesem Verfahren können zusätzliche biochemische Analysen wie Western Blot Analyzer durchgeführt werden, um spezifische Fragen über das Vorhandensein anderer Komponenten wie Wachstumsfaktoren zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Gewebetechnik, um Strategien für die Knorpelregeneration mit dezellularisiertem Gewebe aus allogenen und syngenischen Quellen zu erforschen. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Labormantels und Handschuhe sollten immer getroffen werden.
