Diese Methode sollte für Forscher interessant sein, die versuchen, RNA-Proteinkomplexe zu isolieren und ihre Zusammensetzung durch Massenspektrometrie zu identifizieren. Wir glauben, dass unser Protokoll besonders nützlich sein wird, um Komplexe zu reinigen, die in Zellen in begrenzten Mengen existieren und dazu neigen, sich während langer mehrstufiger Reinigungsverfahren zu dissoziieren. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass sie nur einen einzigen Reinigungsschritt umfasst und mit RNA-Bindungsstellen beliebiger Länge und Sequenz verwendet werden könnte.
Einige der Schritte werden Xiao-cui Yang demonstrieren, der ein leitender Forschungstechniker in unserer Gruppe ist. Für Bindungsstellen, die deutlich länger als 65 Nukleotide sind, erhalten Sie T7-generierte RNA und ein Adapter-PCB-Oligonukleotid, wie im Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie 20 Picomole der RNA mit 100 Picomolen des Adapters Oligonukleotid in einer 1,5 Milliliter Tube mit 100 Mikroliter Bindungspuffer.
Legen Sie das Rohr in kochendes Wasser und lassen Sie es für 5 Minuten inkubieren. Dann lassen Sie das Wasser auf Raumtemperatur abkühlen. Erste Ergänzung 1 Milliliter Maus Kernextrakt mit 80 Millimolar EDTA bei pH 8 zu einer Endkonzentration von 10 Millimolar.
Fügen Sie dann zwischen 5 und 10 Picomole des RNA-Substrats hinzu, das mit dem PCB-Moiety markiert wurde. Auf Eis für 5 Minuten inkubieren, um die Probe gelegentlich zu mischen. Als nächstes verwenden Sie eine vorgekühlte Mikrozentrifuge bei 4 Grad Celsius, um die Mischung bei 10.000 mal g für 10 Minuten zentrifugieren, um mögliche Ausscheidungen zu entfernen.
Sammeln Sie den Überstand vorsichtig in eine neue Röhre auf Eis, während Sie darauf achten, das Pellet nicht zu übertragen. Übertragen Sie ca. 100 Mikroliter Streptavidin Agarose Perlensuspension in ein 1,5 Milliliter Rohr. Fügen Sie etwa 1 Milliliter Bindungspuffer hinzu, um mit dem Waschen der Perlen zu beginnen.
Zentrifugieren Sie das Rohr 25 mal g für 2 bis 3 Minuten und aspirieren Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Wasch- und Zentrifugationsprozess 2 bis 3 Mal, um die Perlen mit dem Bindungspuffer zu ausdemieren. Laden Sie den zuvor gesammelten Überstand, der den zusammengebauten Komplex über die ausgegleichgewichteten Perlen enthält.
Drehen Sie das Rohr mit einem Rohrrotator 1 Stunde bei 4 Grad Celsius, um die RNA und gebundene Komplexe auf die Perlen zu immobilisieren. Als nächstes drehen Sie das Rohr bei 25 mal g für 2 bis 3 Minuten, um die Perlen an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Aspirieren Sie den Überstand.
Und spülen Sie die Perlen zweimal mit Bindungspuffer, mit dem zuvor beschriebenen Waschprozess. Nach dem Entfernen des Überstandes der zweiten Wäsche 1 Milliliter Bindungspuffer hinzufügen und die Probe 1 Stunde bei 4 Grad Celsius drehen. Drehen Sie die Probe 25 mal g für 2 bis 3 Minuten herunter.
Als nächstes 1 Milliliter Bindungspuffer hinzufügen und die Suspension in ein neues Rohr übertragen. Drehen Sie die Probe bei 4 Grad Celsius für bis zu 1 Stunde. Zentrifugieren Sie die immobilisierten Komplexe 25 Mal g für 2 bis 3 Minuten.
Dann aspirieren Überstand, und fügen Sie 200 Mikroliter Bindungspuffer. Übertragen Sie die Perlen in ein 500-Mikroliter-Rohr. Schalten Sie eine hochintensive UV-Lampe ein, die UV-Licht mit 365 Nanometern aussendet und sie die volle Brillanz erreichen lässt.
Füllen Sie den Boden einer Petrischale mit dicht gepacktem Eis, das sie über den Deckel der Schale stapelt. Kurz wirbeln die Röhre mit den immobilisierten Komplexen. Legen Sie es dann horizontal auf das Eis und bedecken Sie es mit der vorgewärmten Lampe, um sicherzustellen, dass die Probe 2 bis 3 Zentimeter von der Oberfläche der Glühbirne entfernt ist.
Bestrahlen Sie die Probe für insgesamt 30 Minuten, während häufig invertieren und Wirbel nustieren das Rohr, um eine gleichmäßige Exposition zu gewährleisten und eine Überhitzung zu verhindern. Danach drehen Sie die Perlen bei 25 mal g für 2 bis 3 Minuten und sammeln Sie den Überstand. Zentrifugieren Sie diesen Überstand noch einmal unter den gleichen Bedingungen.
Sammeln Sie den resultierenden Überstand und stellen Sie sicher, dass Eine kleine Menge an der Unterseite des Rohres zu verlassen, um zu vermeiden, dass restliche Perlen übertragen. Mit SDS-PAGE Elektrophorese trennen Sie einen Bruchteil des UV-eluierten Überstandes und den entsprechenden Anteil vom Material, das nach uv-elution auf den Perlen verbleibt. Als nächstes verwenden Sie ein handelsübliches Silber Färbeset, um das Gel zu färben.
Bewerten Sie die Effizienz der UV-Elution, indem Sie die Intensitäten der Proteine im UV-eluierten Überstand mit denen vergleichen, die nach der UV-Bestrahlung auf den Perlen verbleiben. Verbrauchen Sie die Proteinbänder von Interesse und bestimmen Sie ihre Identität durch Massenspektrometrie. Danach analysieren Sie direkt einen Bruchteil des UV-eluierten Überstandes durch Massenspektrometrie, um das gesamte Proteom des gereinigten Materials unvoreingenommen zu bestimmen.
In dieser Studie wird Stammschleifen-RNA mit photoscleavablem Biotin mit 1 Milliliter eines zytoplasmatischen S100-Extrakts aus Myelomzellen von Mäusen inkubiert. Und die Wirkung und Effizienz der UV-Elution wird durch Silberfärbung analysiert. Eine Reihe von Proteinen werden auf den Streptavidin-Perlen vor der UV-Elution nachgewiesen.
Die Bestrahlung mit langwelliger UV-Strahlung gibt nur einige dieser Proteine in den Überstand frei und hinterlässt einen unspezifischen Hintergrund auf den Perlen. Dies unterstreicht die Bedeutung des UV-Elutionsschritts. Die Massenspektrometrie identifiziert die wichtigsten UV-eluierten Proteine als 3'hExo und SLBP, wobei SLBP sowohl durch das Vollwertprotein als auch durch eine Reihe von kürzeren Abbauprodukten repräsentiert wird.
Kleinere Mengen anderer Proteine, die als verschiedene RNA-bindende Proteine identifiziert wurden, werden durch die UV-Bestrahlung auch selektiv in lösungsweise freigesetzt. Die UV-Elution von immobilisiertem Drosophila-Histon-Prämnonmiten-Pre-mRNA, getaggt mit photo-cleavablem Biotin, das mit einem Kernextrakt inkubiert wurde, führte zu einer selektiven Freisetzung von nur einer kleinen Anzahl von Proteinen in den Überstand mit einem intensiven Hintergrund von unspezifischen Proteinen, die auf den Perlen verbleiben. Die Massenspektrometrie identifiziert diese Proteine als Bestandteile des U7 snRNP.
Sie werden nicht in Gegenwart von Verarbeitungskonkurrenten nachgewiesen, die die Bindung von U7 snRNP an Histone pre-mRNA blockieren. Es ist wichtig, hochintensive UV-Lampe zu verwenden und sie in einem engen Abstand zur bestrahlten Probe zu platzieren, während sie gleichzeitig darauf achtet, dass sie nicht überhitzt. Die UV-Elutionsmethode liefert native RNA-Proteinkomplexe, denen größere Verunreinigungen fehlen und die sich direkt für zusätzliche Reinigungsschritte und funktionelle Assays eignen.
Vermeiden Sie Augen- und Hautexposition während der UV-Bestrahlung.
